姚軼俊，鞠興榮，王立峰

蕎麥多酚干預(yù)對高脂膳食誘導(dǎo)小鼠的降脂作用及其調(diào)控機制

姚軼俊，鞠興榮，王立峰

南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210023

【背景】目前已有相關(guān)動物實驗證實蕎麥對于高脂膳食引起的肥胖和脂代謝紊亂具有良好的干預(yù)作用。同時研究表明，棕色脂肪適應(yīng)性產(chǎn)熱可以有效改善人體能量新陳代謝。因此，增加棕色脂肪活性、促進白色脂肪棕色化可作為一種預(yù)防肥胖和改善能量代謝疾病的有效途徑。【目的】采用原糧及從蕎麥中鑒定出的4種主要酚類物質(zhì)按在原糧中的含量比例配制成多酚干預(yù)物進行干預(yù)，研究蕎麥多酚通過調(diào)節(jié)白色脂肪棕色化對高脂膳食小鼠的干預(yù)及改善作用，系統(tǒng)研究蕎麥中發(fā)揮降脂功能的主要酚類物質(zhì)及其對脂代謝的調(diào)控機制?！痉椒ā客ㄟ^UHPLC-Q-Orbitrap質(zhì)譜結(jié)合數(shù)據(jù)庫對蕎麥多酚提取物中的酚類物質(zhì)進行鑒定，并通過相對定量將其中含量最多的主要多酚按其在蕎麥原糧中的含量比例配制成多酚復(fù)合物。通過添加蕎麥飼料以及蕎麥多酚復(fù)合物干預(yù)C57BL/6J小鼠飲食，研究蕎麥酚類物質(zhì)改善脂質(zhì)代謝的作用。以10%、20%、40%比例的蕎麥替換基礎(chǔ)飼料和2.5 mg?mL-1蕎麥多酚復(fù)配物對小鼠進行飲食干預(yù)，探究蕎麥對小鼠體重、臟器指數(shù)和血脂水平的調(diào)節(jié)作用。并通過Western-blot和q-PCR探究蕎麥飼料及多酚干預(yù)對小鼠皮下脂肪組織中與產(chǎn)熱相關(guān)的蛋白及基因表達的影響?！窘Y(jié)果】通過UHPLC-Q-Orbitrap質(zhì)譜鑒定出蕎麥多酚提取物中的20種酚類化合物，其中含量最高的4種酚類化合物羥基肉桂酸、槲皮素、濱蒿內(nèi)酯和蘆丁含量達到酚類總量的80%以上，為蕎麥中的主要酚類物質(zhì)。在飲食干預(yù)39 d后，與高脂飲食組相比，添加蕎麥飼料以及蕎麥多酚干預(yù)對小鼠的體重、肝臟指數(shù)以及血清中甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白、谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶的增加有顯著的抑制作用，并且隨著蕎麥添加量的提高，其抑制作用也增加。同時，添加蕎麥飼料以及蕎麥多酚干預(yù)對小鼠腎臟指數(shù)、高密度脂蛋白的降低起到了保護和改善的作用。高劑量40%蕎麥和多酚干預(yù)組的效果最好，表明蕎麥飲食干預(yù)對高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖小鼠脂代謝異常的改善是其中的酚類物質(zhì)發(fā)揮了主要作用。與正常飲食組相比，高脂飲食組中與棕色脂肪相關(guān)的UCP1、PRDM-16和PGC-1α蛋白表達水平顯著降低，而與白色脂肪特異性表達的Tcf21和HOXC8水平顯著上調(diào)（＜0.05）。飲食干預(yù)后，蕎麥干預(yù)組中UCP1、PRDM-16和PGC-1α的蛋白表達水平均顯著上調(diào)，Tcf21和HOXC8的蛋白表達均顯著下降（＜0.05）。此外，40%蕎麥和多酚干預(yù)組還有效地提高了小鼠皮下脂肪組織中和的表達（＜0.05），并下調(diào)和的表達?！窘Y(jié)論】蕎麥干預(yù)可以有效改善高脂飼料誘導(dǎo)小鼠脂代謝紊亂情況，并證實了蕎麥多酚在其中發(fā)揮了主要作用，其作用機理主要是蕎麥多酚可以顯著提高棕色脂肪產(chǎn)熱活性，同時下調(diào)白色脂肪特異性表達，調(diào)節(jié)能量代謝平衡，改善高脂飲食誘導(dǎo)的高脂血癥和能量代謝紊亂。研究結(jié)果為蕎麥的利用和相關(guān)降脂功能食品的開發(fā)提供了新的研發(fā)思路和理論依據(jù)。

蕎麥；多酚；高脂膳食小鼠；降脂作用；白色脂肪棕色化

0 引言

【研究意義】近年來，肥胖已經(jīng)成為一個國際性的公共問題，增加了大部分國家及地區(qū)的疾病風(fēng)險[1-2]。肥胖與很多慢性代謝疾病密切相關(guān)，如高血壓、心血管疾病、炎癥、Ⅱ型糖尿病和癌癥[3-4]。因此，預(yù)防和治療肥胖癥正受到越來越多研究人員的關(guān)注。由于人體脂肪組織主要分為白色脂肪和棕色脂肪兩種。白色脂肪負責(zé)儲存能量；棕色脂肪負責(zé)適應(yīng)性產(chǎn)熱以消耗能量，在調(diào)節(jié)能量平衡中起重要作用，它的適應(yīng)性產(chǎn)熱可以有效改善人體能量新陳代謝。因此，激活棕色脂肪，下調(diào)白色脂肪特異性表達可作為一種預(yù)防高脂血癥和改善能量代謝疾病的有效途徑[5]。越來越多的雜糧及其功能性成分被證明具有減輕血脂異常，減輕炎癥并治療肥胖等生物活性功能[6-7]，在一定條件下可干預(yù)白色脂肪向棕色轉(zhuǎn)變（獲得棕色脂肪表型、具有產(chǎn)熱效能），發(fā)揮拮抗肥胖形成的作用[8]。利用天然食品誘導(dǎo)白色脂肪棕色化在肥胖防治中具有可行性和現(xiàn)實意義。【前人研究進展】蕎麥中富含具有生物活性功能的酚類化合物，包括酚酸、香豆素、單寧酸、黃酮類化合物、烷基間苯二酚等，具有降糖、降脂、降膽固醇、抗氧化、抗衰老和清除自由基的功能[9]。蕎麥多酚一般分布于殼及種皮中，由于分子內(nèi)的苯環(huán)上一個或多個氫原子被羥基及其衍生物取代，因此其作為良好的電子供體具有很好的功能活性[10]。相關(guān)研究已鑒定出苦蕎中含有松柏醇、丁香酸、阿魏酸、丁香脂素等酚類化合物，并且這些酚類化合物都具有顯著的抗氧化活性，顯示出了良好的調(diào)節(jié)糖脂代謝能力[11]。此外，越來越多的酚類物質(zhì)被證明具有誘導(dǎo)白色脂肪棕色化作用，如相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)絞股藍皂苷可通過調(diào)節(jié)PGC-1α和PRDM-16的表達來提高棕色脂肪活性，從而增加脂代謝異常的能量消耗[8]；姜黃素可通過減輕白色脂肪炎癥并提高線粒體解偶聯(lián)蛋白1（UCP1）的表達來維持能量代謝穩(wěn)態(tài)[12]。作為棕色脂肪線粒體中的解偶聯(lián)蛋白，UCP1在產(chǎn)熱脂肪細胞中起著重要的作用，并通過非顫抖性產(chǎn)熱來消耗能量[13]。PGC-1α是與能量代謝密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄輔助活化因子，可調(diào)控線粒體生物合成并提高能量代謝[14]。PRDM-16作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，促進白色脂肪轉(zhuǎn)化為棕色脂肪前體細胞[15]。而和是白色脂肪細胞特異性基因[16]。【本研究切入點】目前，已有相關(guān)動物實驗證實蕎麥對于高脂膳食引起的肥胖和脂代謝紊亂具有良好的干預(yù)作用；同時，對于酚類化合物基于白色脂肪棕色化調(diào)節(jié)脂代謝作用機制的相關(guān)研究也有報道。但是還未見蕎麥及其主要酚類物質(zhì)對于高脂膳食誘導(dǎo)肥胖小鼠的干預(yù)及其作用機制的系統(tǒng)研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究利用UHPLC-Q-Orbitrap質(zhì)譜對蕎麥多酚進行鑒定，并將其中4種主要酚類物質(zhì)按原糧含量比例配制成多酚干預(yù)物，利用動物實驗研究蕎麥及其酚類物質(zhì)對高脂膳食誘導(dǎo)肥胖小鼠的干預(yù)及改善作用；并進一步通過研究其對激活棕色脂肪，下調(diào)白色脂肪特異性表達相關(guān)的蛋白與基因的影響揭示蕎麥及其多酚調(diào)節(jié)脂代謝的作用機制，為進一步提高蕎麥資源的營養(yǎng)價值提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2020年在南京財經(jīng)大學(xué)進行。

1.1 試驗材料與試劑

蕎麥（大三棱，市售），購于山西東方亮生命科技有限公司?；A(chǔ)飼料（蕎麥、動植物蛋白、油脂、必需氨基酸、復(fù)合維生素、礦物質(zhì)），購于江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司。實驗動物，健康雄性C57BL/6J小鼠36只，6—8周齡，普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，根據(jù)體重隨機分組，每籠6只。

羥基肉桂酸、槲皮素、濱蒿內(nèi)酯、蘆丁標(biāo)準品，購于Sigma-Aldric；甘油三酯（TC）檢測試劑盒、總膽固醇（TG）檢測試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）檢測試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）檢測試劑盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）檢測試劑盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）檢測試劑盒，購于碧云天生物科技研究所；通用型組織固定液，購于武漢塞維爾生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑、SYBR qPCR試劑、BCA蛋白濃度測定試劑盒、PI蛋白酶抑制劑購于美國Thermo Fisher生物科技有限公司；RIPA裂解液、30%丙烯酰胺，購于生工生物工程（上海）股份有限公司；其他分析試劑購于南京化學(xué)試劑公司。

數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；ALpHA2-4型真空冷凍干燥機，德國Christ公司； M2e多功能酶標(biāo)儀，美國分子儀器公司；AL204分析天平，德國梅特勒托利多公司；Gel Doc XRS+凝膠成像系統(tǒng)、Mini Trans-Blot電轉(zhuǎn)印單元、Mini-P4微型垂直電泳儀，美國Bio-Rad公司；7500 Real-Time PCR儀、RNA濃度測定儀、QE HF-X質(zhì)譜儀、Vanquish UHPLC色譜儀、Accucore Vanquish C18 column色譜柱、ST16R低溫離心機，美國Thermo Fisher生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 蕎麥多酚的提取 取蕎麥20 g，加蒸餾水180 mL于器皿中，用電磁爐以1 800 w功率加熱，待水開始沸騰后蒸煮25 min，并在蒸煮后關(guān)掉電磁爐再燜制10 min。冷卻至室溫后用料理機勻漿3 min后取20 mL，10 000 r/min離心10 min取上清液，再分別按照體積比1﹕1加入80%乙醇除去剩余的蛋白和多糖，10 000 r/min離心10 min取上清液，40℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮除去有機溶劑，凍干后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基于UHPLC-Q-Orbitrap質(zhì)譜對蕎麥多酚組成的鑒定 取100 mg蕎麥多酚提取物置于EP管中，以400 μL的80%甲醇進行溶解，渦旋震蕩，14 000×、4℃離心15 min，取上清液進樣UHPLC-Q-Orbitrap質(zhì)譜分析。

色譜條件：柱溫40℃，流速0.3 mL?min-1，正離子模式，流動相A：0.1%甲酸、95%乙腈、10 mmol?L-1醋酸銨；流動相B：0.1%甲酸、50%乙腈、10 mmol?L-1醋酸銨洗脫程序見表1。

質(zhì)譜條件：掃描范圍選擇m/z 100—1 500；ESI源的設(shè)置如下：Spray Voltage：3.2 kV；Sheath氣流量：35 arb；Aux氣流量：10 arb；溫度：320℃。正離子模式；MS/MS二級掃描為data-dependent scans。

表1 色譜梯度洗脫程序

1.2.3 動物分組喂養(yǎng) 健康雄性C57BL/6J小鼠，6—8周齡，普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，根據(jù)體重隨機分及組：①對照組（Control，Con），②基礎(chǔ)高脂組（high fat diet，HFD），③多酚給藥組（Treat），④10%蕎麥高脂組，⑤20%蕎麥高脂組，⑥40%蕎麥高脂組。每籠6只，在溫度（22±2）℃，濕度（55±5）%，12 h/12 h的晝夜交替環(huán)境下飼養(yǎng)，每籠小鼠每日食用飼料配方按照表2配制，飼料量限定為（20±1）g。基礎(chǔ)飼料詳細成分如表2所示，高脂飼料及蕎麥飲食干預(yù)組飼料配方如表3所示。多酚干預(yù)組基肉桂酸、槲皮素、濱蒿內(nèi)酯、蘆丁質(zhì)量比12﹕2﹕2﹕1。同時根據(jù)本筆者實驗室前期研究中細胞試驗結(jié)果（當(dāng)多酚濃度為2.5 mg?mL-1時具有最佳的降脂功效[17]），本試驗中所配制的多酚干預(yù)物濃度為2.5 mg?mL-1。按每2 d灌喂一次，每3 d稱一次體重，飼養(yǎng)13周收集完糞便后處死小鼠，收集血液，室溫靜置40 min后，在離心機中3 500 r/min離心15 min，分離出血清，取肝臟、腎臟、心臟、胰腺以及皮下脂肪稱重，計算臟器系數(shù)。肝臟組織除用于病理觀察外，分成兩部分，與皮下脂肪分別包于錫箔紙放進液氮壺中，隔夜取出于-80℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

表2 基礎(chǔ)飼料主要成分

表3 各組動物飼料主要配方

1.2.4 血清指標(biāo)檢測 本試驗采用眼球血清來測定各組小鼠的血清生化指標(biāo)。檢測的血清指標(biāo)及使用的試劑盒分別為：總甘油三酯（TG），索萊寶BC0620；總膽固醇（TC），索萊寶BC1980；高密度脂蛋白（HDL-C），建成A112-1；低密度脂蛋白（LDLC），建成A113-1；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT），原葉；谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST），原葉。所有血清指標(biāo)測定均按照試劑盒說明書進行。

1.2.5 肝臟組織病理切片及HE染色 隨機選擇小塊肝臟，并在10%中性甲醛溶液中固定24 h后用水洗凈。然后經(jīng)乙醇梯度脫水，流程為：50%乙醇（30 min），70%乙醇（30 min），85%乙醇（30 min），95%乙醇（30 min），100%乙醇（30 min）。脫水后，用二甲苯對其進行透明處理以去除脫水劑。最后，將其包埋在石蠟中以制備組織切片（平均厚度約為5 μm），以備HE染色并觀察病理學(xué)形態(tài)。HE染色流程為：（1）脫蠟：二甲苯脫蠟，兩次，每次10 min。（2）水化：用梯度為100%、95%、85%、70%、50%乙醇洗滌，再用去離子水沖洗5 min。（3）染色：蘇木精染色10 min，水洗5 min；1%鹽酸乙醇分化30 s，水洗30 s；去離子水洗5 s，0.5%伊紅液染色2 min，去離子水洗1 min。（4）脫水、透明：經(jīng)70%乙醇（1 min），85%乙醇（1 min），95%乙醇（3 min），100%乙醇（3 min），100%乙醇（3 min）梯度脫水，再經(jīng)二甲苯浸泡10 min。（5）封片：以中性樹膠封固[18]。

1.2.6 小鼠皮下脂肪組織總蛋白提取及蛋白定量 每組取4只小鼠皮下脂肪組織各約20 mg，加入含有終濃度為1 mmol?L-1PMSF的RIPA裂解液100 μL冰上裂解30 min。裂解完成后，在4℃下，以12 000×離心5 min。將上清液轉(zhuǎn)移至微量離心管中，-20℃保存待用。采用Thermo的BCA蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白定量。

1.2.7 Western Blot蛋白表達的檢測 取一定量的蛋白樣品與上樣緩沖液混合，95—100℃煮沸5 min。將蛋白加入10%聚丙烯凝膠電泳進行分離。濃縮膠：80 V，30 min；分離膠：120 V，60 min。電泳結(jié)束后將分離膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜條件為：320 mA，60 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用封閉液（20 mL TBST、1 g脫脂奶粉）將膜封閉1 h，后用合適的稀釋一抗，4℃孵育過夜。然后將膜自一抗稀釋液中取出，用TBST洗滌4次，每次6 min。隨后將膜用合適的稀釋二抗室溫孵育1 h。二抗孵育完畢后，將膜用TBST洗4次，每次6 min。最后用ECL系統(tǒng)進行曝光，測定目標(biāo)蛋白。

1.2.8 小鼠皮下脂肪組織總RNA提取及實時熒光定量PCR分析 根據(jù)說明書，使用TRIzol（Sigma，USA）從小鼠皮下脂肪組織中分離總RNA。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，JP）將分離出的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系（20 μL）為：2×SYBR qPCR Mastermix 10 μL，Primer forward 0.4 μL，Primer reversed（10 μm）0.4 μL，Template DNA 1 μL，DEPC水8.2 μL。上述體系在實時定量PCR儀上反應(yīng)，PCR反應(yīng)程序為：Step 1：95℃，30 s；Step 2：95℃，10 s；Step 3：60℃，20 s，Step 4：72℃，60 s。其中Step 1—3重復(fù)40次。從60℃升到95℃時，溫度爬升速率為：△T=1℃，15 s。本試驗中選取的目標(biāo)基因及相關(guān)引物序列如表4所示[19]。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析 使用Excel 2017和SPSS Statistics 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行整理與統(tǒng)計分析，所有試驗至少測量3次，結(jié)果顯示為平均值。采用單因素方差分析（ANOVA）進行差異顯著性比較（＜0.05）。使用Excel 2017作圖。

2 結(jié)果

2.1 蕎麥多酚提取物成分鑒定

如表5所示，通過UHPLC-Q-Orbitrap質(zhì)譜并結(jié)合3個數(shù)據(jù)庫（mzCloud、mzVault和ChemSpider）分析多酚類化合物的質(zhì)譜信息。鑒定結(jié)果優(yōu)先級為數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果優(yōu)于推測結(jié)果。3種數(shù)據(jù)庫mzCloud＞mzValut＞ChemSpider，如果不同數(shù)據(jù)庫鑒定結(jié)果不一致，則采用優(yōu)先級更高的鑒定結(jié)果[17]。根據(jù)以上標(biāo)準鑒定出蕎麥多酚提取物中的20種多酚類化合物，包括羥基肉桂酸、槲皮素、濱蒿內(nèi)酯、兒茶素、蘆丁、大豆苷、咖啡酸、柚皮素、甲氧基肉桂酸、東莨菪素、原花青素、二羥基苯基丙酸、黃豆黃素苷、金絲桃苷、根皮素、蝦青素、橙皮甙、兒茶酸、槲皮甙和異鼠李素。根據(jù)這20種化合物的峰面積進行相對定量分析，發(fā)現(xiàn)相對含量最多的4種酚類為羥基肉桂酸、槲皮素、濱蒿內(nèi)酯和蘆丁，占酚類總量的80.61%，且他們在蕎麥中的含量之比為12﹕2﹕2﹕1。因此，在后續(xù)試驗中將這4種蕎麥主要多酚按蕎麥原料中的比例配制成多酚混合物，用生理鹽水配制成2.5 mg?mL-1作用于多酚干預(yù)組小鼠，通過與不同比例的蕎麥替換基礎(chǔ)飼料干預(yù)的高脂膳食小鼠做對比，探討蕎麥的降脂功能及蕎麥多酚在其中發(fā)揮的作用。

表4 目標(biāo)基因及相關(guān)引物序列

表5 基于UHPLC-Q-Orbitrap質(zhì)譜鑒定蕎麥提取物中多酚的組成

2.2 蕎麥及其多酚干預(yù)對高脂小鼠體重及臟器指數(shù)的影響

高脂飲食喂養(yǎng)可借助動物建立與人類病理生理學(xué)比較相似的抗肥胖干預(yù)試驗的體內(nèi)模型[20]。小鼠的體重變化趨勢如圖1所示。喂養(yǎng)39 d后，高脂飲食組小鼠體重平均增加10.61 g，顯著高于正常飲食組的5.32 g。同樣在飲食干預(yù)39 d后，與高脂飲食組相比，高、中、低劑量的蕎麥飲食干預(yù)組中體重增加均顯著降低（P＜0.05），分別為6.8、7.6和9.27 g。隨著蕎麥添加比例的增加，小鼠體重的增加量逐漸減小，說明蕎麥對高脂飼料誘導(dǎo)的小鼠體重增加有顯著的抑制效果。同時，在多酚干預(yù)組發(fā)現(xiàn)經(jīng)39 d干預(yù)后，多酚干預(yù)組小鼠體重平均增加4.11 g，低于對照組增加量，說明蕎麥多酚標(biāo)品混合物對于高脂膳食小鼠體重增長抑制作用顯著，可以考慮其在減脂領(lǐng)域的應(yīng)用價值。

###: P＜0.001 (vs HFD)。下同The same as below

圖2為高脂飲食組和不同比例蕎麥及多酚干預(yù)組小鼠的臟器指數(shù)的變化，用以評估蕎麥及其多酚干預(yù)樣品對小鼠臟器指數(shù)的影響。喂養(yǎng)39 d后，高脂飲食組小鼠的肝臟指數(shù)與對照組相比顯著增加，腎臟指數(shù)與對照組相比顯著降低（圖2-A、B），說明連續(xù)高脂飲食使小鼠肝周產(chǎn)生脂肪堆積，同時對于小鼠的腎臟產(chǎn)生了一定程度的損傷。在飲食干預(yù)39 d后，與高脂飲食組相比，高、中劑量的蕎麥飲食干預(yù)組中小鼠肝臟指數(shù)的增加均顯著降低（P＜0.05）、腎臟指數(shù)的增加均顯著上升（P＜0.05）。隨著蕎麥添加比例的增加，小鼠肝臟指數(shù)的增加量逐漸減小，其中40%蕎麥添加組與高脂組相比差異極顯著。同時，多酚標(biāo)品干預(yù)組經(jīng)39 d干預(yù)后，干預(yù)組與高脂組相比肝臟指數(shù)的下降和腎臟指數(shù)的上升也差異極顯著。說明20%和40%的蕎麥添加量以及蕎麥多酚干預(yù)對高脂飼料誘導(dǎo)的小鼠脂肪肝有顯著的改善作用，對其腎臟損傷則有顯著的保護效果。此外，高脂飼料以及飲食干預(yù)對于小鼠心臟、胰臟指數(shù)則不直接相關(guān)（圖2-C、D）。

2.3 蕎麥及其多酚干預(yù)對高脂小鼠血生化指標(biāo)的影響

如圖3所示，高脂飼料喂養(yǎng)39天后，小鼠血清中的總膽固醇含量從2.56 mmol·L-1上升至4.02 mmol·L-1，甘油三酯含量從1.78 mmol·L-1上升至3.89 mmol·L-1，變化極顯著（圖3-A、B）。隨著飼料中蕎麥含量的增加，小鼠血清中總膽固醇、甘油三酯的含量逐漸降低，抑制效果顯著；多酚干預(yù)組中小鼠血清中總膽固醇和甘油三酯的含量也明顯降低，表明蕎麥飲食干預(yù)對高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖小鼠脂代謝異常的改善是其中的酚類物質(zhì)發(fā)揮了主要作用[21]。同時，隨著飼料中蕎麥含量的增加，小鼠血清中低密度脂蛋白的含量逐漸降低，高密度脂蛋白的含量則逐漸增加，其中高、中劑量蕎麥飲食干預(yù)以及多酚干預(yù)對小鼠血清中低密度脂蛋白的抑制作用顯著；對高脂飼料造成的小鼠血清中高密度脂蛋白下降則有顯著的保護作用。研究表明，谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶是肝臟健康的指標(biāo)。只要有1% 的肝細胞壞死，血液中的酶活性就會增加一倍。當(dāng)肝細胞膜的通透性增加時，即使無壞死，細胞內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶也可由于如此明顯的濃度梯度差而泄露入血中，因此血清轉(zhuǎn)氨酶（谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶等）是肝細胞損傷的敏感指標(biāo)，血清轉(zhuǎn)氨酶升高在一定程度上反映了肝細胞的損害程度，是急性肝細胞損傷的敏感標(biāo)志物[22]。從圖3-E、F中可以看出，高、中、低劑量蕎麥飲食干預(yù)以及蕎麥多酚干預(yù)組在39 d后，小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量分別為9.04、11.30、13.56和9.02 U·L-1；谷草轉(zhuǎn)氨酶含量分別為25.01、27.14、29.12和24.33 U·L-1。隨著飼料中蕎麥含量的增加，小鼠血清中兩種酶的含量均逐漸降低，抑制效果顯著。多酚干預(yù)組的抑制效果和40%蕎麥干預(yù)組相當(dāng)。

*: P＜0.05, **: P＜0.01 (vs Con); #: P＜0.05, ##: P＜0.01 (vs HFD)。下同 The same as below

2.4 蕎麥及其多酚干預(yù)對高脂小鼠體肝臟組織形態(tài)的影響

肝臟脂肪堆積引起的脂肪性肝炎可進一步導(dǎo)致肝臟疾病，包括肝硬化、肝癌等[23]。本研究通過小鼠肝臟病理組織切片，從組織形態(tài)學(xué)分析了高脂飲食喂養(yǎng)、雜糧飲食以及多酚干預(yù)對小鼠肝組織形態(tài)的影響。從圖4可看出，正常飲食組小鼠肝臟細胞較為清晰完整；而高脂飲食組小鼠的肝細胞模糊紊亂，脂肪在肝細胞內(nèi)堆積至形成脂肪滴，出現(xiàn)了嚴重的脂肪變性。當(dāng)體內(nèi)脂肪、糖類、蛋白質(zhì)代謝異常時，尤其致胰島素抵抗后，可促使血中大量脂肪酸進入肝臟，使肝內(nèi)新合成甘油三酯增加，從而肝內(nèi)脂肪酸的氧化負荷增加，并產(chǎn)生大量自由基，可導(dǎo)致線粒體DNA損傷，出現(xiàn)類結(jié)晶包涵體，這是氧化應(yīng)激反應(yīng)的結(jié)果。由于線粒體損傷加重了肝細胞的能量代謝障礙，使脂質(zhì)氧化途徑受損，造成大量脂質(zhì)儲積于肝細胞內(nèi)形成脂肪肝[24]。飲食干預(yù)后，與高脂組動物相比，蕎麥飼料組和多酚干預(yù)組小鼠肝組織中脂肪滴體積均有所減小，肝細胞更加清晰，表明蕎麥多酚在不同程度上緩解了小鼠肝組織中脂肪累積，減輕了肝脂肪變性。同樣，40%蕎麥組和多酚干預(yù)組小鼠肝組織損傷減輕效果更為明顯，表明隨蕎麥添加量的增加，對肝臟的保護作用逐漸加強，其中的酚類物質(zhì)發(fā)揮了主要作用。

***: P＜0.001 (vs Con)。下同 The same as below

2.5 不同含量的蕎麥及其多酚干預(yù)對高脂小鼠白色脂肪棕色化相關(guān)蛋白表達的影響

如圖5所示，經(jīng)高脂飼料喂養(yǎng)39 d后，小鼠皮下脂肪組織中UCP1、PRDM-16和PGC-1α的表達量均降低至對照組的50%以下，Tcf21和HOXC8的表達量則上升至對照組的1.76及1.93倍。經(jīng)高、中、低劑量蕎麥飼料以及蕎麥多酚干預(yù)39 d后，小鼠皮下脂肪組織中UCP1、PRDM-16和PGC-1α的表達量顯著上升；Tcf21和HOXC8的表達量則明顯下降，其對相關(guān)蛋白表達的影響與飼料中蕎麥的添加量成正相關(guān)（圖5-E、F）。說明添加不同比例的蕎麥以及多酚干預(yù)可以有效增加小鼠皮下脂肪組織中與褐色脂肪產(chǎn)熱相關(guān)蛋白UCP1、PRDM-16和PGC-1α的表達，同時抑制與白色脂肪相關(guān)蛋白Tcf21和HOXC8的表達。通過調(diào)控線粒體生物合成并提高能量代謝從而促進褐色脂肪的能量代謝，同時減少白色脂肪相關(guān)蛋白的表達，調(diào)節(jié)白色脂肪轉(zhuǎn)化為棕色脂肪前體細胞從而促進白色脂肪的棕色化。另外，隨著蕎麥添加量的增加，干預(yù)效果顯著增加，即40%比例的蕎麥飼料的改善效果最好。因此，后續(xù)試驗采用實時熒光定量PCR檢測40%蕎麥及其多酚對高脂小鼠褐色脂肪、白色脂肪特異性基因以及白色脂肪棕色化相關(guān)基因表達的調(diào)控作用。

Con：基礎(chǔ)飲食組；HFD：高脂飲食組；HPE：高脂飲食組多酚干預(yù)組；10%：10%蕎麥飼料；20%：20%蕎麥飼料；40%：40%蕎麥飼料Con: Basic diet group; HFD: High-fat diet group; HPE: High-fat diet group was given polyphenols; 10%: Feed containing 10% buckwheat; 20%: Feed containing 20% buckwheat; 40%: Feed containing 40% buckwheat

圖5 不同添加量蕎麥飼料及其多酚干預(yù)對高脂膳食小鼠皮下脂肪組織中相關(guān)蛋白表達的影響

2.6 蕎麥及其多酚干預(yù)對高脂小鼠白色脂肪棕色化相關(guān)基因表達的影響

如圖6所示，經(jīng)高脂飼料喂養(yǎng)39 d后，小鼠皮下脂肪組織中和表達量分別降低為對照組的28%、24%和21%；和表達量則上升到對照組的4倍以上。經(jīng)過39 d的40%蕎麥飼料以及蕎麥多酚干預(yù)后，小鼠皮下脂肪組織中和的表達量顯著上升（圖6-A—C），和表達量則明顯下降（圖6-D—E）。說明含有40%蕎麥飼料以及蕎麥多酚干預(yù)可有效提高小鼠脂肪組織中和的表達量，調(diào)控線粒體生物合成并提高能量代謝從而促進褐色脂肪的能量代謝。同時下調(diào)的表達，減少白色脂肪相關(guān)蛋白的表達從而促進褐色脂肪能量代謝。

圖6 40%添加量蕎麥飼料及其多酚干預(yù)對高脂膳食小鼠皮下脂肪組織中相關(guān)基因表達的影響

3 討論

3.1 蕎麥及其多酚對高脂膳食誘導(dǎo)肥胖小鼠具有顯著降脂作用

長期的高脂飲食會導(dǎo)致能量過剩脂肪促使肥胖的發(fā)生，伴隨而來肥胖、血脂異常等慢性疾病癥狀。因此，膳食干預(yù)在肥胖管理及其與相關(guān)疾病預(yù)防上的重要性也逐漸被關(guān)注。本研究通過鑒定出蕎麥多酚提取物中的20種酚類化合物，根據(jù)相對定量分析發(fā)現(xiàn)相對含量最多的4種酚類為羥基肉桂酸、槲皮素、濱蒿內(nèi)酯和蘆丁，已有相關(guān)文獻報道其具有降脂功效[19]。研究表明，總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶等血清指標(biāo)與心血管疾病相關(guān)，是心血管疾病的生物標(biāo)志物[25]。高脂膳食干預(yù)會導(dǎo)致小鼠血脂異常以及肝臟脂肪性病變[26]。

本研究證實了添加蕎麥飼料以及蕎麥多酚干預(yù)對小鼠體重、肝臟指數(shù)以及血清中甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白、谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶的增加有顯著的抑制作用，并且隨著蕎麥添加量的提高，抑制作用也增加。Singh等[21]也研究雜糧中-葡聚糖對小鼠膽固醇代謝相似的影響，結(jié)果表明經(jīng)-葡聚糖處理后，TG降低24.14%，T-CHO降低15.53%。

高脂膳食誘導(dǎo)脂肪在肝細胞內(nèi)堆積至形成脂肪滴，出現(xiàn)了嚴重的脂肪變性。當(dāng)體內(nèi)脂肪、糖類、蛋白質(zhì)代謝異常時，尤其致胰島素抵抗后，可促使血中大量脂肪酸進入肝臟，使肝內(nèi)新合成甘油三酯增加，從而肝內(nèi)脂肪酸的氧化負荷增加，并產(chǎn)生大量自由基，可導(dǎo)致線粒體DNA損傷，出現(xiàn)類結(jié)晶包涵體[27]。蕎麥飼料的添加可減緩小鼠肝組織中脂肪累積，減輕肝脂肪變性。同時也發(fā)現(xiàn)直接用蕎麥多酚干預(yù)對肝臟的保護作用更強，證實了是蕎麥多酚起到了主要的改善作用。

3.2 蕎麥多酚影響高脂小鼠白色脂肪棕色化的作用機制

脂肪組織主要分為兩種，白色脂肪和棕色脂肪。白色脂肪負責(zé)儲存能量，棕色脂肪負責(zé)適應(yīng)性產(chǎn)熱以消耗能量，在調(diào)節(jié)能量平衡中起重要作用。PORTER等[28]研究發(fā)現(xiàn)，褐藻素可誘導(dǎo)高脂飲食的實驗動物腹部白色脂肪棕色化，上調(diào)mRNA和蛋白表達水平，增加脂肪分解代謝相關(guān)基因表達。此外，槲皮素等植物化學(xué)物的抗肥胖作用也被證實與增加白色脂肪細胞中線粒體含量、上調(diào)UCP1蛋白表達、誘導(dǎo)白色脂肪細胞棕色化、增強脂肪酸氧化和能量消耗有關(guān)。因此，從天然作物中篩選具有誘導(dǎo)白色脂肪棕色化作用的功能性植物基食品，可成為肥胖防治的又一方向[12]。

研究發(fā)現(xiàn)可以刺激核呼吸因子1和2（，）基因表達，與共同結(jié)合于線粒體轉(zhuǎn)錄激活因子（mitochondrial transcription activating factor a，mtTFA）的啟動子區(qū)，增強表達，促進線粒體DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄，刺激線粒體生物合成[13-14]。已經(jīng)證實PGC-1α可以誘導(dǎo)白色脂肪細胞棕色化、增強細胞代謝活性以及整體代謝速率。還可以共活化PPARα、維甲酸受體、甲狀腺受體等信號因子，增強褐色脂肪特異基因的表達，促進氧化磷酸化解耦聯(lián)、增加產(chǎn)熱[28]。因此，在誘導(dǎo)白色脂肪細胞棕色化中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。

是調(diào)控前體細胞分化為棕色脂肪細胞的分子開關(guān)，它曾被認為僅在白色脂肪中存在。高表達的轉(zhuǎn)基因小鼠，腹股溝白色脂肪中出現(xiàn)表達等棕色脂肪特異基因的棕色樣脂肪細胞，而白色脂肪標(biāo)志基因抵抗素表達下調(diào)，動物表現(xiàn)為能耗增加、葡萄糖耐受性升高和肥胖抵抗。但是如對來自腹股溝的白色脂肪細胞進行沉默，細胞內(nèi)產(chǎn)熱基因表達與氧化磷酸化解耦聯(lián)均顯著減少，表達增加[15]。同時發(fā)現(xiàn)表達不足時，3-AR激動劑誘導(dǎo)的白色脂肪棕色化作用明顯受抑制。研究證實，除了參與前體細胞向褐色脂肪細胞的分化外，對于誘導(dǎo)白色脂肪棕色化、增強機體產(chǎn)熱活性也具有重要作用。

為白色脂肪特異性基因，在白色脂肪中高表達。冷馴化導(dǎo)致其表達量下降，因而在棕色脂肪中的表達量很低[16]。因此，通過WB和qPCR結(jié)果表明添加蕎麥可以明顯提高小鼠棕色脂肪產(chǎn)熱活性，減少白色脂肪含量，調(diào)節(jié)能量代謝平衡，從而對高脂膳食小鼠起到干預(yù)及改善作用，并再次證實了其中蕎麥多酚起到了主要的干預(yù)作用。

4 結(jié)論

本研究通過UHPLC-Q-Orbitrap質(zhì)譜鑒定出蕎麥多酚提取物中的20種酚類化合物，并將其中4種主要多酚羥基肉桂酸、槲皮素、濱蒿內(nèi)酯、蘆丁按蕎麥原料中的比例（質(zhì)量比12﹕2﹕2﹕1）配制成多酚混合物。動物實驗表明，添加40%蕎麥飼料以及蕎麥多酚干預(yù)均可有效改善高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖小鼠的高脂血癥和能量代謝紊亂，并初步推斷其作用機理是蕎麥中的酚類物質(zhì)激活棕色脂肪并誘導(dǎo)白色脂肪細胞向棕色脂肪前體轉(zhuǎn)變，下調(diào)白色脂肪特異性基因的表達，從而調(diào)控脂質(zhì)代謝。

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Lipid-Lowering Effects and Its Regulation Mechanism of Buckwheat Polyphenols in High-Fat Diet-Induced Obese Mice

YAO YiJun, JU XingRong, WANG LiFeng

College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics/Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety, Nanjing 210023

【Background】At present, relevant animal experiments have confirmed that buckwheat had a good intervention effect on obesity and lipid metabolism disorder caused by high-fat diet. At the same time, studies have shown that the adaptive thermogenesis of brown fat could effectively improve the body’s energy metabolism. Therefore, increasing the activity of brown fat and promoting the browning of white fat could be used as an effective way to prevent obesity and improve energy metabolism diseases.【Objective】The raw buckwheat and four kinds of main polyphenols identified from buckwheat were prepared according to the content proportion to study the lipid-lowering effects of buckwheat polyphenols in high-fat diet-induced obese mice via browning of white adipocytes.【Method】Phenolic compounds in buckwheat polyphenol extract were identified by UHPLC-Q-Orbitrap mass spectrometry combined with database. And the main polyphenol compound was prepared according to the content proportion in the raw buckwheat. In order to explore the regulating effects of buckwheat on body weight, organ index and blood lipid level in C57BL/6J mice, the dietary intervention was carried out with 10%, 20% and 40% proportion of buckwheat to replace basic feed and the 2.5 mg?mL-1of mixture buckwheat polyphenol standard substance. Last but not least, Western-blot and q-PCR were used to investigate the effects of buckwheat feed and polyphenol intervention on the expression of heat-producing proteins and genes in white and brown fat in mouse subcutaneous adipose tissue.【Result】Twenty phenolic compounds in buckwheat polyphenol extract were identified by UHPLC-Q-Orbitrap mass spectrometry, and the content of four phenolic compounds with the highest content (hydroxycinnamic acid, quercetin，scoparone, and rutin) accounted for more than 80% of the total phenolic compounds, which were the main polyphenols in buckwheat. The results showed that after 39 d in the diet intervention, compared with high-fat diet group, adding buckwheat feed and buckwheat polyphenol intervention on body weight in mice, the liver index and serum triglyceride (TG), total cholesterol (T-CHO), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-c), aspartate aminotransferase (ALT) and third transaminase (AST) increased significantly inhibitory effect; with the increase of amount of buckwheat, the inhibition increased. At the same time, adding buckwheat feed and buckwheat polyphenol could protect and improve the decrease of renal index and HDL-c in mice. It was also the high dose 40% buckwheat and polyphenol group that had the best effect, which showed that phenolic substances played a major role in the improvement of abnormal lipid metabolism in high-fat diet-induced obese mice. UCP1, PRDM-16, and PGC-1α protein and gene expression levels were significantly decreased in the high-fat diet group compared with the normal diet group, while Tcf21 and HOXC8 expression levels were significantly increased (＜0.05). After dietary intervention, protein expression levels of UCP1, PRDM-16 and PGC-1αin the buckwheat intervention group were significantly up-regulated, while protein expression levels of Tcf21 and HOXC8 were significantly decreased (＜0.05). In addition, the 40% buckwheat and polyphenol intervention group significantly increased the expression of,andgenes in mouse visceral adipose tissue (＜0.05), and which down-regulated the expressions ofandgenes.【Conclusion】Buckwheat intervention could effectively improve the lipid metabolism disorder in high-fat diet-induced obese mice, and it was confirmed that buckwheat polyphenols played a major role. The mechanism was mainly buckwheat polyphenols could significantly improve the thermogenic activity of brown fat, reduce the content of white fat, and regulate the energy metabolism balance. This study provided a new idea and theoretical basis for the utilization of buckwheat and the development of functional foods about lipid-lowering products.

buckwheat; polyphenols; high-fat diet-induced mice; lipid-lowering effects; browning of white adipocytes

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.05.013

2022-04-26；

2022-11-25

國家重點研發(fā)計劃（2021YFD2100904）、國家自然科學(xué)基金面上項目（32172147）、江蘇省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項目（JATS [2021]522）、江蘇省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)重點項目（BE2022317）

姚軼俊，E-mail：yyj@nufe.edu.cn。通信作者王立峰，E-mail：wanglifeng_8@nufe.edu.cn

（責(zé)任編輯 趙伶俐）