高美靜, 盧莉娜, 仲建鋒, 盧 飛,黃亞威, 鄭尊濤, 張志勇*,

(1.省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地——江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210014；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營(yíng)養(yǎng)研究所，南京 210014；3.南京中醫(yī)藥大學(xué) 附屬醫(yī)院，南京 210004；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所，北京 100125)

食用百合為百合科百合屬多年生球根草本植物，因其藥食同源的特性而廣受消費(fèi)者的青睞[1]。代森鋅屬二硫代氨基甲酸鹽類(lèi)農(nóng)藥，是一種具有保護(hù)作用的廣譜殺菌劑，除被廣泛應(yīng)用于蔬菜、水果等農(nóng)作物上的病害防治外[2-4]，代森鋅對(duì)包括花葉病、鱗莖腐爛病、斑點(diǎn)病、葉枯病在內(nèi)的百合病害也具有很好的防治效果。然而隨著代森鋅的廣泛使用，其對(duì)生態(tài)環(huán)境造成的破壞，以及通過(guò)食物鏈對(duì)人和動(dòng)物健康構(gòu)成的危害等問(wèn)題也日益凸顯，已有研究表明，代森鋅在植物、土壤及動(dòng)物體內(nèi)的殘留可能存在致癌、誘導(dǎo)有機(jī)體突變或者致畸的風(fēng)險(xiǎn)[5-7]，因此，加強(qiáng)代森鋅使用后在農(nóng)作物上的殘留及消解研究對(duì)于保證農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全至關(guān)重要。

目前，有關(guān)代森鋅在作物中殘留消解的研究主要涉及蘋(píng)果[8]、小白菜[9]、柑橘[10]、蘆筍[11]、胡蘿卜和豌豆[12]等，發(fā)現(xiàn)代森鋅在不同作物中殘留量及消解動(dòng)態(tài)差異較大。代森鋅在蘋(píng)果上的消解半衰期為20.4～36.5 d[8]，在柑橘中為1.8～2.5 d[10]，在蘆筍中為2.3～4.5 d[11]，在胡蘿卜植株和豌豆莢中分別為4.1～8.5 d 和3.9～4.5 d[12]。而關(guān)于代森鋅在百合中殘留和消解的情況則尚未見(jiàn)報(bào)道。

針對(duì)代森鋅殘留的檢測(cè)方法有多種，主要包括分光光度法[13-15]、頂空氣相色譜法[16-17]、甲基衍生化高效液相色譜法[11]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[18]、原子吸收法[19]、毛細(xì)管電泳法[20]等，此外已有針對(duì)其主要代謝物的分析方法[21]。代森鋅在環(huán)境中容易降解為乙撐硫脲 (ETU)，ETU 具有致畸、致癌及致突變作用，是導(dǎo)致代森鋅存在安全隱患的重要因素[22]。目前有關(guān)代森鋅在作物及農(nóng)產(chǎn)品中的殘留分析大多采用頂空氣相色譜法，即根據(jù)二硫化碳(CS2)的檢測(cè)量計(jì)算代森鋅的殘留量[16-17]。1933 年，農(nóng)藥殘留聯(lián)合專(zhuān)家會(huì)議 (JMPR) 規(guī)定了乙撐雙二硫代氨基甲酸鹽類(lèi) (EBDCs) 農(nóng)藥 (代森鋅、代森錳、代森聯(lián)及代森錳鋅) 的每日允許攝入量 (ADI) 為0.03mg/kg，其代謝物ETU 的ADI 值為0.004 mg/kg，并定義EBDCs 農(nóng)藥母體及ETU 的殘留量以毒性對(duì)等的原則，按照ADI 值的比例 (7.5) 用于膳食評(píng)估[23]。

本研究建立了氣相色譜 (GC) 和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 (HPLC-MS/MS) 法，分別用于檢測(cè)鮮百合和干百合樣品中的CS2和ETU，通過(guò)公式換算，最終得到不同地區(qū)、不同百合樣品中代森鋅的殘留及消解動(dòng)態(tài)，同時(shí)對(duì)代森鋅在百合中的膳食風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了初步分析，以期為代森鋅在百合種植過(guò)程中的安全使用提供科學(xué)依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與試驗(yàn)材料

1.1.1 主要儀器 Agilent 6890N 氣相色譜儀 (配FPD 檢測(cè)器) 及Agilent 1290-6470 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 (美國(guó)安捷倫公司)；QL-901 渦流混合器(江蘇海門(mén)市麒麟醫(yī)用儀器廠)；Talboys 數(shù)顯型多管式漩渦混合器 (上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；AL-204 電子天平 (0.1 mg，上海梅特勒公司)；JJ200 電子天平 (0.01g，常熟市雙杰測(cè)試儀器廠) 等。

1.1.2 試驗(yàn)材料 代森鋅 (zineb) 標(biāo)準(zhǔn)品 (純度99.7%) 及ETU 標(biāo)準(zhǔn)品 (純度99.5%)，由德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司提供；65% 代森鋅可濕性粉劑(WP)，山東利邦農(nóng)化有限公司；CS2標(biāo)準(zhǔn)品，純度99.8%，由TMRM 公司提供?？箟难釣榉治黾儯瑖?guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；正己烷和乙腈為色譜純，氯化亞錫及氯化鈉為分析純。QUECHERS 凈化管 (2 mL，含50 mg PSA 和150 mg 無(wú)水MgSO4)，美國(guó)安捷倫公司。

各地種植百合品種：江蘇省宜興市周鐵鎮(zhèn)為瀆邊洋溪百合；湖南省郴州市龍市鄉(xiāng)及湖北省恩施市三岔鄉(xiāng)為卷丹百合；四川省綿陽(yáng)市八角鎮(zhèn)為亞洲百合。

1.2 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

按農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則[24]要求設(shè)試驗(yàn)小區(qū)，小區(qū)面積30 m2，重復(fù)3 次，隨機(jī)排列，小區(qū)間設(shè)保護(hù)帶；另設(shè)噴清水的空白對(duì)照小區(qū)。65%代森鋅WP 在百合上防治霜霉病的推薦使用劑量為有效成分1950～3000 g/hm2(制劑量3000～4616 g/hm2)；于生長(zhǎng)中期開(kāi)始噴霧施藥，共施藥2～3 次，推薦施藥間隔期為7 d。

消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)：于2018 年分別在江蘇省宜興市周鐵鎮(zhèn)和湖南省郴州市龍市鄉(xiāng)兩地進(jìn)行，按有效成分4500 g/hm2劑量于百合生長(zhǎng)中期時(shí)施藥1 次，分別于施藥后2 h 和1、3、5、7、10、14、21、28 d 采樣。每小區(qū)隨機(jī)取10 個(gè)以上采樣點(diǎn)，采集生長(zhǎng)正常、無(wú)病害的地上部分百合植株至少1 kg，切成1 cm 左右小段，充分混勻后用四分法縮分。分取150 g 樣品2 份，于 -20 °C 貯存，待用。

最終殘留試驗(yàn)：于2018 年在江蘇省宜興市周鐵鎮(zhèn)、湖南省郴州市龍市鄉(xiāng)、湖北省恩施市三岔鄉(xiāng)和四川省綿陽(yáng)市八角鎮(zhèn)4 地進(jìn)行。分別設(shè)2 個(gè)施藥劑量：低劑量按有效成分3000 g/hm2，高劑量按4500 g/hm2，每種劑量分別施藥3 次和4 次，采樣時(shí)間距末次施藥分別間隔7、14 和21 d。將所采集的樣品分為2 組，一組用于制備百合鮮樣品，另一組用于制備百合干樣品。百合鮮樣制備：將采集的百合樣品切成2 cm 左右塊狀，充分混勻后，四分法縮分，分取250 g 樣品2 份，于 -20 °C 貯存；百合干樣制備：將樣品的鱗片掰下，烘干至百合干片 (含有不大于15%的水分且易粉碎) 即可，四分法縮分，分取150 g 樣品2 份，于 -20 °C 貯存。

1.3 樣品的提取和凈化

1.3.1 用于GC 法測(cè)定CS2含量的樣品 稱(chēng)取5.0 g樣品于50 mL 頂空瓶中，加5 mL 水、0.12 g 抗壞血酸、30 mL 氯化亞錫/5 mol 鹽酸溶液和10 mL正己烷，迅速密封，于85 °C 水浴中反應(yīng)2 h，每隔15 min 振搖1 次。取出冷卻至室溫，吸取上層有機(jī)相，待測(cè)。

1.3.2 用于HPLC-MS/MS 法測(cè)定ETU 含量的樣品 稱(chēng)取5.0 g 樣品于50 mL 離心管中，加入2.0 g氯化納和25 mL 乙腈，置于數(shù)顯型多管式漩渦混合器振蕩20 min，經(jīng)5000 r/min 離心5 min。取1 mL 上清液轉(zhuǎn)移至QUECHERS 凈化管中，漩渦振蕩，于5000 r/min 離心3 min，取上清液過(guò)0.2 μm 濾膜，待測(cè)。

1.4 儀器檢測(cè)條件

1.4.1 GC 法測(cè)定CS2含量 GS-GASPRO色譜柱 (30mm × 0.32mm)；進(jìn)樣口溫度150 °C；檢測(cè)器溫度300 °C；進(jìn)樣量1 μL。程序升溫：60 °C保持1 min，10 °C/min 升至100 °C 保持6 min。載氣：高純氮?dú)猓兌?9.99%，色譜柱流速1 mL/min。檢測(cè)器空氣流速為60 mL/min；檢測(cè)器氫氣流速為100 mL/min。

1.4.2 HPLC-MS/MS 法測(cè)定ETU 含量 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱 (2.1 mm × 50 mm，1.8 μm)；柱溫35 °C；流動(dòng)相：V(乙腈) :V(0.1%甲酸水溶液) = 80 : 20；進(jìn)樣量5 μL。電噴霧離子源ESI 和正離子掃描模式多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；毛細(xì)管電壓3500 V；加熱模塊400 °C；干燥氣壓力103 kPa；干燥器溫度300 °C；霧化氣壓力448 kPa；輔助氣壓力483 kPa。優(yōu)化的離子對(duì)、碰撞能量等信息詳見(jiàn)表1。

表1 ETU 的相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometry parameters of the ETU

1.5 膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

依據(jù)毒性對(duì)等原則，代森鋅及其代謝物ETU的殘留量計(jì)算公式見(jiàn)式 (1)。

式中：C表示代森鋅的殘留量，mg/kg；C1表示CS2的殘留量，mg/kg；C2表示ETU 的殘留量，mg/kg；1.81 為代森鋅的相對(duì)分子質(zhì)量/CS2的相對(duì)分子質(zhì)量；7.5 為代森鋅的ADI 值/ETU 的ADI 值。

據(jù)報(bào)道，我國(guó)食用百合種植面積約為2 萬(wàn)公頃[25]，平均產(chǎn)量約1.2×104kg/hm2[26]，我國(guó)百合的進(jìn)出口產(chǎn)品以觀賞百合為主，因此食用百合主要用于國(guó)內(nèi)消費(fèi)。按照中國(guó)人口13.9538 億、消費(fèi)天數(shù)365 d 計(jì)，折算出中國(guó)居民日均百合膳食消費(fèi)量約為0.0005 kg，其中包括干百合和鮮百合，但由于干百合和鮮百合的單獨(dú)消費(fèi)量未知，按風(fēng)險(xiǎn)最大化原則，均按照日均消費(fèi)量0.0005 kg 計(jì)。按照公式 (2) 計(jì)算鮮 (干) 百合中代森鋅殘留的慢性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)占ADI 的比值 (%ADI)[27]。

式中：STMR 為規(guī)范試驗(yàn)殘留中值 (mg/kg)，代森鋅的STMR 值由百合中CS2和ETU 的殘留中值，按照公式 (1) 折算得到；bw 為體重，按63 kg 計(jì)[27]。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

將CS2標(biāo)準(zhǔn)品用正己烷稀釋配制成0.01、0.02、0.05、0.1、0.2 及0.5 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在所確定的GC 條件下進(jìn)行測(cè)定。以CS2標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度與峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程為y= 8515.2x-182.86，決定系數(shù)R2= 0.9959。

將ETU 標(biāo)準(zhǔn)品用乙腈稀釋配制成0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2 及0.5 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在所確定的HPLC-MS/MS 條件下進(jìn)行測(cè)定，以ETU 標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度與監(jiān)測(cè)離子峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程為y= 16 251.1x+11.8409，R2= 0.9988。

2.2 方法的正確度及精密度

在空白干百合、鮮百合和百合植株中分別添加0.02、0.1 和0.5 mg/kg 3 個(gè)水平的CS2和ETU，采用所確定的方法測(cè)定回收率，計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)。結(jié)果 (表2) 表明：CS2和ETU 在干百合、鮮百合及百合植株中的回收率范圍和RSD 均滿(mǎn)足殘留分析要求[28]。CS2和ETU在百合樣品中的定量限均為0.02 mg/kg。

表2 二硫化碳和乙撐硫脲在食用百合中的添加回收率和變異系數(shù)Table 2 The recoveries and coefficients of variation for CS2 and ETU in edible lily

2.3 消解動(dòng)態(tài)特征

結(jié)果 (圖1) 顯示：施藥后2 h，代森鋅在百合植株中的原始沉積量在2 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)之間稍有差異，在江蘇試驗(yàn)點(diǎn)為0.16 mg/kg，在湖南試驗(yàn)點(diǎn)為0.084 mg/kg，推測(cè)這可能是由于兩地天氣差異或不同人員操作時(shí)設(shè)置的噴霧參數(shù)差異等因素所致。7 d 之后，兩地百合植株中代森鋅的消解率均大于70%，且消解動(dòng)態(tài)符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程。代森鋅在百合植株中的消解半衰期江蘇試驗(yàn)點(diǎn)為5.9 d，湖南試驗(yàn)點(diǎn)為3.8 d，消解均較快。

圖1 代森鋅在江蘇 (A) 和湖南 (B) 兩地百合植株中的消解動(dòng)態(tài)曲線Fig.1 Dissipation curves of zineb in plant of lily in Jiangsu (A) and Hunan (B)

2.4 最終殘留量

針對(duì)鮮百合，以CS2計(jì)，代森鋅在江蘇、湖南、湖北及四川試驗(yàn)點(diǎn)的最高殘留量 (HR) 分別為0.110、0.150、0.260 和0.140 mg/kg (表3)，均低于我國(guó)目前制定的鮮百合上代森鋅的最大允許殘留限量 (MRL) 0.5 mg/kg (以CS2計(jì))，表明按照上述方式規(guī)范施藥，安全間隔期設(shè)定為7 d 時(shí)，收獲的鮮百合是安全的。同樣，針對(duì)干百合，以CS2計(jì)，代森鋅在江蘇、湖南、湖北及四川試驗(yàn)點(diǎn)的HR 值分別為1.290、0.550、0.260 和0.230 mg/kg(表4)，也低于我國(guó)目前制定的干百合中代森鋅的MRL 值 2.0 mg/kg (以CS2計(jì))，表明按照上述方式規(guī)范施藥，安全間隔期設(shè)定為7 d，所收獲的干百合也符合國(guó)家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

表3 代森鋅在鮮百合樣品中的最終殘留量 (以CS2 計(jì))Table 3 Final residues of zineb in fresh lily calculated by CS2

表4 代森鋅在干百合樣品中的最終殘留量 (以CS2 計(jì))Table 4 Final residues of zineb in dried lily calculated by CS2

按上述方式施藥后，ETU 的最終殘留檢測(cè)結(jié)果 (表5) 顯示：江蘇和湖北鮮百合樣品中ETU 的HR 值分別為0.190 和0.220 mg/kg，在湖南和四川試驗(yàn)點(diǎn)鮮百合中則均未檢出。此外，ETU 在上述4 個(gè)地區(qū)的干百合樣品中均為未檢出 (＜0.02 mg/kg)。

表5 乙撐硫脲在鮮百合樣品中的最終殘留量Table 5 Final residues of ETU in fresh lily

2.5 膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)

按照風(fēng)險(xiǎn)最大化原則，本研究將規(guī)范殘留試驗(yàn)藥后7 d 鮮百合和干百合樣品中代森鋅 (以CS2計(jì)) 和ETU 的STMR 值折算成代森鋅的STMR值 (鮮百合為0.52 mg/kg，干百合為 ＜ 0.53 mg/kg)，

進(jìn)行了初步的膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。結(jié)果顯示，代森鋅在鮮百合和干百合中的慢性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)占ADI的比值分別為0.014%和 ＜ 0.014%，對(duì)總體膳食風(fēng)險(xiǎn)的貢獻(xiàn)較小。

3 結(jié)論與討論

本研究分別采用GC 和HPLC-MS/MS 方法，測(cè)定了不同區(qū)域不同品種百合樣品中代森鋅的消解動(dòng)態(tài)及最終殘留，方法簡(jiǎn)單，正確度高，重現(xiàn)性好，添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均能滿(mǎn)足農(nóng)藥殘留檢測(cè)要求。田間試驗(yàn)結(jié)果顯示，代森鋅在江蘇和湖南兩地百合植株中的半衰期分別為5.9 d 和3.8 d，表明其屬于易消解性農(nóng)藥。

以最高推薦劑量 (有效成分3000 g/hm2) 及1.5 倍劑量 (4500 g/hm2) 在江蘇、湖南、湖北和四川4 地的百合上分別連續(xù)噴施65% 代森鋅WP 3 次和4 次，結(jié)果顯示，代森鋅在百合中的殘留量隨采樣間隔天數(shù)的增加而減少。以CS2計(jì)，江蘇、湖南、湖北和四川4 地收獲的鮮百合中代森鋅的HR 值為0.260 mg/kg，干百合中為1.290 mg/kg，均低于我國(guó)制定的鮮百合 (0.5 mg/kg) 和干百合(2.0 mg/kg) 中代森鋅 (以CS2計(jì)) 的MRL 值，表明在使用代森鋅防治百合上的病害時(shí)，按照推薦劑量規(guī)范使用，所收獲的百合符合國(guó)家農(nóng)藥殘留相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

本研究中在4 個(gè)試驗(yàn)地區(qū)的干百合樣品中均未檢測(cè)到ETU 殘留，但部分鮮百合樣品中有檢出。對(duì)百合中代森鋅及其代謝物ETU 殘留的膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了初步分析，結(jié)果顯示，其慢性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)占ADI 的比值在鮮百合和干百合中分別為0.014%和 ＜ 0.014%，總體膳食風(fēng)險(xiǎn)貢獻(xiàn)較小，表明按照推薦劑量規(guī)范使用，代森鋅在百合中的殘留量一般不會(huì)對(duì)我國(guó)人群的健康產(chǎn)生不可接受的影響。

目前在百合上登記使用的殺菌劑產(chǎn)品較少，盡管代森鋅尚未在百合上登記，但由于其廣譜的殺菌活性，導(dǎo)致農(nóng)戶(hù)容易超范圍在百合病害防治中使用。本研究結(jié)果可為代森鋅在百合上的登記使用提供參考。