李 夢(mèng)，王 敏，鐘慎杰，邢澤宇，劉振輝

(中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，海洋生物多樣性與進(jìn)化研究所，山東 青島 266003)

清道夫受體(Scavenger receptors, SR)由一個(gè)結(jié)構(gòu)多樣的跨細(xì)胞膜糖蛋白家族組成。根據(jù)蛋白的多個(gè)結(jié)構(gòu)域，它們被分為8個(gè)類別(A～H)[1]。CD36(或稱為脂肪酸轉(zhuǎn)位酶，F(xiàn)AT)屬于B族清道夫受體，具有兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域、一個(gè)胞外環(huán)和兩端較短的胞內(nèi)尾巴[1-4]，是該家族中第一個(gè)被成功鑒定的。它在巨噬細(xì)胞、血小板、脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞中表達(dá)[1]。CD36能與多種配體結(jié)合，包括：天然的、氧化的和乙?；牡兔芏戎鞍譡2,5]；帶負(fù)電的磷脂質(zhì)[6]、長(zhǎng)鏈脂肪酸、血栓反應(yīng)蛋白-1[7]；纖維樣淀粉狀蛋白和凋亡細(xì)胞[8-9]。因此，它與多種生理過程有關(guān)，如血管生成、脂質(zhì)代謝和飲食偏好等[5]。有大量的關(guān)于CD36介導(dǎo)了修飾的LDL內(nèi)吞，其在泡沫細(xì)胞形成、動(dòng)脈粥樣硬化和阿爾茨海默病中作用的研究[1,10-12]。

對(duì)哺乳動(dòng)物CD36的研究發(fā)現(xiàn)，其在先天性免疫和宿主識(shí)別外源性病原體和調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生中具有重要作用[13-17]。CD36已經(jīng)被證實(shí)是識(shí)別脂磷壁酸(LTA)和某些甘油酸二酯的必要輔助受體，能激活TLR2/6(Toll like receptor2/6)[18]。在小鼠巨噬細(xì)胞中敲除Cd36基因，會(huì)減少細(xì)菌誘導(dǎo)的IL-6的分泌[19]。對(duì)于子宮內(nèi)膜異位者，其腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)Cd36表達(dá)量明顯降低，細(xì)胞吞噬功能也有明顯受損[20]。CD36受體可與Src家族中蛋白酪氨酸激酶(PTKs)家族的Fyn、Yes和Lyn 3個(gè)成員結(jié)合，而這3個(gè)成員已被證實(shí)是血小板中參與激活MAPK的上游GTPases[21-22]。也有報(bào)道，CD36以不依賴于TLR2/4的方式通過JNK途經(jīng)介導(dǎo)抗細(xì)菌免疫信號(hào)[13]。此外，在以果蠅為模型的實(shí)驗(yàn)中，CD36家族成員被證明是機(jī)體吞噬微生物和高效清除細(xì)菌所必需的[23-24]。

魚類的生理反應(yīng)與哺乳動(dòng)物有明顯的不同，類似地，魚類免疫反應(yīng)的分子機(jī)制可能也與哺乳動(dòng)物不同[25-27]。事實(shí)上，CD36在魚類免疫反應(yīng)中的確切功能仍是一個(gè)需要進(jìn)一步探究的課題。例如，cd36基因并不在成年鯉魚的免疫器官和細(xì)胞中表達(dá)[28]；但在斑馬魚體內(nèi)cd36被證實(shí)能夠與細(xì)菌結(jié)合[28]，并且敲除cd36基因的斑馬魚幼魚會(huì)更易被細(xì)菌感染[29]。通過本實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)注入鰻弧菌后，突變體斑馬魚(cd36-/-)的活躍度和存活率明顯低于野生型斑馬魚(WT)。在cd36-/-斑馬魚中，與抗原呈遞相關(guān)的基因mhc1和cd8、穿孔素基因perforin、補(bǔ)體系統(tǒng)關(guān)鍵基因c3和細(xì)胞因子基因il4的表達(dá)均明顯下調(diào)。本研究為CD36在魚類抗菌免疫中的功能提供了新證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 斑馬魚和鰻弧菌

實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物均遵循中國(guó)海洋大學(xué)動(dòng)物保護(hù)與使用委員會(huì)制定的倫理準(zhǔn)則(許可證號(hào)碼, SD2007695)。本研究前期利用TALENs技術(shù)從斑馬魚AB系中建立了斑馬魚cd36敲除突變株(cd36-/-)[30]。斑馬魚在標(biāo)準(zhǔn)魚類養(yǎng)殖設(shè)施中飼養(yǎng)和繁殖，并保持L∶D=14 h∶10 h黑暗的光周期。

實(shí)驗(yàn)所用鰻弧菌為中國(guó)海洋大學(xué)張曉華教授所贈(zèng)。菌株在2216E培養(yǎng)液中28 ℃擴(kuò)大培養(yǎng)24 h，4 ℃、8 000g離心20 min收獲，用0.01 mol/L生理鹽水(PBS，pH=7.2)重懸，終濃度1×108CFU/mL。

1.2 鰻弧菌刺激

隨機(jī)抽取突變體(cd36-/-)和野生型(WT)成年斑馬魚每組各10尾(0.40±0.05)g，腹腔注射活鰻弧菌20 μL(1×108CFU/mL)。注射24 h后監(jiān)測(cè)疾病癥狀、活動(dòng)能力和死亡率。該實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)進(jìn)行3次。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

斑馬魚在組織采集前24 h開始禁食。每組隨機(jī)選取3條突變體(cd36-/-)和3條野生型(WT)成年斑馬魚(0.40±0.05)g，每條魚腹腔注射活鰻弧菌20 μL(1×108CFU/mL)。注射后4 h，將每組3條魚的頭腎組織混合并提取RNA，每組準(zhǔn)備3個(gè)獨(dú)立的樣本用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

用RNAiso plus(TaKaRa)試劑盒按說明書指導(dǎo)提取總RNA，用Agilent 2100 RNA Nano 6000試劑盒(Agilent Technologies, CA, USA)檢測(cè)RNA提取質(zhì)量。使用結(jié)合寡核苷酸(dT)的磁珠富集mRNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA片段，通過添加單個(gè)‘A’堿基進(jìn)行末端修復(fù)。連接產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳篩選，PCR擴(kuò)增后送AnnoroadTechnology公司(Beijing, China)通過Illumina HiSeq 4000A平臺(tái)測(cè)序。

測(cè)序結(jié)果結(jié)合local BLAST programsagainst NCBI non-redundant(nr)protein、Swiss-Prot/TrEMBL、Clusters of Orthologous Groups(COG/KOG)、Gene Ontology(GO)和 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)等數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋。

1.4 差異表達(dá)基因(DEGs)鑒定

采用RPKM(Reads per kb per million reads)方法計(jì)算和標(biāo)準(zhǔn)化基因豐度[31]，跨組別的差異表達(dá)基因通過edgeR軟件包鑒別(http://www.r-project.org/)?；虮磉_(dá)變化量≥2倍且錯(cuò)誤率(FDR)>0.05時(shí)，認(rèn)為是顯著表達(dá)。利用GO數(shù)據(jù)庫(kù),通過計(jì)算差異表達(dá)基因參與生物學(xué)過程、細(xì)胞組分、分子功能的超幾何分布，進(jìn)行功能分類注釋和富集分析[32]，最后，用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)獲得代謝通路注釋信息[33]。以上分析均以P<0.05作為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的閾值。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

如前所述，用RNAiso plus試劑盒(TaKaRa)從斑馬魚腸組織中提取總RNA[34]。經(jīng)DNA酶消化處理后，用PrimeScript RT試劑盒和gDNA Eraser試劑(TaKaRa)根據(jù)廠家提供的說明，合成cDNA鏈，同時(shí)加入不含逆轉(zhuǎn)錄酶的樣品作為對(duì)照。合成的cDNA產(chǎn)物在-20 ℃保存待用。

用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)mhc1、cd8、perforin、c3和il4的表達(dá)，根據(jù)基因序列，利用Primer Premier 5.0程序設(shè)計(jì)各基因特異性引物(見表1)。選擇肌動(dòng)蛋白(actin)基因作為內(nèi)標(biāo)參考。cDNA模板定量后，使用Power SYBR Green PCR Master Mix(Takara)在ABI 7500 real-time PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems)上進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)，具體步驟如前所述[35]。采用對(duì)比CT值法計(jì)算mhc1、cd8、perforin、c3和il4相對(duì)于actin基因的表達(dá)水平(2-ΔΔCT)[36]。所有qRT-PCR實(shí)驗(yàn)均樣本均設(shè)置3個(gè)平行樣，并獨(dú)立重復(fù)3次。

表1 文中用到的引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

通過GraphPad Prism 5軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)采用配對(duì)樣本T檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，差異性P<0.05被認(rèn)為是有顯著差異的。所有數(shù)據(jù)均以標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示。

2 結(jié)果

2.1 cd36-/-斑馬魚更易感染鰻弧菌

分別對(duì)突變型(cd36-/-)和野生型(WT)斑馬魚腹腔注射20 μL濃度為1×108CFU/mL的鰻弧菌溶液。感染鰻弧菌后6 h內(nèi)未發(fā)現(xiàn)斑馬魚死亡，但突變體斑馬魚的移動(dòng)性明顯低于野生斑馬魚，且病害癥狀更加嚴(yán)重，主要表現(xiàn)為體表較明顯的紅腫充血(見圖1(A))。注射后7 h，突變體開始死亡，而野生斑馬魚在注射后8.5 h開始死亡。因此注射后8.5 h，突變體斑馬魚的存活率明顯低于野生斑馬魚(見圖1(B))。

圖1 突變體(cd36-/-)和野生型(WT)斑馬魚在被鰻弧菌攻擊后的發(fā)病癥狀(A)及存活率(B)比較(n=10)

2.2 鰻弧菌刺激cd36-/-和野生斑馬魚后，對(duì)差異表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄組分析

為了探討cd36在免疫過程中的分子機(jī)制，本文作者取腹腔注射了濃度為1×108CFU/mL鰻弧菌菌液的野生型和cd36-/-斑馬魚的頭腎組織，進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。FPKM(Fragments per kilobase per millon mapped fragments)即每百萬片段中來自某一基因每千堿基長(zhǎng)度的片段數(shù)目被用來評(píng)估cd36-/-與野生斑馬魚的基因表達(dá)量是否滿足分析要求。通過分析發(fā)現(xiàn)，與野生型斑馬魚相比，突變體中有1 517個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，3 801個(gè)基因表達(dá)下調(diào)(見圖2(A))。為了更好地了解差異表達(dá)基因在免疫過程中的作用，本文作者對(duì)這些基因進(jìn)行了GO和KEGG富集分析。

GO注釋數(shù)據(jù)庫(kù)可以對(duì)突變型和野生型樣本的差異表達(dá)基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，按照功能被分為三方面，分別為生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能。與野生型斑馬魚相比，突變體中的差異表達(dá)基因主要與細(xì)胞過程、生物調(diào)節(jié)、代謝過程和應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)(見圖2(B))。圖3(A)顯示了通過GO富集分析后，被挑選出的與免疫過程相關(guān)的差異表達(dá)基因。這些基因在防御反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，值得注意的是，在28個(gè)差異表達(dá)基因中有7個(gè)基因被歸類到T淋巴細(xì)胞的免疫過程中(見圖3(A)、表2)。這表明cd36可能參與了調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫。

表2 通過GO富集分析挑選出的與免疫系統(tǒng)相關(guān)的差異表達(dá)基因(cd36-/- vs WT)

((A)差異表達(dá)基因的數(shù)量。(B)GO注釋數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)樣本的差異表達(dá)基因按照生物學(xué)過程的功能進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。紅色表示差異表達(dá)上調(diào)基因占總差異表達(dá)上調(diào)基因的比例；綠色表示差異表達(dá)下調(diào)基因占差異表達(dá)總下調(diào)基因的比例。(1)生殖；(2)細(xì)胞殺傷；(3)免疫系統(tǒng)過程；(4)行為；(5)代謝過程；(6)細(xì)胞增殖；(7)細(xì)胞過程；(8)氮利用；(9)生殖過程；(10)生物黏附；(11)信號(hào)；(12)多細(xì)胞生物過程；(13)發(fā)育過程；(14)生長(zhǎng)；(15)運(yùn)動(dòng)；(16)色素沉積；(17)節(jié)律過程；(18)刺激反應(yīng)；(19)定位；(20)多有機(jī)體過程；(21)生物調(diào)節(jié)；(22)細(xì)胞組成的組織或生物發(fā)生；(23)細(xì)胞聚集；(24)解毒作用；(25)參與化學(xué)突觸傳遞的突觸前過程。(A)The count of the differential expressed genes.(B)GO analysis of differentially expressed genes.The DEGs were enriched in GO biological process.Red stands for the proportion of differentially expressed up-regulated genes to the total differentially expressed up-regulated genes; Green stands for the proportion of differentially expressed down-regulated genes to the total differentially expressed down-regulated genes.(1)Reproduction;(2)Cell killing;(3)Immune system process;(4)Behavior;(5)Metabolic process;(6)Cell proliferation;(7)Cellular process;(8)Nitrogen utilization;(9)Reproductive process;(10)Biological adhesion;(11)Signaling;(12)Multicellular organismal process;(13)Developmental process;(14)Growth;(15)Locomotion;(16)Pigmentation;(17)Rhythmic process;(18)Response to stimulus;(19)Localization;(20)Multi-organism process;(21)Biological regulation;(22)Cellular component organization or biogenesis;(23)Cell aggregation;(24)Detoxification;(25)Presynaptic process involved in chemical synaptic transmission.)

((A)28個(gè)差異表達(dá)中有7個(gè)基因被歸類到T淋巴細(xì)胞的免疫過程中(圖中下劃線示出)。(B)—(F)在鰻弧菌的攻擊下，突變體(cd36-/-)和野生型(WT)斑馬魚頭腎組織中mhc1uba(B)、cd8(C)、perforin(D)、c3(E)和il4(F)基因表達(dá)量的比較。(A)7/28 of the DEG genes were assigned to the immune process of T lymphocyte(Underlined part in this figure).(B)—(F)Comparison of the expression of mhc1uba(B), cd8(C), perfoin(D), c3(E)and il4(F)in intestinal tissues between the mutant type(cd36-/-)and wild type(WT)zebrafish challenged by Vibrio anguillarum.)

通過KEGG分析找出差異性顯著的基因富集的信號(hào)通路，與野生斑馬魚相比，突變體斑馬魚中差異表達(dá)較明顯的基因主要富集在補(bǔ)體系統(tǒng)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、細(xì)胞因子之間的相互作用和病毒致癌機(jī)理等與免疫相關(guān)的信號(hào)途徑中(見圖4)，反映了cd36在免疫應(yīng)答中起到調(diào)節(jié)作用。

圖4 差異表達(dá)基因的12條信號(hào)通路KEGG分析

2.3 cd36-/-斑馬魚的mhc1uba、cd8、穿孔素、c3和il4基因表達(dá)下調(diào)

本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)，cd36基因敲除對(duì)斑馬魚免疫相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)生影響。與野生型(WT)斑馬魚相比，突變型(cd36-/-)斑馬魚的抗原提呈相關(guān)基因mhc1uba和cd8、穿孔素基因、補(bǔ)體系統(tǒng)關(guān)鍵基因c3和細(xì)胞因子基因il4的表達(dá)水平顯著下調(diào)(見圖3(B)—(F))。

3 討論

目前對(duì)cd36免疫功能的研究主要以哺乳動(dòng)物為研究對(duì)象，探究了cd36在識(shí)別、遞呈、吞噬和清除細(xì)菌方面的功能。例如，過表達(dá)cd36的HEK293T細(xì)胞與金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的結(jié)合能力分別提高了3和2倍[16]；在小鼠巨噬細(xì)胞中過表達(dá)cd36也增強(qiáng)了對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的攝取，產(chǎn)生了更高水平的tnf-α和mip-2，增強(qiáng)了下游免疫因子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)和巨噬細(xì)胞的吞噬作用,因而認(rèn)為CD36是細(xì)菌的吞噬受體[13,24]；另外，cd36基因敲除小鼠在攝取凋亡巨噬細(xì)胞方面存在明顯缺陷[37]。而關(guān)于cd36抗細(xì)菌免疫的功能在魚類中的報(bào)道較少。2015年，F(xiàn)ink等發(fā)現(xiàn)cd36基因并不在鯉魚的免疫器官和免疫細(xì)胞中表達(dá)，似乎顯示其與免疫功能關(guān)系不大[27]；但同時(shí)他們又發(fā)現(xiàn)cd36卻在斑馬魚的免疫細(xì)胞中表達(dá)，且敲降cd36的斑馬魚清除細(xì)菌的能力下降[27]。后者與本研究在斑馬魚中的研究結(jié)果一致。

本文作者前期的研究發(fā)現(xiàn)，cd36基因在斑馬魚的免疫組織中有表達(dá)，且CD36可與細(xì)菌結(jié)合[29]，表明斑馬魚CD36可能參與抗細(xì)菌免疫。在本研究中，用鰻弧菌攻擊斑馬魚發(fā)現(xiàn)，與野生型斑馬魚相比，cd36基因敲除斑馬魚發(fā)病速度更快，細(xì)菌感染病癥更明顯，存活率更低，進(jìn)一步證明CD36參與了斑馬魚的抗細(xì)菌免疫，發(fā)揮正向調(diào)控作用。這與CD36在哺乳動(dòng)物中的識(shí)別細(xì)菌和調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生功能相一致，揭示了CD36在抗細(xì)菌免疫反應(yīng)中的保守性。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，在鰻弧菌感染的條件下，敲除cd36基因引起了斑馬魚大量基因表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)。這些差異表達(dá)的基因主要富集在補(bǔ)體系統(tǒng)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、細(xì)胞因子之間的相互作用和病毒致癌機(jī)理等信號(hào)途徑中。腹腔注射鰻弧菌后，通過實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)檢測(cè)，cd36基因敲除斑馬魚中mhc1uba、cd8、il4、c3和穿孔素(perfoin)的基因表達(dá)量明顯低于野生型斑馬魚。在免疫過程中，MHC1和CD8在向殺傷性T細(xì)胞呈遞抗原中發(fā)揮重要作用；白細(xì)胞介素IL4能刺激活化B細(xì)胞和T細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)B細(xì)胞的抗原提呈能力；C3是先天免疫補(bǔ)體系統(tǒng)的關(guān)鍵因子；穿孔素主要儲(chǔ)存在細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)和自然殺傷細(xì)胞(NK)的胞漿顆粒中，是殺傷靶細(xì)胞的主要效應(yīng)分子。據(jù)此可以推測(cè)，CD36可能通過調(diào)控斑馬魚的先天性免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng),尤其可能通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫而發(fā)揮抗細(xì)菌免疫作用。本研究為進(jìn)一步研究CD36在免疫防御中的作用及分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。