趙逸卿 陳士國 張慧杰 葛曉雨 楊 蕊 張藝靈 馬瑞鵬 丁文靜 郭紹芬*

（1臨沂大學(xué)藥學(xué)院，山東臨沂 276005；2浙江大學(xué)山東（臨沂）現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究院，山東臨沂 276005；3臨沂市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東臨沂 276005）

金銀花又名雙花和忍冬，為忍冬科忍冬屬植物。忍冬的干燥花蕾或初開的花是歷史悠久的中藥，具有清熱解毒和疏散風(fēng)熱等療效[1]。金銀花含有黃酮類、酚酸類、揮發(fā)油類、環(huán)烯醚萜苷類和三萜皂苷類等化學(xué)成分，在臨床有解熱抗炎、抗菌、抗氧化、抗病毒、增強免疫和護肝利膽等藥理作用[2-4]，其中酚酸類成分為金銀花抗病毒主要成分，且具有抗氧化、抑菌[5]和抗炎[6]等作用。金銀花中所含的酚酸類成分主要是綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C等[7-8]，其中綠原酸含量是金銀花質(zhì)量控制的一種指標(biāo)[9]。綠原酸也是金銀花表現(xiàn)生物活性的一種關(guān)鍵有機物，抗病毒和保肝利膽等臨床效果顯著，應(yīng)用較為廣泛，相關(guān)研究也比較深入[10]。因此，從金銀花中提取酚酸類成分以及提高酚酸類成分的提取率有重大意義。

本研究以6種不同基源的金銀花為原料，分別為紅花、線花、大毛花、北花一號、四季花、九豐一號。使用不同極性的溶劑進(jìn)行加熱回流提取，通過高效液相色譜測定每種金銀花提取物的酚酸類成分含量，從而探究不同極性溶劑對金銀花中酚酸類成分提取率的影響，為進(jìn)一步提高酚酸類成分提取率提供理論依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 供試品

供試品包括紅花、線花、大毛花、北花一號、四季花，九豐一號，符合《中華人民共和國藥典（2020版）》中關(guān)于中藥金銀花的規(guī)定。

1.2 材料與試劑

乙醇、磷酸、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿和石油醚用分析級，購自天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；乙腈和甲醇用色譜級，購自美國天地公司；超純水，綠原酸，異綠原酸A和異綠原酸C均為標(biāo)準(zhǔn)品，購自上海藍(lán)季科技有限公司。

2 試驗方法

精密稱取綠原酸對照品適量，置于棕色量瓶中，加50%甲醇搖勻制成每含0.4 mg/mL的溶液。

精密稱取異綠原酸A對照品和異綠原酸C對照品適量，置于棕色量瓶中，加50%甲醇搖勻制成每含0.15 mg/mL和每含44 mg/mL的溶液。

2.1 樣品溶液制備

將6種不同基源金銀花凈選，除去葉和葉柄等雜質(zhì)，稱取50 g金銀花研碎，置于圓底燒瓶中，加入提取溶劑，使提取溶劑液面沒過金銀花，于圓底燒瓶中浸泡40 min，加熱回流1 h，傾出上清液，再次加入提取溶劑加熱回流40 min，合并濾液，抽濾，50℃旋蒸至適量體積，轉(zhuǎn)移至水浴鍋中加熱揮發(fā)得到金銀花提取物浸膏，稱重備用。

2.2 高效液相色譜法測綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C含量

檢測儀器為Agilent 1260高效液相色譜儀，色譜柱為Ultimate C18(4.6 mm×150 mm,5μm)，流動相為乙腈-0.4%磷酸溶液等梯度洗脫，乙腈為0.4%磷酸溶液=14∶86，流速為0.7 mL/min，檢測波長327 nm，進(jìn)樣量10μL。綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C采用外標(biāo)一點法[11]進(jìn)行含量計算，計算公式如下：

式中C為標(biāo)準(zhǔn)品濃度；A1為標(biāo)準(zhǔn)品峰面積；A2為供試品峰面積；V為容量瓶體積；M1為供試品質(zhì)量；M2為總浸膏質(zhì)量；M3為稱取的金銀花總質(zhì)量。

3 數(shù)據(jù)分析

本研究數(shù)據(jù)以平均值為計算值，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0軟件和Origin 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

4 結(jié)果與分析

4.1 不同極性溶劑對酚酸類成分提取率的影響

用不同極性溶劑對6種基源的金銀花中酚酸類成分進(jìn)行提取。由圖1可知，不同極性溶劑對綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C的提取率有顯著性的差異（P＜0.01）。極性較大溶劑如水和乙醇等提取率較高，可有效提高綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C的溶出量，而極性較小溶劑如乙酸乙酯、氯仿和石油醚提取率較低，不利于綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C的溶出。因此，水和乙醇均可作為最佳的提取溶劑，與劉金磊等[12]研究結(jié)果一致，原因可能是綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C是極性較大的酚酸，根據(jù)相似相溶原理，更易溶解在水和乙醇。

圖1 不同溶劑對6個品種金銀花的綠原酸，異綠原酸A和異綠原酸C的提取率

4.2 水和乙醇提取對酚酸類成分提取率的影響

用水和乙醇提取6種不同基源金銀花中的酚酸類成分。由圖2可知，不同基源的金銀花中的綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C對水和乙醇的溶出量不同。對于綠原酸，紅花和四季花在以水和乙醇為溶劑的提取下，綠原酸含量無顯著性差異（P＞0.05），其他4種基源的金銀花在以水和乙醇為溶劑的提取下，綠原酸均具有顯著性差異（P＜0.02），其中北花一號在以乙醇為提取溶劑時，綠原酸提取率最高，為2.598%。對于異綠原酸A，大毛花在以水和乙醇為溶劑的提取下異綠原酸A無顯著性差異（P＞0.05），其他5種基源的金銀花在以水和乙醇為溶劑的提取下，綠原酸均具有顯著性差異（P＜0.02），其中九豐一號在以水為提取溶劑時，異綠原酸A的提取率最高，為5.969%。對于異綠原酸C，北花一號在以水和乙醇為溶劑的提取下，綠原酸無顯著性差異（P＞0.05），其余5種基源的金銀花在以水和乙醇為溶劑的提取下，綠原酸均具有顯著性差異（P＜0.01），其中九豐一號在以水為提取溶劑時，異綠原酸C的提取率最高，為2.273%。原因可能是綠原酸屬于有機弱酸，多以離子形式溶解在水溶液中，以分子形式溶解于乙醇溶液中，高溫時綠原酸分子電離率增加并使其更易溶解于水中，在乙醇中的溶解度相對變小[13]。因此，線花和大毛花中的綠原酸在以水為提取溶劑時的提取率相較于以乙醇為提取溶劑時高。但是，高溫還會導(dǎo)致綠原酸的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，可能會使其他物質(zhì)溶出，相對降低了綠原酸的提取率[14]。因此，其他物質(zhì)溶出的影響使得北花一號和九豐一號等品種的綠原酸在水中提取率低于在乙醇中的提取率。異綠原酸類化合物極性較大，溶于水和乙醇中，但是異綠原酸A的活化能為96.71 KJ/mol，其在中性水溶液中的降解反應(yīng)對于溫度較為敏感[15]，造成異綠原酸A的提取率下降，對于異綠原酸A含量少的紅花、線花和四季花尤為顯著，使得乙醇提取的異綠原酸A含量高于水提取的異綠原酸A含量，而對于異綠原酸A含量較高的北花一號和九豐一號影響較小，使得水提取的異綠原酸A含量高于乙醇提取的異綠原酸A含量。異綠原酸C的極性更接近于水，根據(jù)相似相溶原理，異綠原酸C的在水中的溶解度要高于在乙醇中的溶解度。

圖2 水和乙醇對6個品種金銀花的綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C的提取率

5 結(jié)論

本文通過使用6種不同極性溶劑對同種金銀花酚酸類物質(zhì)進(jìn)行回流提取，探究其酚酸類物質(zhì)綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C含量變化，結(jié)果表明，不同溶劑對金銀花的酚酸類成分溶出量具有顯著影響（P＜0.01），其中以水和乙醇為提取溶劑的提取率高于其他3種溶劑，因此可選擇水和乙醇作為最佳提取溶劑。同時考察了同種溶劑對6種基源不同的金銀花中酚酸類成分提取率的影響，結(jié)果表明在以水為提取溶劑的條件下，大毛花的綠原酸提取率最高，可達(dá)1.40%；水提九豐一號的異綠原酸A和C的提取率最高，可達(dá)5.969%和2.273%；以乙醇為提取溶劑，九豐一號的異綠原酸A和C的提取率最高，可達(dá)1.76%和0.52%，顯著高于2醇提其他基源的金銀花；2醇提北花一號的綠原酸的提取率最高，可達(dá)2.598%。

綜上所述，可選取水和乙醇作為金銀花酚酸類成分提取的最佳溶劑，其不僅可以最大限度提取酚酸類物質(zhì)，相比其他3種有機溶劑也更為經(jīng)濟環(huán)保。乙醇對綠原酸的提取率更高，水對于異綠原酸A和C的提取率更高，因此可以將乙醇作為溶劑來提取金銀花中的綠原酸，水為溶劑提取異綠原酸A和C。而對于6種基源不同的金銀花來說，無論是在水還是乙醇為溶劑的條件下，九豐一號具有顯著性優(yōu)勢，其酚酸類成分提取率顯著高于其他品種，本次研究有助于后續(xù)進(jìn)一步開發(fā)九豐一號的經(jīng)濟與使用價值。