劉 曼, 牛啟塵, 尹淑霞, 王子玥

(北京林業(yè)大學(xué) 草業(yè)與草原學(xué)院，北京 100083)

草坪幣斑病是溫帶地區(qū)精細(xì)化養(yǎng)護(hù)草坪上最嚴(yán)重的真菌性病害之一。研究顯示，草坪幣斑病的致病菌為Clarireedia屬真菌，共有6 個(gè)種，其中C.jacksonii和C.monteithiana在世界范圍內(nèi)分布廣泛，其寄主范圍廣，幾乎能侵染所有的草坪草[1-2]。

近年來，廣泛使用多菌靈、二甲酰亞胺、脫甲基抑制劑 (DMI) 和琥珀酸脫氫酶抑制劑 (SDHI)等化學(xué)殺菌劑保護(hù)草坪草免受草坪幣斑病菌侵害，但已有文獻(xiàn)表明，幣斑病菌株對上述殺菌劑均產(chǎn)生了不同程度的抗性[3-5]。此外，化學(xué)殺菌劑可能通過地表徑流和土壤入滲進(jìn)入地下水，對環(huán)境、動(dòng)物以及人類健康產(chǎn)生危害[6-7]，因此亟需開發(fā)綠色、安全、高效的新型殺菌劑防治草坪幣斑病。

自20 世紀(jì)30 年代以來，木霉菌Trichodermaspp.以其優(yōu)良的抑菌效果引起了研究學(xué)者們的廣泛關(guān)注[8-10]。木霉菌具有對環(huán)境友好、病菌不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，但在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中易受立地條件影響，導(dǎo)致田間防治時(shí)存在防治效果不穩(wěn)定的問題[11-12]。木霉菌次生代謝物與木霉菌的生物活性功能密切相關(guān)[13-14]。研究表明，木霉菌代謝產(chǎn)物可以激活葡萄藤對霜霉病病原菌Plasmopara viticola的防御機(jī)制[15]?？祵幠久筎.koningii和哈茨木霉T.harzianum產(chǎn)生的哈茨酮內(nèi)酯具有抗真菌活性和調(diào)節(jié)植物生長的雙重作用[16]。木霉菌產(chǎn)生的可溶性代謝物對由Colletotrichum falcatum引起的甘蔗紅腐病表現(xiàn)出良好的生防效果，且在大田條件下防治效果依然高效穩(wěn)定[17]。使用人工合成或提取的木霉菌抑菌代謝物代替木霉菌防治植物病害，可以減少活體微生物在田間使用過程中出現(xiàn)的效果不穩(wěn)定的問題，同時(shí)兼具利用木霉菌活體生物防治病害的優(yōu)勢。

6-戊基-2H-吡喃-2-酮(6-pentyl-2H-pyran-2-one, 以下簡稱6PP，結(jié)構(gòu)式見圖式1)于1972 年在綠色木霉T.viride中首次發(fā)現(xiàn)并分離提純。它是一種無毒的、具有椰子香味的不飽和內(nèi)酯，能從多種木霉菌的培養(yǎng)物中分離得到，包括橘綠木霉T.citrinoviride、哈茨木霉、康寧木霉、深綠木霉T.atroviride和綠色木霉T.viride。6PP 具有廣譜性抗真菌活性，對菜豆大斑病菌Macrophomina phaseolina、立枯絲核菌Rhizoctonia solani、羅氏菌核Sclerotium rolfsii、尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum、辣椒疫霉Phytophthora capsica和甜瓜疫霉P.melonis具有良好的抑菌作用，極具應(yīng)用潛力[18-21]。目前尚未見有關(guān)利用6PP 防治草坪幣斑病的相關(guān)報(bào)道，其抑菌活性、防治效果和機(jī)理有待驗(yàn)證和探索。本文研究了6PP 對2 種草坪幣斑病菌的抑菌活性和防治效果，并通過一系列生理生化指標(biāo)的測定，探究6PP 對草坪幣斑病菌的抑菌活性以及對病害的防治效果，旨在為草坪幣斑病的低毒科學(xué)防治提供參考。

圖式1 6-戊基-2H-吡喃-2-酮結(jié)構(gòu)式Scheme 1 Structural formula of 6-pentyl-2H-pyran-2-one

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株來自北京林業(yè)大學(xué)草地保護(hù)實(shí)驗(yàn)室，菌株編號(hào)為N8、N13、N14、N18、73 和112，其中N8、73、112 為Clarireedia jacksonii，N13、N14、N18 為C.monteithiana；供試草坪草為匍匐翦股穎A4Agrostis stoloniferaL.‘A4’?；九囵B(yǎng)基(MM)：10 g 葡萄糖、1.5 g K2HPO4、2 g KH2PO4、1 g (NH4)2SO4、0.5 g MgSO4· 7H2O、2 g 酵母提取物、15 g 瓊脂粉加去離子水定容到1 L，滅菌；馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)：20 g 葡萄糖、6 g 馬鈴薯浸粉加去離子水定容到1 L，滅菌。6PP購自北京邁瑞達(dá)科技有限公司，純度為97%。

1.2 儀器

DZF-6020MBE 真空干燥箱 (上海博訊有限公司)；DL-CJ-2ND I 型超凈工作臺(tái) (北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；SX700 高壓滅菌鍋 (天美科學(xué)儀器有限公司)；SPX 型智能生化培養(yǎng)箱 (寧波江南儀器廠)；DDSJ-318 型電導(dǎo)率儀 (北京揚(yáng)海偉業(yè)科技公司)；FE28 pH 計(jì) (大連貝爾分析儀器有限公司)；島津UV-2600i 型紫外線分光光度計(jì) (上海滴冠有限公司)；Multifuge X1R 型高速冷凍離心機(jī)(賽默飛世爾科技有限公司)；ECLIPSE E100 型電子顯微鏡 (南京江南永新光學(xué)有限公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株的鑒定 參照Hu 等[22]的方法，將6 株供試菌株在MM 平板上于25 ℃下黑暗培養(yǎng)3 d 后，刮取菌絲，使用OMEGA 真菌DNA 提取試劑盒 (百邁客生物科技有限公司) 提取病原菌DNA。隨后利用真菌通用正向引物ITS-1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和反向引物ITS-4(5′-AACTTGCAATGTGG-3′) 對幣斑病菌的ITS 基因進(jìn)行擴(kuò)增和測序，將測序結(jié)果進(jìn)行拼接后，于NCBI (National Center for Biotechnology Information)上進(jìn)行BLAST 序列相似性搜索。利用MEGA7.0 軟件和基于1000 次重復(fù)的引導(dǎo)值構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。標(biāo)準(zhǔn)菌株編號(hào)及其參考文獻(xiàn)見附加材料表S1。

1.3.2 6PP 對菌株的抑制效率 采用菌絲生長速率法[23]測定6PP 對6 株病菌的有效抑制中濃度(EC50)。菌株在MM 培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)3 d 后，在菌落邊緣取直徑6 mm 的菌餅，分別接種到最終質(zhì)量濃度為0、0.025、0.05、0.075、0.1、0.125、0.15、0.175、0.2、0.225、0.25 和0.275 μg/mL 6PP 的MM 平板上，接菌后將平板置于25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)，以不含6PP 的平板為對照。對照組菌落直徑超過培養(yǎng)皿直徑2/3 時(shí)，采用十字交叉法測量各處理的菌落直徑，計(jì)算6PP 對幣斑病菌菌絲生長的抑制率，求出毒力回歸方程。每個(gè)濃度重復(fù)3 次，試驗(yàn)重復(fù)2 次。

1.3.3 6PP 對幣斑病菌菌絲形態(tài)的影響 在培養(yǎng)2 d的菌落 (菌株N8 和N18) 的邊緣取菌餅轉(zhuǎn)移到含有0.075 μg/mL 6PP 的MM 培養(yǎng)基上，以不含6PP 的培養(yǎng)基為對照。在25 ℃下培養(yǎng)3 d 后，取適量菌絲在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)。每個(gè)菌株設(shè)3 個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)2 次。

1.3.4 免疫組織化學(xué)染色 幣斑病菌N8 和N18 用于對活性氧(ROS)、過氧化氫(H2O2)進(jìn)行染色，參照Mojicak 等[24]方法。Tris-HCl 緩沖液(0.1 mol/L, pH = 7.6)、質(zhì)量濃度為0.3%的氯化鈷(CoCl2) 按照體積比 9 : 1 混合，將不同處理的菌絲浸泡在3 mL 1 mg/mL 的3,3′-二氨基聯(lián)苯胺(3,3′-diaminobenzidine)染液中，顯色時(shí)加入5～10 mL 30% H2O2, 染色8 h 后，將菌絲浸泡在無水乙醇中脫色12 h，光學(xué)顯微鏡下觀察染色后的菌絲。

1.3.5 6PP 對幣斑病菌細(xì)胞膜通透性的影響 參照Duan 等[25]的方法，將幣斑病菌N8、N18 接種于MM 上，25 ℃培養(yǎng)3 d 后，打取5 個(gè)直徑6 mm的菌餅，接種于含有100 mL PDB 的250 mL 搖菌瓶中，于25 ℃、175 r/min 恒溫?fù)u床上搖培36 h后，處理組添加0.075 μg/mL 的6PP，對照組添加等量的無菌水，繼續(xù)培養(yǎng)36 h。于5000 r/min 下離心10 min 后收集菌絲，上清液備用。稱取菌絲0.3 g，懸浮于20 mL 的無菌水中，分別在0、5、10、20、40、60、80、100、120、140、160 和180 min 時(shí)使用電導(dǎo)率儀測定溶液的電導(dǎo)率。之后將溶液煮沸5 min，并測定最終的電導(dǎo)率。每個(gè)菌株設(shè)3 個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)2 次。按照公式 (1) 計(jì)算菌體的相對電導(dǎo)率。

式中：RC為相對電導(dǎo)率，%；R1為某時(shí)間的電導(dǎo)率，μS/cm；R2為再放入恒溫水浴中加熱5min，取出冷卻至室溫后再測定的電導(dǎo)率，μS/cm。

1.3.6 6PP 對幣斑病菌pH 值的影響 按照1.3.5 節(jié)方法培養(yǎng)草坪幣斑病菌N8 和N18，打取5 個(gè)直徑6 mm 的菌餅，接種于含有100 mL PDB 的250 mL 搖菌瓶中，于25 ℃、175 r/min 恒溫?fù)u床上搖培36 h 后，處理組添加0.075 μg/mL 的6PP，對照組添加等量的無菌水，繼續(xù)培養(yǎng)36 h。于10 000 r/min 下離心10 min，收集上清液，測定菌液pH 值。每個(gè)菌株設(shè)3 個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)2 次。

1.3.7 幣斑病菌胞外多糖(EPS)含量測定 參照文獻(xiàn)方法測定[26]。取1 mL 上清液(同1.3.5 節(jié))至5 mL 無菌離心管中，加入3 倍體積的無水乙醇，于10 000 r/min 下離心60 min，棄去無水乙醇，將沉淀物在60 ℃真空下干燥60 min，之后溶解于8 mL 無菌水中，水解后取2 mL 溶液，加入1 mL 5%苯酚溶液和5 mL 濃硫酸，渦旋10 s 后在25 ℃放置30 min，在490 nm 處測量溶液的吸光值，并用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。以無菌水為對照。每處理設(shè)3 個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)2 次。

1.3.8 丙二醛(MDA)含量測定 采用硫代巴比妥酸法[27]測定。按照1.3.5 節(jié)方法處理并收集菌絲。將菌絲與Tris-HCl 緩沖液(0.05 mol/L，pH = 7.5)按體積比 1 : 5 研磨均質(zhì)化，于15 000 r/min 下冷凍離心20 min。以2 mL 上清液和2 mL 0.5%硫代巴比妥酸為反應(yīng)液，混勻后將試管放入沸水中煮10 min，冷卻后以5000 r/min 離心10 min。以0.5% 硫代巴比妥酸溶液為對照組，分別于波長532、600 和450 nm 處測量吸光度值，計(jì)算MDA含量。每處理設(shè)3 個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)2 次。

1.3.9 幣斑病菌對6PP 的生理響應(yīng) 按照1.3.5 節(jié)方法收集菌絲，稱取0.5 g 菌絲于預(yù)冷的研缽中，加入1 mL 預(yù)冷0.05 mol/L 磷酸緩沖液(pH = 7.8)，于12 000 r/min 下離心10 min，上清液用于過氧化物酶活性(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)的測定。采用愈創(chuàng)木酚法[28]測定POD 活性，以每分鐘內(nèi)A470變化0.01 為1 個(gè)過氧化物酶活性單位 (U)。采用氮藍(lán)四唑 (NBT) 光還原法[29]測定SOD 活性，以抑制NBT 光化還原的50%為SOD 酶的一個(gè)活力單位 (U)。

1.3.10 6PP 對草坪離體葉片幣斑病的防治作用

采用離體葉片法測定6PP 對草坪幣斑病的預(yù)防和治療作用[30]。

預(yù)防作用測定：選取位于同一位置，大小相仿，健康且展開的草坪葉片作為試驗(yàn)試材，將具有相似長度 (7 cm) 的葉片切下并放在無菌培養(yǎng)皿(直徑9 cm) 中被無菌水完全浸濕的定性濾紙上。將6PP 用0.1%的吐溫20 稀釋，藥液的最終質(zhì)量濃度為0、0.1、0.5 和1 μg/mL，噴灑到葉片表面，直到液體在葉片表面自由流動(dòng)。24 h 后，將5 mm 幣斑病菌的菌餅 (菌株N8 和N18) 放置在葉片表面(每片葉一個(gè)菌餅)，用封口膜密封并放置于光照培養(yǎng)箱(25 ℃、光照16 h、濕度80%)。2 d 后，十字交叉法測量葉片上病斑的直徑。

治療作用測定：先用幣斑病菌N8 和N18 接種葉片，接種方法、培養(yǎng)條件同預(yù)防作用，在接種24 h 后噴施最終質(zhì)量濃度分別為0、0.5 和2 μg/mL 6PP 藥液。2 d 后測量病變長度，并按照公式 (2)計(jì)算防治效果(E)。每處理使用10 片葉。

式中：L1為對照的病變長度，cm；L2為6PP 處理的病變長度，cm。結(jié)果為10 個(gè)重復(fù)的平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差。

1.3.11 6PP 對草坪植株的防治效果 選擇生長狀況大致相同的健壯草坪植株，測定6PP 對草坪幣斑病的預(yù)防和治療作用。

預(yù)防作用測定：分別用0.25、0.5 和1 μg/mL 6PP 進(jìn)行整株噴霧處理，每株噴施2 mL，葉面均勻掛滿霧滴不流淌即可，誘導(dǎo)處理24 h 后，將草坪幣斑病菌N8 和N18 的1 個(gè)菌餅 (10 mm) 分別接種到經(jīng)過6PP 處理過的草坪上，并放置于光照培養(yǎng)箱(25 ℃、光照16 h、濕度80%)，培養(yǎng)7 d后，統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)。以此接種點(diǎn)為中心調(diào)查周圍的100 枚葉片。以無菌水只接菌為對照，每個(gè)處理4 株，重復(fù)3 次。

治療作用測定：先用幣斑病菌N8 和N18 接種草坪植株，接種方法、培養(yǎng)條件同預(yù)防作用，在接種24 h 后噴施最終濃度分別為0、0.5、1 和2 μg/mL 6PP 藥液。7 d 后測量病變長度，并計(jì)算防治效果。按公式 (3) 計(jì)算病情指數(shù) (DI)。

式中：Ni為各級(jí)病株數(shù)；i為相應(yīng)的級(jí)數(shù)值；Nt為調(diào)查總株數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

通過SPSS16.0 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用Duncan 氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，采用prism9.0 軟件 (GraphPad 公司) 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖形制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定

根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，6 株菌株劃分為2 個(gè)種，其中N8、112、73 菌株為C.jacksonii，N18、N13、N14 菌株為C.monteithiana。供試菌株與幣斑病菌模式菌株 (Type strain) 的同源性均達(dá)到了98%以上(圖1)。

圖1 基于ITS-rDNA 序列采用鄰接法(NJ)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree constructed using neighbor-joining method based on ITS rDNA sequences

2.2 6PP 對幣斑病菌抑制效果

6PP 對各菌株菌絲的生長具有抑制作用(圖2-A)，較高質(zhì)量濃度的6PP ( ＞ 0.2 μg/mL)有效抑制了C.monteithiana3 株菌株菌絲的生長，徑向生長抑制率為60.72%、85.20%和97.71%，并完全抑制了C.jacksonii3 株菌株菌絲的生長，徑向生長抑制率為100%。6PP 對C.jacksonii的抑菌效果較好，在較低質(zhì)量濃度(0.05 μg/mL) 時(shí)，對N8、73 和112 的抑制率分別達(dá)到80.40%、99.50%和97.77%，對C.monteithiana的N13、N14 和N18 的抑制率分別是20.10%、19.80%和32.72%(圖2-B)。6PP 對C.jacksonii的EC50值顯著低于C.monteithiana(P＜ 0.05)，其中6PP 對C.monteithiana3 株菌株的平均EC50值為0.37 μg/mL，對C.jacksonii3 株菌株的平均EC50值為0.04 μg/mL (表1)。

表1 6PP 對幣斑病菌的EC50 值Table 1 EC50 value of 6PP to Clarireedia strains

圖2 不同濃度6PP 對幣斑病菌N13、N14、N18、N8、112 和73 的抑制作用Fig.2 The inhibition effect of 6PP against Clarireedia spp.strains N13, N14, N18, N8, 112 and 73

2.3 6PP 對平板培養(yǎng)條件下幣斑病菌菌絲形態(tài)的影響

菌株N8 和N18 的對照組菌絲呈現(xiàn)出完整、均勻的形態(tài)，菌絲表面光滑且能自然延展(圖3-a,3-c)，而在0.075 μg/mL 的6PP 處理下，N8 和N18 顯示出不同的形態(tài)變化。其中N8 菌株，菌絲頂部的分支增加，菌絲細(xì)胞膨大(圖3-b)，菌絲漿液凝結(jié)外滲，菌絲漿分布均勻；而N18 菌絲變細(xì)且聚集，隔膜變短(圖3-d)。

圖3 6PP 對C.jacksonii N8 和C.monteithiana N18菌絲形態(tài)的影響Fig.3 Effect of 6PP on the mycelial morphology of C.jacksonii N8 and C.monteithiana N18

2.4 6PP 對幣斑病菌過氧化物積累的影響

DAB 染色結(jié)果顯示，菌株N8 與N18 的6PP處理組菌絲與DAB 孵化時(shí)生成棕色產(chǎn)物(圖4-a，4-c)，而對照組沒有發(fā)現(xiàn)色素沉積。

圖4 C.jacksonii N8 和C.monteithiana N18 的DAB 染色結(jié)果圖Fig.4 DAB staining of C.jacksonii N8 and C.monteithiana N18

2.5 6PP 對菌絲體相對電導(dǎo)率的影響

兩種草坪幣斑病菌株(N8 和N18)菌絲的相對電導(dǎo)率隨著時(shí)間的推移大致呈現(xiàn)先增加后逐漸穩(wěn)定的趨勢。經(jīng)6PP 處理后，N8 和N18 菌絲的相對電導(dǎo)率高于對照組(圖5)，N8 和N18 對照組和處理組在180 min 內(nèi)相對電導(dǎo)率均顯著上升(P＜0.05)，其中N8 對照組以及6PP 處理在180 min 內(nèi)變化值均顯著大于N18 菌株(表2)。

表2 180 min 內(nèi)C.jacksonii N8 和C.monteithiana N18的相對電導(dǎo)率的變化Table 2 The changes of the relative conductivity of C.jacksonii N8 and C.monteithiana N18 within 180 min

圖5 6PP 對C.jacksonii N8 和C.monteithiana N18 菌絲體相對電導(dǎo)率的影響Fig.5 Effect of 6PP on the relative conductivity of mycelia of C.jacksonii N8 and C.monteithiana N18

2.6 6PP 對幣斑病菌菌液pH 值的影響

6PP 處理幣斑病菌36 h 后，N8 對照組菌液的平均pH 值為5.08，處理后的菌液pH 平均值與對照組菌液無顯著差異(P＞ 0.05)。N18 對照組菌液的平均pH 值為4.84，處理后的菌液pH 平均值為5.20，N18 處理菌株的菌液pH 變化顯著高于對照組的菌液(P＜ 0.05) (圖6)。

圖6 6PP 對C.jacksonii N8 和C.monteithiana N18 菌液pH 值的影響Fig.6 Effect of 6PP on bacterial fluid pH of C.jacksonii N8 and C.monteithiana N18

2.7 6PP 對幣斑病菌MDA 的影響

與對照組相比，經(jīng)過6PP 處理的草坪幣斑病菌MDA 含量均顯著升高(P＜ 0.05)。N8 對照組MDA 含量為0.74 μmol/g，處理后為1.91 μmol/g。N18 對照組MDA 含量為0.82 μmol/g，處理后為1.64 μmol/g (圖7)。

圖7 6PP 對C.jacksonii N8 和C.monteithiana N18 菌絲體MDA 含量的影響Fig.7 Effect of 6PP on MDA of C.jacksonii N8 and C.monteithiana N18 mycelium

2.8 6PP 對EPS 含量的影響

N8 對照組的EPS 含量為8.09 mg/L，處理后為19.27 mg/L，增長率為58.02%；N18 對照組的EPS 含量為5.20 mg/L，處理后為21.30 mg/L，增長率為75.59%。6PP 處理后N8 和N18 菌株的EPS 含量均顯著高于對照組 (P＜ 0.05)，其中N18的增長率高于N8 (圖8)。

圖8 6PP 對C.jacksonii N8 和C.monteithiana N18 菌絲體EPS 含量的影響Fig.8 Effect of 6PP on the EPS content of C.jacksonii N8 and C.monteithiana N18 mycelium

2.9 6PP 對抗氧化酶活性的影響

6PP 處理后N8 和N18 菌株SOD 活性均顯著高于對照組(P＜ 0.05)，N8 對照組的SOD 活性為7.69 U/g，處理后為12.76 U/g，增長率為39.73%；N18 對照組的活性為6.90 U/g，處理后為12.75 U/g，增長率為45.88%，即N18 的增長率高于N8。N8 對照組的POD 活性為1.31 U/(g·min)，處理后為2.40 U/(g·min)，其增長率為45.42%，兩者存在顯著性差異(P＜ 0.05)。N18 對照組POD 活性為6.46 U/(g·min)，處理后POD 活性為6.90 U/g·min，差異并不顯著(P＞ 0.05) (圖9)。

圖9 6PP 對C.jacksonii N8 和C.monteithiana N18 菌絲體SOD 和POD 的影響Fig.9 Effect of 6PP on SOD, and POD of C.jacksonii N8 and C.monteithiana N18 mycelium

2.10 6PP 對草坪離體葉片幣斑病的預(yù)防和治療

離體條件下，以草坪幣斑病菌株N8 和N18作為侵染源。預(yù)防試驗(yàn)中，6PP 對N8 和N18 引起的幣斑病均有良好的預(yù)防效果 (圖10-A，表3)。在接種前噴施1 μg/mL 的6PP，與噴施無菌水的對照組相比，預(yù)防效果分別達(dá)到92.40%和89.88%。治療試驗(yàn)中，幣斑病菌N8 和N18 接種24 h 后，2 μg/mL 的6PP 治療效果分別為61.86%和53.53%(圖10-B，表3)。

表3 6PP 對匍匐翦股穎離體葉片幣斑病C.jacksonii N8 和 C.monteithiana N18 的預(yù)防與治療Table 3 Preventive and curative effects of 6PP against C.jacksonii N8 and C.monteithiana N18 on leaves

圖10 6PP 對匍匐翦股穎離體葉片幣斑病的預(yù)防與治療Fig.10 Preventive and curative effect of 6PP on creeping bentgrass detached leaves against Clarireedia spp.

2.11 6PP 對草坪幣斑病的預(yù)防和治療

盆栽條件下，以草坪幣斑病菌株N8 和N18作為侵染源。6PP 在不同劑量濃度下對草坪幣斑病都表現(xiàn)出一定程度的保護(hù)和治療作用效果。在接種前噴施1 μg/mL 的6PP，與噴施無菌水的對照組相比，預(yù)防效果分別達(dá)到74.65%和69.77%。在治療試驗(yàn)中，幣斑病菌N8 和N18 接種24 h后，2 μg/mL 的6PP 治療效果分別為63.44% 和63.06% (表4)。

表4 6PP 對匍匐翦股穎植株幣斑病C.jacksonii N8 和 C.monteithiana N18 的預(yù)防與治療Table 4 Preventive and curative effects of 6PP against C.jacksonii N8 and C.monteithiana N18 on plant

3 結(jié)論與討論

3.1 6PP 對草坪幣斑病菌的抑菌活性和防治效果

本研究中兩種幣斑病菌在6PP 處理下EC50值范圍為0.03～0.83 μg/mL，均值為0.20 μg/mL。Hu 等[31]對24 個(gè)高爾夫球場和 1 個(gè)研究基地收集分離的358 株幣斑病菌的研究中發(fā)現(xiàn)，在丙環(huán)唑、異菌脲、啶酰菌胺處理下，幣斑病菌平均EC50值分別為0.0307、0.2598 和2.067 μg/mL。同樣，胡健等[32]在114 株幣斑病菌的研究中發(fā)現(xiàn)，病菌在異菌脲處理下EC50值為0.0121～1.2644 μg/mL，均值為 (0.5663 ± 0.2144) μg/mL。與目前廣泛用于草坪幣斑病防治的多種殺菌劑相比，6PP 具有更為高效的抑菌作用。離體條件下，6PP 對草坪幣斑病菌的防治效果隨著施用劑量的增加而增加。盆栽條件下，6PP 各處理的病情指數(shù)均低于對照組。

3.2 6PP 破壞細(xì)胞膜的屏障作用，引發(fā)病菌的脅迫反應(yīng)

過氧化物的產(chǎn)生是細(xì)胞受到逆境脅迫的典型特征，本研究中兩株幣斑病菌MDA 含量顯著上升并出現(xiàn)大量DAB 染色位點(diǎn)。MDA 是膜脂過氧化產(chǎn)生的重要生物標(biāo)志物，其濃度用于準(zhǔn)確反映氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，經(jīng)6PP 處理后，草坪幣斑病菌產(chǎn)生大量的氧化自由基被DAB 染色，這表明6PP 處理使得病菌過氧化物積累，最終膜結(jié)構(gòu)受損，菌絲浸泡液的相對電導(dǎo)率升高，pH 值上升也說明了這一問題。當(dāng)微生物處在不利環(huán)境時(shí)，EPS 可以啟用一種特殊機(jī)制來提供保護(hù)，以維持細(xì)胞膜的完整性并延長其存活時(shí)間[33-34]。N8 和N18 的EPS 上升說明菌絲受到脅迫，開始分泌EPS 來保護(hù)細(xì)胞膜和細(xì)胞壁[35]，以抵御6PP 的干擾。病原菌受到外界脅迫時(shí)，會(huì)分泌SOD 將脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)化為過氧化氫以調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的抗性反應(yīng)[36]。6PP 處理后N8 和N18 的SOD 活性顯著上升，說明病菌的抵抗反應(yīng)被觸發(fā)，病菌受到脅迫。

3.3 6PP 對兩種不同草坪幣斑病的脅迫強(qiáng)度

6PP 對兩種不同草坪幣斑病具有不同的脅迫強(qiáng)度。本研究中C.jacksonii對6PP 抗性顯著弱于C.monteithiana。C.jacksonii種的N8 在6PP 處理下菌絲變粗且頂端生長受到抑制，分支明顯增多且分支短小，其末端局部膨大腫脹。C.monteithiana菌株的N18 菌絲縊縮褶皺，黏連在一起，形成片層狀結(jié)構(gòu)，菌絲干癟變細(xì)。6PP 使得N8 菌絲變粗，導(dǎo)致菌體擴(kuò)張，胞外物質(zhì)大量內(nèi)流，菌體代謝受到影響。而N18 菌絲變細(xì)，與6PP 的接觸面積降低，6PP 的抑菌作用相對較弱。本研究中，6PP 處理后N8 和N18 的SOD 顯著上升，其中N18組SOD 上升率高于N8，這種響應(yīng)程度的差異也很好解釋了N18 比N8 更耐6PP。N8 的POD 活性顯著上升，N18 的POD 活性卻沒有顯著變化，這表明N8 中的ROS 相較于N18 顯著富集，激活了大量的氧化清除反應(yīng)，N8 更容易受到6PP 的脅迫影響[37]。Jin 等[38]在人參銹腐病Cylindrocarpon destructans的研究中發(fā)現(xiàn)外源6PP 會(huì)導(dǎo)致自噬作用相關(guān)基因差異表達(dá)，而本研究中草坪幣斑病菌過氧化、細(xì)胞膜破損等現(xiàn)象也符合自噬作用的特征[39]。

整合本文研究數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)查閱，初步推測了6PP 對兩種不同草坪幣斑病菌的作用過程以及兩種草坪幣斑病菌對6PP 的響應(yīng)，兩種菌對6PP 的抵抗響應(yīng)為6PP 與胞內(nèi)自噬小體結(jié)合過氧化從而導(dǎo)致活性氧的積累，在氧化應(yīng)激下產(chǎn)生MDA，干擾細(xì)胞代謝促使膜脂過氧化，破壞細(xì)胞膜的屏障。當(dāng)草坪幣斑病菌受到6PP 影響，菌體過氧化物積累，菌體防御反應(yīng)啟動(dòng)，表現(xiàn)在抗氧化酶升高、物質(zhì)外排，胞外多糖增加 (圖11)。本研究僅測定了6PP 對草坪幣斑病菌的抑菌活性，還需進(jìn)一步研究明確6PP 抑制草坪幣斑病菌的作用途徑和代謝通路，并開展田間藥效試驗(yàn)，為防治草坪病害提供理論依據(jù)。

圖11 6PP 作用于兩種幣斑病菌的過程以及兩種草坪幣斑病菌對6PP 的響應(yīng)推測圖Fig.11 The proposed model of the 6PP action on dollar spot and the responses of two pathogens to 6PP