陳旺宇 節(jié)笑笑 陳甜甜 張 月 郝旭亮

1.山西省中醫(yī)藥研究院中藥方劑研究所，山西太原 030000；2.山西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，山西晉中 030619；3.山西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山西太原 030000

中醫(yī)藥是我國(guó)特色的醫(yī)學(xué)體系，但中藥成分復(fù)雜，難以闡明其發(fā)揮作用的有效成分，這阻礙了中醫(yī)藥與國(guó)際化接軌，由此確定中藥和方劑的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其體內(nèi)過(guò)程是研究的重點(diǎn)，進(jìn)而加快中醫(yī)藥發(fā)展。中藥血清藥物化學(xué)是通過(guò)口服中藥后先對(duì)血清中的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行分析，再進(jìn)一步確定中藥或方劑的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其體內(nèi)過(guò)程的一種方法[1]，并認(rèn)為給藥后的血清才是真正起作用的“制劑”，即血中移行成分中不一定都是藥物的有效成分，但一定含有其發(fā)揮作用的有效成分[2]。采用中藥血清藥物化學(xué)的方法研究中藥化學(xué)成分，更能闡釋中藥發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。由此本文分析總結(jié)近年來(lái)國(guó)內(nèi)外報(bào)道的相關(guān)文獻(xiàn)，進(jìn)一步歸納中藥血清藥物化學(xué)研究中的關(guān)鍵技術(shù)、應(yīng)用及方法拓展，以期為中藥血清藥物化學(xué)在中醫(yī)藥研究領(lǐng)域中深入應(yīng)用提供參考。

1 血清藥物化學(xué)中的關(guān)鍵技術(shù)

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇

應(yīng)選取與受試藥物、實(shí)驗(yàn)?zāi)康南喾系膭?dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[3]。大鼠因具有采血量大、操作難度小、價(jià)格適中等特點(diǎn)，多數(shù)學(xué)者常以大鼠為研究對(duì)象[4]，也有部分學(xué)者選用與人類代謝行為相同或相似的動(dòng)物作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，如豚鼠、家兔、雞等[5]。通常血中移行成分分析可選用正常狀態(tài)下的動(dòng)物給藥血清，但據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道動(dòng)物正常狀態(tài)與病理狀態(tài)下的同一藥物入血成分存在差異[6]。由于動(dòng)物病理狀態(tài)下與臨床代謝更為相似，血中移行成分更能體現(xiàn)藥物臨床體內(nèi)過(guò)程的特點(diǎn)，研究臨床病理狀態(tài)下血中移行成分可考慮選用病理狀態(tài)下的動(dòng)物模型。

1.2 給藥方案的設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)給藥方案需確定給藥途徑、給藥劑量和給藥次數(shù)，經(jīng)查閱文獻(xiàn)，給藥途徑常按傳統(tǒng)給藥方式進(jìn)行給藥，即口服給藥[7]；給藥時(shí)間和次數(shù)為：①按原方規(guī)定進(jìn)行折算用藥；②單次給予高濃度藥物；③提高給藥劑量，連續(xù)多次給藥[8]。唐娟等[9]采用單次給藥和連續(xù)多次給藥對(duì)含藥血清化學(xué)成分及含藥血清對(duì)人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞系（MH7A）的抑制作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)多次給藥得到的指紋圖譜信息量比單次給藥的豐富，且多次給藥后的含藥血清對(duì)MH7A的抑制作用較單次給藥的含藥血清強(qiáng)。由于藥物代謝存在差異，何為最佳給藥方法，目前尚無(wú)統(tǒng)一認(rèn)識(shí)，因此不同藥物最佳的給藥方法需通過(guò)比較后才能確定。

1.3 血樣的采集

經(jīng)梳理相關(guān)文獻(xiàn)，總結(jié)近年來(lái)血清藥物化學(xué)常用采血方法，見(jiàn)表1[10-15]。可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇適當(dāng)?shù)牟裳椒ā?/p>

表1 血清藥物化學(xué)常用采血方法

不同藥物的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)不同，所以不同的采血時(shí)間會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)造成一定程度影響，若采血時(shí)間過(guò)早，藥物未被完全吸收入血；若采血時(shí)間過(guò)晚，則代謝產(chǎn)物排出體外?？稍谀┐谓o藥后0.5～6 h內(nèi)設(shè)置多個(gè)時(shí)間點(diǎn)采血，比較血清指紋圖譜選擇合適的采血時(shí)間點(diǎn)，或?qū)⒉煌瑫r(shí)間點(diǎn)的血清混合后檢測(cè)，可檢測(cè)到更多入血成分[16]。

1.4 血清樣品的制備及分析方法的選擇

動(dòng)物血清含多種內(nèi)源性物質(zhì)且含量高于待測(cè)物質(zhì)，因此制備血清樣品時(shí)需先進(jìn)行除蛋白等前處理操作后再選用LC-MS、GC-MS等具有高靈敏度、高分辨率等優(yōu)點(diǎn)的技術(shù)進(jìn)行分析，以提高實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性。蛋白處理方法有溶劑法、液-液萃取法，固相萃取法等。常用溶劑法除蛋白，血清中加入3～4倍體積的甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑，超速離心后可除去樣品中的蛋白質(zhì)[17-18]。由于溶劑pH值會(huì)對(duì)血清的處理產(chǎn)生影響，溶劑中加適量酸時(shí)，樣品中一些化學(xué)成分能更好保留，但酸性條件下易分解的成分如苷類等，則不能加酸[19]。且實(shí)驗(yàn)時(shí)為了減少個(gè)體差異，制備血清樣品時(shí)可將同組動(dòng)物血清混合處理后檢測(cè)[20]。

2 血清藥物化學(xué)的應(yīng)用

2.1 闡明藥效物質(zhì)基礎(chǔ)

中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)是指中藥作用于某種疾病后產(chǎn)生的全部藥效成分的總和。闡明中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)解釋中藥在體內(nèi)如何產(chǎn)生作用及其分子機(jī)制至關(guān)重要。血清化學(xué)采用“中藥復(fù)雜化學(xué)成分-血中移行成分-體內(nèi)直接作用物質(zhì)-藥效物質(zhì)”的研究思路，闡明了機(jī)體和藥物之間的相互作用，進(jìn)而揭示藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[21]。Zhou等[22]使用血清藥物化學(xué)技術(shù)分析出21種化學(xué)成分，利用細(xì)胞損傷模型發(fā)現(xiàn)異牡荊素、槲皮素等在細(xì)胞水平表現(xiàn)出心臟保護(hù)作用，這些化合物可能是藏藥參丹松堂的生物活性成分，由此闡明參丹松堂的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制。

2.2 確定中藥質(zhì)量標(biāo)志物

中藥成分復(fù)雜，且常以一種或幾種指標(biāo)成分含量的多少來(lái)評(píng)價(jià)藥物優(yōu)劣，并不能全面反映中藥質(zhì)量，基于此劉昌孝院士提出中藥質(zhì)量標(biāo)志物的概念[23]。采用血清藥物化學(xué)方法尋找血中藥物化學(xué)成分，確定中藥質(zhì)量標(biāo)志物，進(jìn)一步控制中藥質(zhì)量，提高中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，加快中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展。Li等[24]分析玉泉膠囊入血成分，確定其中24個(gè)具有抵抗糖尿病的成分為質(zhì)量標(biāo)志物，為玉泉膠囊質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的建立提供依據(jù)。

3 血清藥物化學(xué)的方法拓展

3.1 血清藥物化學(xué)-網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門基于系統(tǒng)生物學(xué)、基因?qū)W等多學(xué)科理論，運(yùn)用高通量組學(xué)數(shù)據(jù)分析、網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索等技術(shù)，分析疾病發(fā)生機(jī)制、藥物作用靶點(diǎn)的學(xué)科[25]。但中藥應(yīng)用時(shí)常是多種成分的協(xié)同作用，導(dǎo)致部分成分生物利用度發(fā)生變化，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果存在偏差[26]。將血清藥物化學(xué)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)策略相結(jié)合，篩選出直接作用于體內(nèi)的藥物活性成分，直接反映藥理機(jī)制，能有效解決網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果出現(xiàn)偏差的不足之處[27]。Shao等[28]利用血清藥物化學(xué)方法鑒定含藥血清中的化學(xué)成分，確定候選活性成分，再利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)藥物靶點(diǎn)并結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)計(jì)算化合物與蛋白親和力，最終揭示金水還仙方治療肺纖維化的有效成分及機(jī)制。

3.2 血清藥物化學(xué)-分子對(duì)接技術(shù)

分子對(duì)接是通過(guò)分子之間相互識(shí)別的原理，利用計(jì)算機(jī)技術(shù)模擬配體（蛋白質(zhì)、小分子、DNA/RNA）與受體蛋白生物大分子相互結(jié)合，根據(jù)計(jì)算參數(shù)預(yù)測(cè)其結(jié)合模式和親和力的技術(shù)方法[29]。分子對(duì)接技術(shù)已成為計(jì)算機(jī)輔助藥物研究的重要技術(shù)之一，將其與血清藥物化學(xué)交叉融匯運(yùn)用，更能明確藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。鄒釗等[30]通過(guò)血清藥物化學(xué)確定血中移行成分和代謝產(chǎn)物，利用分子對(duì)接技術(shù)對(duì)入血成分進(jìn)行雌激素受體的結(jié)合能計(jì)算，最終明確青鹽方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

3.3 血清藥物化學(xué)-文獻(xiàn)計(jì)量學(xué)

文獻(xiàn)計(jì)量學(xué)通過(guò)數(shù)學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)等方法，定量描述學(xué)術(shù)信息，并結(jié)合統(tǒng)計(jì)分析揭示其數(shù)量特征和內(nèi)在規(guī)律。其可以大量分析綜合性學(xué)術(shù)信息，有利于對(duì)科學(xué)知識(shí)的解讀和研究熱點(diǎn)的挖掘[31]。進(jìn)行血清藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)前利用文獻(xiàn)計(jì)量學(xué)分析藥物更能了解藥物使用現(xiàn)狀，更準(zhǔn)確地達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。聶欣等[32]整合文獻(xiàn)計(jì)量學(xué)、血清藥物化學(xué)及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)辨識(shí)化肝煎關(guān)鍵質(zhì)量屬性，以文獻(xiàn)計(jì)量學(xué)確定化肝煎臨床適應(yīng)證胃炎為切入點(diǎn)，再利用血清藥物化學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)確定藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，最終辨識(shí)化肝煎治療胃炎的關(guān)鍵質(zhì)量屬性。

3.4 方證代謝組學(xué)

中醫(yī)方證代謝組學(xué)是一項(xiàng)整合代謝組學(xué)和血清藥物化學(xué)的技術(shù)，是在方-證對(duì)應(yīng)的前提下評(píng)價(jià)方劑的效應(yīng)，利用血清藥物化學(xué)技術(shù)將內(nèi)源性證候的生物標(biāo)記物與體內(nèi)的外源性方劑成分相關(guān)聯(lián)，揭示方劑藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制[33]。劉紹博等[34]以中醫(yī)方證代謝組學(xué)為研究策略，通過(guò)代謝組學(xué)分析鑒定出26個(gè)血液代謝標(biāo)記物，并在有效狀態(tài)下鑒定有47個(gè)血中移行成分，確定其中11個(gè)成分為知柏地黃丸的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

4 總結(jié)

綜上所述，中藥血清藥物化學(xué)已形成一套較為成熟的方法學(xué)體系，采用中藥血清藥物化學(xué)方法對(duì)中藥及中藥方劑進(jìn)行體內(nèi)外化學(xué)成分研究，分析鑒定血中移行成分，有利于研究藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。但中藥血清藥物化學(xué)仍有不足之處，中藥血清藥物化學(xué)研究時(shí)常選的給藥途徑為口服給藥，但藥物臨床應(yīng)用時(shí)除口服給藥外還有多種給藥途徑，目前對(duì)于其他給藥途徑的相關(guān)研究還未有大量文獻(xiàn)報(bào)道；其次由于個(gè)體差異及藥物代謝速率等因素影響導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差；最后血清中內(nèi)源性物質(zhì)復(fù)雜，藥物進(jìn)入體內(nèi)后經(jīng)吸收、代謝、排泄這一動(dòng)態(tài)變化后血中活性成分相比內(nèi)源性物質(zhì)含量較少，不利于分析[35]。近年來(lái)，血清藥物化學(xué)與多學(xué)科結(jié)合應(yīng)用在一定程度上解決了血清藥物化學(xué)研究中的不足之處，從不同角度更全面、更準(zhǔn)確地闡釋了藥物發(fā)揮臨床作用的有效成分，為中藥的發(fā)展和進(jìn)一步走向國(guó)際化提供新方法、新策略。由此預(yù)見(jiàn)，中藥血清藥物化學(xué)必將在中醫(yī)藥研究中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。