楊怡妍, 鄭柯斌, 陳 賽, 陳 杰*,

(1.浙江農(nóng)林大學(xué) 浙江省綠色農(nóng)藥 2011 協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江 臨安 311300；2.浙江省余姚市丈亭鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村辦公室，浙江 余姚 315402)

木霉菌 (Trichoderma) 是一種在世界上分布廣泛的真菌。據(jù)報(bào)道，木霉菌不僅可以促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，還可以誘導(dǎo)植物對(duì)外界環(huán)境脅迫產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，是一種高效的拮抗促生菌，具有廣闊的應(yīng)用前景[1-5]。我國(guó)耕地土壤鹽漬化嚴(yán)重，鹽漬化土壤占到耕地的1/3，鑒于人多地少的特點(diǎn)，這些鹽漬化土壤仍被人們所利用栽種耐鹽作物，同時(shí)，早春的倒春寒每年也造成農(nóng)作物巨大損失。研究表明，木霉菌可以促進(jìn)馬鈴薯和紅蘿卜的生長(zhǎng)[6]、提高長(zhǎng)春花、花生和黃瓜等植物的發(fā)芽率和出苗率[7-8]、增強(qiáng)番茄對(duì)寒冷脅迫的耐受能力及黃瓜種子的耐鹽閾值[9-10]。

海洋生境中的微生物往往具有特殊的生理結(jié)構(gòu)或能產(chǎn)生特殊的代謝產(chǎn)物，因而顯示出良好的農(nóng)藥應(yīng)用前景。海洋生境木霉主要存在于藻類(lèi)的內(nèi)生環(huán)境或海底淤泥中，作為一種生防菌，海洋生境木霉具有較為廣泛的應(yīng)用潛力[11]。TCS007 菌是從南極海洋沉積物中采集分離得到野生菌株后經(jīng)過(guò)培養(yǎng)馴化和復(fù)合誘變育種，獲得的棘孢木霉菌株Trichoderma asperellum[12]，其在高鹽和低溫脅迫下具有良好的抗逆性能，并對(duì)小麥全蝕病菌Gaeumannomyces graminis、水稻稻瘟病菌Magnatorthe oryzae、香蕉葉斑病菌Mycosphaerella eumusae、黃瓜褐斑病菌Corynespora cassiicola和山核桃干腐病菌Botryosphaeria dothidea的抑制率達(dá)80.81%～87.82%，同時(shí)觀(guān)察到對(duì)植物有促生長(zhǎng)效果[13]。為了明確其促生抗逆作用，本研究以TCS007 孢子懸浮液為試驗(yàn)藥劑開(kāi)展其對(duì)植物的促生長(zhǎng)效果及在低溫和鹽脅迫下誘導(dǎo)植物抗逆作用研究，旨在為該木霉菌的成功開(kāi)發(fā)和在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用推廣提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株及植物 海洋生境棘孢木霉T.asperellumTCS007 由本實(shí)驗(yàn)室分離自南極海洋沉積物，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心 (CGMCC)，保藏編號(hào)為CGMCC No.15677。

黃瓜品種：寶楊5 號(hào)，上海市寶山區(qū)蔬菜科學(xué)技術(shù)推廣站；水稻品種：甬燦15 號(hào)，寧波農(nóng)科院水稻研究所。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA 固體培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)方法[14]配制，用于TCS007 菌株的培養(yǎng)。

1.1.3 主要儀器 MGC-250BP 人工氣候箱 (上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；U2801 紫外分光光度計(jì)(日本日立公司)；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋 (常州國(guó)華電器有限公司)；DDS-11A 電導(dǎo)率測(cè)試儀 (上海越平科學(xué)儀器有限公司)；CT15RE 型臺(tái)式冷凍離心機(jī) (日本日立公司)；ME104E 電子天平 (德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；SW-CJ-2FD 型潔凈工作臺(tái) (蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；ZQZY-CF 型振蕩培養(yǎng)箱 (上海知楚儀器有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 TCS007 孢子懸浮液制備 用10 mL 無(wú)菌水清洗用PDA 固體培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d 的TCS007 菌株，過(guò)濾，得到孢子懸浮液后用無(wú)菌水稀釋到所需孢子濃度，備用。

1.2.2 TCS007 對(duì)植物的促生長(zhǎng)作用

1.2.2.1 TCS007 對(duì)黃瓜種子萌發(fā)及胚根生長(zhǎng)的影響 參考種子萌發(fā)試驗(yàn)方法[15]測(cè)定TCS007 孢子懸浮液對(duì)黃瓜種子發(fā)芽率的影響。分別用20 mL濃度為1 × 103、1 × 104、1 × 105和1 × 106CFU/mL的孢子懸浮液對(duì)黃瓜種子進(jìn)行浸種處理24 h，以清水處理為對(duì)照。選20 粒大小一致的處理后的種子，擺放在鋪有2 層濾紙直徑為9 cm 培養(yǎng)皿中，置于 (25 ± 1) ℃人工氣候箱中暗培養(yǎng)3 d，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽數(shù)，按 (1) 式計(jì)算發(fā)芽率并測(cè)量胚根長(zhǎng)度，各處理5 次重復(fù)。

式中：Y為種子發(fā)芽率，%；M1為發(fā)芽率天數(shù)內(nèi)的全部正常發(fā)芽粒數(shù)；M為發(fā)芽率試驗(yàn)所用種子總粒數(shù)。

1.2.2.2 TCS007 對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)量、根系生長(zhǎng)及葉片生理指標(biāo)的影響 參考謝琳淼等[16]的溫室盆栽試驗(yàn)法測(cè)定黃瓜生長(zhǎng)量。選取長(zhǎng)勢(shì)一致的健康黃瓜幼苗，當(dāng)其長(zhǎng)至2 片真葉時(shí)用20 mL 濃度為1 × 106CFU/mL 的TCS007 孢子懸浮液進(jìn)行灌根處理，同時(shí)用等量清水灌根處理作為空白對(duì)照。置于溫度 (20 ± 1) ℃、相對(duì)濕度60%和光照14 h/黑暗10 h 的人工氣候箱中培養(yǎng)，各處理3 次重復(fù)。處理7 d 后，測(cè)定黃瓜幼苗的株高、株鮮重和葉面積等生長(zhǎng)量指標(biāo)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

參考蔡昆爭(zhēng)等[17]的方法測(cè)定黃瓜根系生長(zhǎng)指標(biāo)。分別用量筒和電子天平測(cè)定根系的體積及鮮重；采用比色法測(cè)定根系活力；采用甲烯藍(lán)法測(cè)定根系總吸收面積、根系活躍吸收面積和比表面積。

參考安婉寧[18]的方法測(cè)定黃瓜葉片生理指標(biāo)，分別采用蒽酮法測(cè)定可溶性糖含量、考馬斯亮藍(lán)G-250 法測(cè)定可溶性蛋白含量和分光光度法測(cè)定葉綠素含量。

1.2.3 TCS007 誘導(dǎo)植物抗逆作用

1.2.3.1 TCS007 對(duì)低溫脅迫下黃瓜抗逆性生理指標(biāo)的影響 參考周小江等[19]的方法，選取第1 片真葉展開(kāi)后的黃瓜幼苗，在光照度1500 lx 條件下，分別置于5、10、15 ℃及光照12 h/黑暗12 h的環(huán)境中進(jìn)行48 h 低溫脅迫處理。處理組噴施10 mL 濃度為1 × 106CFU/mL 的孢子懸浮液，以無(wú)菌水處理作為對(duì)照。取0.5 g 黃瓜葉片用電導(dǎo)率測(cè)試儀測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率(REC)，采用氮藍(lán)四唑法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)活性，采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過(guò)氧化物酶(POD)活性，采用硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛(MDA)含量。各處理重復(fù)3 次。

1.2.3.2 TCS007 對(duì)鹽脅迫下水稻生長(zhǎng)及抗逆性生理指標(biāo)的影響 將催芽露白的水稻種子均勻鋪在裝有Hoagland 培養(yǎng)液的燒杯中，置于溫度 (28 ± 1)℃、相對(duì)濕度60%及光照16 h/黑暗8 h 的人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)，待水稻幼苗長(zhǎng)至2 葉1 心期時(shí)進(jìn)行鹽脅迫和TCS007 孢子懸浮液處理。

采用0.1 mol/L 的 NaCl 作為鹽害脅迫的濃度[20]，對(duì)照組 (CK) 為Hoagland 營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)液，陽(yáng)性對(duì)照組 (CKN) 為試驗(yàn)組Hoagland 營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)液加0.1 mol/L NaCl，水稻生長(zhǎng)測(cè)定試驗(yàn)組分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5% (T0.5)、1% (T1)、2.5% (T2.5)、5%(T5) 的1 × 106CFU/mL 的孢子懸浮液處理水稻幼苗，此外同時(shí)添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5% (TN0.5)、1%(TN1)、2.5% (TN2.5)、5% (TN5) 的孢子懸浮液和0.1 mol/L NaCl 處理水稻幼苗；水稻幼苗生理指標(biāo)測(cè)定試驗(yàn)組為添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% (T5) 濃度為1 ×106CFU/mL 的孢子懸浮液處理水稻幼苗及同時(shí)添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5% (TN5) 的孢子懸浮液和0.1 mol/L NaCl 處理水稻幼苗。處理后的水稻幼苗置入人工氣候箱，培養(yǎng)條件同1.2.2.2 節(jié)。7 d 后測(cè)量其株高和株鮮重，并計(jì)算株高和株鮮重比值；對(duì)水稻幼苗抗性生理指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，取0.1 mL 水稻幼苗粗酶液測(cè)定過(guò)氧化氫酶(CAT) 活力。各處理重復(fù)3 次。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用Graphpad Prism 制作相關(guān)圖表，采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)黃瓜種子萌發(fā)的影響

不同濃度的TCS007 孢子懸浮液對(duì)黃瓜種子萌發(fā)和胚根生長(zhǎng)均有促進(jìn)作用 (表1 和圖1)，且隨著TCS007 孢子懸浮液濃度增加，其發(fā)芽率和胚根長(zhǎng)度總體呈增加趨勢(shì)，其中1 × 106CFU/mL 的孢子懸浮液處理后，黃瓜種子發(fā)芽率和胚根長(zhǎng)度分別較對(duì)照提高了5.89%和49.13%。

圖1 TCS007 孢子懸浮液對(duì)黃瓜種子萌發(fā)的影響Fig.1 Effects of TCS007 spore suspension on cucumber seed germination

表1 TCS007 孢子懸浮液對(duì)黃瓜種子萌發(fā)的影響Table 1 Effects of TCS007 spore suspension on cucumber seed germination

2.2 對(duì)黃瓜幼苗生理指標(biāo)的影響

由表2 數(shù)據(jù)可知：1 × 106CFU/mL TCS007 孢子懸浮液對(duì)幼苗株鮮重和葉面積有顯著的促進(jìn)作用，其中株高、株鮮重和葉面積分別比對(duì)照組提高了7.57%、13.53%和17.97%。觀(guān)察黃瓜生長(zhǎng)情況發(fā)現(xiàn)，經(jīng)TCS007 孢子懸浮液處理的黃瓜苗葉色更綠，長(zhǎng)勢(shì)更為茂盛 (圖2)。

圖2 1 × 106 CFU/mL TCS007 孢子懸浮液處理7 d 后黃瓜生長(zhǎng)情況Fig.2 The cucumber seedlings were treated with 1 × 106 CFU/mL TCS007 spore suspension for 7 days:the growth of cucumber

表2 1×106 CFU/mL TCS007 孢子懸浮液對(duì)黃瓜形態(tài)指標(biāo)的影響Table 2 Effects of 1×106 CFU/mL TCS007 spore suspension on cucumber morphological indicators

2.3 對(duì)黃瓜根系生長(zhǎng)的影響

經(jīng)1 × 106CFU/mL TCS007 孢子懸浮液處理7 d后，黃瓜根體積、根鮮重、根系活力、根系總吸收面積和根系活躍吸收面積均顯著高于對(duì)照組(表3)，其中根體積、根鮮重及根系活力比對(duì)照分別增加了81.58%、66.67%和27.30%，而根系比表面積未發(fā)生顯著變化。

表3 1 × 106 CFU/mL TCS007 孢子懸浮液對(duì)黃瓜根系生長(zhǎng)的影響Table 3 Effects of 1 × 106 CFU/mL TCS007 spore suspension on cucumber root growth

2.4 對(duì)黃瓜葉片生理指標(biāo)的影響

用濃度為1 × 106CFU/mL TCS007 孢子懸浮液處理7 d 后，黃瓜葉片的總?cè)~綠素、可溶性糖及可溶性蛋白含量較對(duì)照組分別提升了22.75%、18.24%和8.60% (表4)。

表4 1 × 106 CFU/mL TCS007 孢子懸浮液對(duì)黃瓜葉片生理指標(biāo)的影響Table 4 Effects of 1 × 106 CFU/mL TCS007 spore suspension on physiological indexes of cucumber leaves

2.5 低溫脅迫下TCS007 對(duì)黃瓜葉片抗性生理指標(biāo)的影響

在5℃、10℃和15℃低溫脅迫下，經(jīng)濃度為1 × 106CFU/mL TCS007 孢子懸浮液處理后的黃瓜幼苗與空白對(duì)照相比，SOD 和POD 活性均有所提高，REC 和MDA 含量明顯降低 (圖3)。其中在5 ℃下，TCS007 誘導(dǎo)黃瓜抗寒的效果最為顯著，其葉片SOD 活性提高了17.88%，POD 活性提高了23.60%，REC 和MDA 含量分別下降了36.73%和44.29%。

圖3 低溫脅迫下 1 × 106 CFU/mL TCS007 孢子懸浮液對(duì)黃瓜生理指標(biāo)的影響Fig.3 Effects of 1 × 106 CFU/mL TCS007 spore suspension on physiological indexes related to the cold tolerance of cucumber

2.6 鹽脅迫下TCS007 對(duì)水稻幼苗生長(zhǎng)的影響

添加NaCl 的陽(yáng)性對(duì)照組與對(duì)照組中株高及株鮮重比值分別為0.499 和0.559 (表5)，表明在NaCl 脅迫條件下水稻鹽害較重；不同濃度的TCS007 孢子懸浮液均可以緩解NaCl 的鹽害作用(圖4)，其中添加濃度為5% 1 × 106CFU/mL 的孢子懸浮液對(duì)水稻抗鹽效果最為顯著，其株高和株鮮重較陽(yáng)性對(duì)照組分別增加了59.25%和71.86%。TCS007 孢子懸浮液含量越高，對(duì)水稻幼苗鹽害的緩解效果越為明顯，且從不添加NaCl 的T0.5、T1、T2.5 和T5 處理組水稻幼苗的生長(zhǎng)情況可以看出，TCS007 對(duì)水稻的促生長(zhǎng)作用有限，因此水稻幼苗鹽害的緩解效果隨孢子懸浮液含量增加而提升并非是由TCS007 的促生長(zhǎng)作用引起，而是由其抗鹽能力起作用。

圖4 鹽脅迫下不同含量TCS007 孢子懸浮液對(duì)水稻幼苗生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effects of different contents of TCS007 spore suspension on rice seedlings growth during salt induction

表5 鹽脅迫下不同含量TCS007 孢子懸浮液對(duì)水稻幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)的影響Table 5 Effects of different contents of TCS007 spore suspension on rice seedlings growth target during salt induction

2.7 鹽脅迫下TCS007 對(duì)水稻幼苗抗性生理指標(biāo)的影響

TCS007 對(duì)鹽脅迫下水稻幼苗生理指標(biāo)的影響如圖5 所示。在無(wú)鹽脅迫條件下，添加濃度為5%1 × 106CFU/mL TCS007 孢子懸浮液的水稻幼苗POD 和CAT 活性均顯著增加；在0.1 mol/L NaCl脅迫條件下，添加TCS007 孢子懸浮液的水稻幼苗SOD 活性顯著增加；在NaCl 脅迫處理組中，與僅NaCl 脅迫組相比，添加TCS007 孢子懸浮液的水稻幼苗SOD、CAT 和POD 活性均高于脅迫組，分別較脅迫組提升了5.6%、45.0%和10.9%；此外，在鹽脅迫條件下經(jīng)TCS007 處理的水稻幼苗，可以降低其相對(duì)電導(dǎo)率。

圖5 鹽脅迫下 1 × 106 CFU/mL TCS007 孢子懸浮液對(duì)水稻幼苗生理指標(biāo)的影響Fig.5 Effects of 1 × 106 CFU/mL TCS007 spore suspension on rice seedlings growth during salt induction

3 結(jié)論與討論

木霉菌與植物相互作用時(shí)可以產(chǎn)生多種化學(xué)物質(zhì)，具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)和誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性等作用[21]，由此提高農(nóng)作物產(chǎn)量。

木霉菌株具有在植株內(nèi)部或其根部定殖的能力，從而促進(jìn)種子萌發(fā)和植物生長(zhǎng)[22]，此外木霉菌株還能在鹽堿和干旱條件脅迫下誘導(dǎo)植物抗逆[23-24]。本研究結(jié)果表明，不同濃度的TCS007 孢子懸浮液對(duì)黃瓜種子的萌發(fā)均有明顯的促進(jìn)作用，且隨著孢子懸浮液濃度的增加，黃瓜幼苗的胚根長(zhǎng)度也顯著增加，說(shuō)明一定濃度的TCS007可以使種子發(fā)芽整齊，并使幼苗生長(zhǎng)迅速；在土壤中施加1 × 106CFU/mL TCS007 孢子懸浮液后，植物的株高和株鮮重顯著提高。這種促生效應(yīng)除了生長(zhǎng)物質(zhì)的作用外，還可能與木霉的根際能力及植物的營(yíng)養(yǎng)狀況有關(guān)。木霉在植物根際定殖后，有效地改善了植物根系的微環(huán)境，一方面可以通過(guò)分泌有機(jī)酸使土壤中難容或微溶的營(yíng)養(yǎng)元素溶解度增大，另一方面還可以產(chǎn)生某種還原酶促進(jìn)植物對(duì)氧化型礦物質(zhì)元素的吸收[25]。另有研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)枝木霉能夠提高6 種牧草幼苗的根系活力及蛋白質(zhì)和可溶性糖含量[26]；哈茨木霉可以提高豇豆葉片內(nèi)蛋白質(zhì)含量，增強(qiáng)根系活力，從而促進(jìn)豇豆的生殖生長(zhǎng)[27]。本研究的促生作用與上述結(jié)果基本一致，TCS007 孢子懸浮液可以促進(jìn)黃瓜種子萌發(fā)和胚根生長(zhǎng)，其中1 × 106CFU/mL TCS007 孢子懸浮液對(duì)黃瓜幼苗株鮮重和葉面積大小有顯著的促進(jìn)作用，提高黃瓜葉片中可溶性糖、可溶性蛋白及總?cè)~綠素等含量。

植物體內(nèi)活性氧(ROS)的產(chǎn)生是激活植物防御系統(tǒng)所必需的關(guān)鍵因素，但ROS 的過(guò)量生產(chǎn)會(huì)對(duì)植物細(xì)胞造成損害，植物體內(nèi)抗氧化酶的激活可以防止ROS 的積累和細(xì)胞毒性[28]。當(dāng)植物受到外界環(huán)境脅迫時(shí)，會(huì)激發(fā)植物產(chǎn)生ROS 和防御酶[29]。TCS007 在高鹽、低溫脅迫下植物的SOD 和POD 活性均有所提高，REC 有所降低，初步推測(cè)其誘導(dǎo)植物抗逆機(jī)理是通過(guò)提高SOD 和POD的活性，進(jìn)而及時(shí)清除過(guò)多的活性氧，維持植物內(nèi)體自由基代謝的動(dòng)態(tài)平衡；通過(guò)降低REC，保護(hù)膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，從而提高植物抗鹽及抗寒能力，本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果基本一致，有研究發(fā)現(xiàn)耐鹽堿木霉菌株可提高黃瓜幼苗的成活率、促進(jìn)植株根系生長(zhǎng)、增強(qiáng)黃瓜葉片中POD 活性，并且在NaCl 脅迫條件下可提高煙草苗的成活率、增加煙草苗葉片中可溶性蛋白含量、增強(qiáng)POD 活性和降低其MDA 含量[30]。

綜上，棘孢木霉TCS007 對(duì)植物促生長(zhǎng)和抗逆作用明顯，具有開(kāi)發(fā)為微生物農(nóng)藥的潛力。