鄭文燕，常源升，何平，何曉文，王森，高文勝，李林光，王海波

‘魯麗’ב紅1#’蘋果雜交群體全基因組KASP標記開發(fā)及驗證

1山東省果樹研究所，山東泰安 271000；2山東省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，濟南 250100

【目的】利用‘魯麗’ב紅1#’親本及雜交后代，開發(fā)蘋果葉片性狀競爭性等位基因特異PCR（kompetitive allele-specific PCR，KASP）標記，為蘋果光能高效利用育種提供參考。【方法】以‘魯麗’和I型紅肉蘋果‘紅1#’及其134個雜交后代的幼嫩葉片為材料，調(diào)查葉片性狀表型（包括葉片長度、寬度、葉綠素含量、花青苷含量、光合參數(shù)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)等）數(shù)據(jù)。采用Illumina HiSeq 2500測序平臺進行全基因組重測序，通過短序列比對軟件將測序序列（reads）回貼到蘋果參考基因組，利用GATK軟件工具包檢測單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms, SNP）標記?！窘Y(jié)果】‘魯麗’和‘紅1#’及其134個雜交后代重測序得到有效reads數(shù)分別為164 776 660、149 482 876和3 927 370 200。與蘋果參考基因組比對率分別為98.77%、98.89%和97.79%。共檢測到6 445 766個SNP。經(jīng)過濾后獲得94 208個特異性強，準確性高的SNP位點。對每個SNP進行KASP引物設(shè)計，最終開發(fā)了5 802個蘋果全基因KASP標記。這些KASP標記的多態(tài)性信息含量（polymorphism information content，PIC）平均值為0.31，PIC大于0.35的占30.13%。Simpson遺傳多樣性指數(shù)在0.01—0.67，平均每個位點遺傳多樣性指數(shù)為0.53。觀測雜合度平均值為0.32。KASP標記所在基因的KEGG功能聚類分析顯示，“葉酸介導(dǎo)的一碳代謝途徑”是差異基因富集最顯著的途徑。通過對‘魯麗’ב紅1#’雜交群體24個葉片相關(guān)性狀進行表型調(diào)查，結(jié)果顯示親本‘魯麗’和‘紅1#’在葉片凈光合速率、氣孔導(dǎo)度（Gs）等性狀的表型值均存在顯著差異。雜交后代表型變異幅度較大，各性狀分離廣泛。隨后對雜交群體葉片性狀表型值與KASP標記基因型進行相關(guān)性分析，結(jié)合KASP標記注釋，篩選得到21個與葉片大小、Gs和色素含量性狀顯著相關(guān)的KASP標記?！窘Y(jié)論】利用‘魯麗’和‘紅1#’及其134個雜交后代全基因組重測序數(shù)據(jù)開發(fā)了5 802個蘋果全基因組KASP標記，獲得21個與葉片性狀顯著相關(guān)的KASP標記，為開展標記輔助蘋果光能高效利用育種提供了理論參考。

蘋果；全基因組重測序；葉片性狀；KASP標記

0 引言

【研究意義】蘋果（Borkh.）是我國最重要的栽培果樹之一，其產(chǎn)量和面積均居世界首位，在鄉(xiāng)村產(chǎn)業(yè)振興中發(fā)揮了舉足輕重的作用[1]。近年來，在國家引導(dǎo)“林果業(yè)上山上坡，鼓勵利用‘四荒’資源，不與糧爭地”的政策背景下，如何提高果樹生產(chǎn)力，成為重要課題。目前，生產(chǎn)中主要通過高光效樹形改造，構(gòu)建豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的葉幕結(jié)構(gòu)，提高光能利用效率，以提高蘋果果實品質(zhì)和產(chǎn)量，而比較不同品種的光合性能，挖掘光能利用潛力，加強光能高效利用品種的選育將為蘋果高光效研究提供更多的有效途徑，同時對提升蘋果產(chǎn)量和質(zhì)量具有重要意義[2-4]。長期以來，常規(guī)雜交仍是蘋果育種的主要手段，但童期長，自交不親和，遺傳雜合度高，缺乏對目標性狀早期預(yù)選方法，導(dǎo)致蘋果常規(guī)雜交育種周期長、成本高、效率低。隨著測序技術(shù)日趨成熟，遍布于基因組且易于檢測的共顯性單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）標記被廣泛開發(fā)，已成為作物基因分型和遺傳研究的基本工具[5-6]，其高效、快速、高通量的特點，對蘋果育種實現(xiàn)早期選擇，提高效率具有重要意義。【前人研究進展】競爭性等位基因特異性PCR（kompetitive allele-specific PCR，KASP）是SNP高通量分型的主流技術(shù)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于作物的遺傳圖譜構(gòu)建、基因精細定位、分子標記輔助育種和品種鑒定等[7-9]。在蘋果中，已經(jīng)開發(fā)了不同性狀的KASP標記，如蘋果抗黑星病、抗白粉病和抗綿蚜性狀[10]、果實酸含量[11]、水分利用效率相關(guān)性狀[12]、蘋果果實輪紋病抗病性[13]、蘋果果皮著色度[14]、硬度脆度保持性[15]、砧木耐鹽堿性[16]、蘋果虎皮病性狀[17]等。利用這些KASP標記可大幅度提高分子檢測可視化程度，實現(xiàn)了高通量、低成本應(yīng)用，推動蘋果分子育種發(fā)展[18]。葉片光合特性和葉綠素?zé)晒鈪?shù)是用于評價CO2固定光能利用效率的有用指標[19]，鑒定出這些參數(shù)的遺傳位點，則可以利用標記輔助育種改善光合特性，對進行光能高效利用育種提供參考?！颈狙芯壳腥朦c】葉片性狀正受到高度重視[20-22]，植物葉片形狀，葉綠素含量、凈光合速率和葉綠素?zé)晒鈪?shù)等均屬于微效多基因控制的數(shù)量性狀，由復(fù)雜的遺傳網(wǎng)絡(luò)調(diào)控[23-24]。分子標記技術(shù)可快速、準確地鑒定植物數(shù)量性狀，目前分子標記技術(shù)已應(yīng)用于多種作物葉片性狀研究，但尚未獲得與蘋果葉片性狀相關(guān)的KASP標記[25]。研究表明，蘋果光合效率表現(xiàn)出明顯的雜種優(yōu)勢，雜交后代有更強固定大氣CO2的能力，更具豐產(chǎn)潛能。通常綠葉凈光合速率較高，紅葉光合功能期較長，使用凈光合速率或光合功能期變異較大的品種雜交，更易于從雜交群體中選出具有光合優(yōu)勢的后代[26-27]。基于此，本研究以‘魯麗’與I型紅肉蘋果‘紅1#’構(gòu)建的遺傳群體為材料進行葉片性狀的KASP標記開發(fā)。其中，紅肉蘋果（f.）作為新疆野蘋果（）的紅肉變型，是蘋果育種的重要資源[28-29]?！t1#’果肉和葉片均為紅色?！旣悺O果通過‘藤木一號’ב皇家嘎啦’雜交育成，其果肉白色，葉片綠色?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過對‘魯麗’與I型紅肉蘋果‘紅1#’構(gòu)建的遺傳群體進行全基因組重測序，開發(fā)蘋果全基因組KASP標記，篩選出與葉片大小、葉綠素含量、光合參數(shù)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)等性狀顯著相關(guān)的KASP標記，為開展標記輔助育種提供理論參考。

1 材料與方法

試驗于2021年在山東省果樹研究所分子生物學(xué)實驗室進行。

1.1 材料

‘魯麗’（）ב紅1#’（f）雜交組合：該群體于2018年進行雜交，2019年獲得雜種實生苗，當(dāng)年8月份芽接至M9T337矮化自根砧，定植于山東省泰安市岱岳區(qū)山東省果樹研究所天平湖試驗站，常規(guī)管理。2020年4月觀察蘋果葉片顏色，淘汰非紅葉的假雜種植株，選取134株F1實生后代連同雙親進行全基因組重測序。圖1為親本和3株典型后代葉片形態(tài)照片。

圖1 親本‘魯麗’和‘紅1#’及其3株雜交后代第4—10片葉片形態(tài)

1.2 表型測量

1.2.1 葉片形態(tài)指標 2021年8月采集136株蘋果葉片樣品，取當(dāng)年生枝條由上向下數(shù)第5—7片葉子，每株不少于20片成熟葉，采用CID公司生產(chǎn)的手持葉面積儀（CID-202，美國）測量葉片的葉面積、葉長、葉寬和葉片周長。

1.2.2 葉片生理指標

①葉片總花青苷含量測定：取10片上述成熟葉片堆疊在一起，利用打孔器打成10個小葉盤（直徑約0.7 cm），稱取0.1 g，用液氮研磨成粉末后，在酸化甲醇中（1% HCl-CH3OH）提取蘋果葉片總花青素，并通過pH示差法測量總花青素含量[30-31]。pH 1.0的樣品稀釋液為氯化鉀緩沖液（0.025 mol?L-1、50 mmol?L-1KCl、150 mmol?L-1HCl），pH 4.5的樣品稀釋液為乙酸鈉緩沖液（0.4 mol?L-1、400 mmol?L-1CH3COONa、240 mmol?L-1HCl），利用紫外分光光度計OPTIMA SP-3000DB（日本）測量530 nm和700 nm處樣品稀釋液的吸光度。葉片總花青苷含量計算公式為：

花青苷含量（mg?g-1）=（A×MW×DF）/ε×W。

式中，A：吸光度，A=(A530-A700) pH 1.0-(A530-A700) pH 4.5；MW：矢車菊素-3-葡萄糖苷的分子量；DF：稀釋因子；ε：矢車菊素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)；W：樣品重量。

②葉片葉綠素含量測定：使用ARNON[32]描述的方法，在80%的丙酮溶液中提取葉綠素。在645 nm和663 nm處測量提取液的吸光度，葉綠素含量計算公式如下：

Chla (mg?g-1)=(12.7 A645-2.69 A663)×V/1000W；

Chlb (mg?g-1)=(22.9 A645-4.68 A663)×V/1000W；

Chl (a+b) (mg?g-1)=(20.2 A645+8.02 A663) ×V/1000W。

式中，Chla：葉綠素a；Chlb：葉綠素b；A：吸光度值；V：80%丙酮萃取液的體積；W：樣品重量。

1.2.3 葉綠素?zé)晒馓匦?使用Porket PEA植物效率分析儀（Hansatech，英國）測定蘋果發(fā)育枝頂端由上至下第6片功能葉的58個熒光參數(shù)。本研究重點選取9個進行KASP標記與性狀的關(guān)聯(lián)分析，如PSII最大光能轉(zhuǎn)化效率（v/m），單位反應(yīng)中心吸收的光能（ABS/RC），單位反應(yīng)中心耗散的能量（DIo/RC）以及單位反應(yīng)中心捕獲的能量（TRo/RC）等。測定前將葉片遮光暗適應(yīng)30 min，以確保PSII反應(yīng)中心完全開放[33]。

1.2.4 葉片光合速率 使用美國PP SYSTEMS公司CIRAS-3便攜式光合測定系統(tǒng)測定蘋果發(fā)育枝頂端由上至下第6片功能葉片的凈光合速率（Pn）、細胞間CO2濃度（Ci）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、蒸騰速率（Tr）、水分利用效率（WUE）和大氣蒸汽壓虧缺（VPD）。

1.2.5 表型數(shù)據(jù)分析 使用SPSS17.0 軟件處理表型數(shù)據(jù)，參照Zheng等[14]對數(shù)據(jù)進行方差分析、相關(guān)分析和描述統(tǒng)計。

1.3 DNA提取和全基因組重測序

取‘魯麗’和‘紅1#’及其134個雜交后代的幼嫩葉片，采用改良的CTAB法提取基因組DNA[10]。采用Illumina HiSeq 2500測序平臺進行DNA雙末端PE150測序，150 bp讀長（Illumina，San Diego，CA，USA）。測序深度：‘魯麗’32×，‘紅1#’30×，雜交后代平均5.13×。采用Burrows-Wheeler Aligner（BWA）軟件將重測序獲得的測序reads回貼到蘋果參考基因組上（https://iris.angers.inra.fr/gddh13/）以進行后續(xù)的變異分析[34]。采用GATK軟件工具包用于親本、子代與參考基因組之間SNP和InDel檢測，SnpEff軟件用于SNP和InDel變異的注釋[35-36]。

1.4 KASP標記開發(fā)

利用GATK軟件工具包進行SNP的鑒定后，經(jīng)過vcftools軟件對SNP過濾分析，首先保留最小基因組覆蓋深度＞5×，標記質(zhì)量值＞30，最小完整度＞0.7，最小等位基因頻率0.05，雙等位基因的位點；其次，選擇多態(tài)信息含量（polymorphism information content，PIC）≥0.2，期望雜合度≥0.2的SNP位點；然后，使用RepeatMasker軟件標記基因組重復(fù)序列，去除重復(fù)序列上的SNP標記；最終，截取SNP標記上下游各50 bp序列，然后使用blast軟件把序列比對參考基因組，去除比對上2個（包括原有位置）及2個以上位置的標記。對每個SNP標記進行引物設(shè)計，使用引物設(shè)計軟件primer 3.0，只有引物設(shè)計成功的SNP位點才認為是合格的KASP標記，使用合格的KASP標記進行下游分析。

1.5 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

基于開發(fā)的全基因組KASP標記，通過軟件包pca3d（版本：0.10）進行主成分分析（principal components analysis，PCA）分析，得到樣品的主成分聚類情況[37]。使用軟件FastTree（版本：2.1.3）中的極大似然法（maximum likelihood，ML）構(gòu)建進化樹[38]。使用STRUCTURE（版本：2.3.1）軟件進行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析。使用TASSEL軟件（版本：5.2.59）計算親緣關(guān)系。使用plink軟件（版本：v1.90b6.24）計算HWE。

1.6 KASP標記及其所在的基因注釋

采用ANNOVAR軟件對KASP標記及其所在基因進行注釋。SNP起始位點上游2 kb內(nèi)為upstream，終止位點下游2 kb內(nèi)為downstream。利用GO（http:// www.geneontology.org/）和KEGG（http://www.genome. jp/kegg）數(shù)據(jù)庫對KASP標記所在的差異基因進行功能聚類。利用薔薇科基因組數(shù)據(jù)庫（https://www. rosaceae.org/）和Uniprot數(shù)據(jù)庫（http://www.uniprot. org/）中的功能注釋信息查看相應(yīng)蛋白質(zhì)的功能。

2 結(jié)果

2.1 蘋果全基因組重測序和SNP標記的開發(fā)

通過Illumina HiSeq 2500測序平臺對‘魯麗’和‘紅1#’及其134個雜交F1代進行全基因組重測序，共得到635 Gb有效數(shù)據(jù)（clean data）。其中，‘魯麗’得到的有效數(shù)據(jù)為24.68 Gb，‘紅1#’得到的有效數(shù)據(jù)為22.39 Gb，134個雜交后代總數(shù)據(jù)量為588.15 Gb。Q30均達到90%以上，GC平均含量為38.61%（表1）。使用短序列比對將有效數(shù)據(jù)與GDDH13蘋果參考基因組序列進行比對[34]，計算出兩個親本和雜交后代的測序數(shù)據(jù)比對率，比對率分別為98.77%、98.89%和97.79%，這也證實了測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量良好，可以繼續(xù)對測序結(jié)果進行SNP數(shù)據(jù)分析。

表1 重測序數(shù)據(jù)匯總表

使用GATK軟件[35]檢測親本和134個雜交后代與參考基因組之間的SNP位點，共檢測到SNP位點6 445 766個，平均每條染色體含有9 820個，不同染色體的SNP數(shù)量在278 600—525 072個，相對應(yīng)的SNP密度在7 858—11 097個/Mb；總體上，SNP標記的數(shù)量與染色體長度呈正相關(guān)，例如15號染色體長度最長（54.945 Mb），檢測到的SNP數(shù)量較多，為525 072個，其SNP密度為9 556個/Mb；在較短的1號染色體上檢測到的SNP數(shù)量最少，為278 600個，其SNP密度為8 539個/Mb（表2）。

表2 過濾前后染色體上的SNP統(tǒng)計

2.2 蘋果SNP標記的篩選和KASP引物設(shè)計

為獲得特異性強和準確性高的高質(zhì)量SNP位點，使用Vcftools、RepeatMasker以及blast等軟件對全基因組SNP篩選，去除缺失率＞30%，PIC＜0.2，以及截取SNP上、下游各50 bp序列內(nèi)還有其他變異的位點后獲得94 208個SNP位點。過濾后，SNP個數(shù)在3 216—7 431，相對應(yīng)的SNP密度在89—189個/Mb（表2）。對每個SNP標記進行KASP引物設(shè)計，有5 802個SNP位點設(shè)計成功，轉(zhuǎn)化成KASP標記，轉(zhuǎn)化后的KASP標記在蘋果各條染色體上的分布如圖2所示，開發(fā)的KASP標記覆蓋全部染色體，在各染色體上基本均勻分布，使用這些KASP標記進行后續(xù)群體進化及KASP標記注釋等分析。

橫坐標代表染色體的物理位置，窗口大小為0.1 Mb；縱坐標代表染色體；綠色到紅色代表KASP標記密度由低到高的區(qū)域

對開發(fā)5 802個KASP標記的SNP位點的缺失率、PIC、遺傳多樣性指數(shù)和觀測雜合度進行分析（圖3）?？梢钥闯觯@些SNP位點的缺失率在0—0.29，平均值為0.15；PIC在0.2—0.375，平均值為0.31，PIC＞0.35的SNP位點有1 748個，比例為30.13%，其中，Hardy-Weinberg檢驗≥0.01的SNP位點有717個，表明這些標記具有較高的多態(tài)性；Simpson遺傳多樣性指數(shù)在0.01—0.67，平均每個位點遺傳多樣性指數(shù)為0.53；觀測雜合度在0.05—1.00，平均值為0.32（圖3）。

2.3 雜交群體進化分析

基于開發(fā)的5 802個KASP標記對雜交群體分層分析，通過主成分分析，發(fā)現(xiàn)最大主成分為2.92，沒有主成分能明顯區(qū)分群體中的雜交后代（圖4-A）。隨后利用structure軟件分析群體的結(jié)構(gòu)，通過最大似然值進行群體劃分，結(jié)果顯示預(yù)設(shè)的不同祖先個數(shù)（K），沒有清晰的群體結(jié)構(gòu)存在，劃分的亞群間來源共同祖先的關(guān)系區(qū)分不明顯。由于此群體屬于雜交群體，有共同的親本，遺傳背景相似，因此，此群體未劃分出明顯的群體結(jié)構(gòu)。利用系統(tǒng)發(fā)育分析描述雜交后代之間的關(guān)系，結(jié)果顯示雙親及其134個雜交后代主要被分成9個主要分支，其中有5個后代與父本‘紅1#’組成一個分支，有28個后代與母本‘魯麗’組成一個分支，關(guān)系較密切，而其余后代分為7個分支，表明后代之間存在較強的遺傳變異（圖4-B）。

2.4 KASP標記注釋

利用ANNOVAR軟件對開發(fā)的全基因組KASP標記進行注釋。對KASP-SNP位點的變異類型進行分析，結(jié)果表明，SNP變異位點以轉(zhuǎn)換（transition，Ts）為主，約占65.3%，其中A/G和C/T SNP位點分別為30 595和30 523個，顛換（transversion，Tv）約占34.7%，A/T、C/G、A/C、G/T型SNP分別為9 073、5 082 、9 160和9 143個，堿基轉(zhuǎn)換發(fā)生頻率是顛換發(fā)生頻率的1.88倍（圖5-A）。

對KASP注釋位點的基因結(jié)構(gòu)分布區(qū)域分析，結(jié)果顯示，40 264個SNP位點分布在基因間區(qū)，約占43.03%，53 312個SNP（占56.97%）分布在基因區(qū)。對基因區(qū)的SNP位點分析，有15 839個位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游2 kb區(qū)域內(nèi)，有12 439個SNP位點位于轉(zhuǎn)錄終止位點下游2 kb區(qū)域內(nèi)。有13 615個SNP位點分布在內(nèi)含子區(qū)，3 596個SNP位點分布在外顯子區(qū)，3 401個SNP位點分布在非翻譯區(qū)。對分布于外顯子區(qū)的SNP位點進一步分析，有1 462個導(dǎo)致同義突變，2 078個導(dǎo)致非同義變異，44個SNP位點導(dǎo)致翻譯提前終止和12個SNP位點導(dǎo)致終止密碼子缺失（圖5-B）。

圖3 5802個SNP位點的缺失率（A）、多態(tài)信息含量（B）、遺傳多樣性指數(shù)（C）和觀測雜合度（D）變化分布圖

A：利用SNP標記對‘魯麗’ב紅1#’及其134個雜交后代進行主成分分析；B：系統(tǒng)發(fā)育分析

A：SNP位點變異類型及數(shù)目統(tǒng)計；B：SNP位點基因組分布區(qū)域注釋分析

2.5 KASP標記所在基因注釋和富集分析

基于蘋果紅葉品種‘紅1#’和綠葉品種‘魯麗’及其134個雜交后代全基因組重測序數(shù)據(jù)，獲得了含有KASP-SNP變異位點所在的25 761條基因信息。為全面理解基因功能信息，在GO數(shù)據(jù)庫中注釋到19 173個基因（圖6），在KEGG數(shù)據(jù)庫注釋到5 589個基因，這些基因被聚類到注釋到133條代謝途徑，參與碳水化合物代謝的基因數(shù)最多，為911個（圖7）。圖8顯示的是KEGG聚類中差異基因最顯著的前20個途徑，其中富集最顯著的通路為葉酸介導(dǎo)的一碳代謝途徑，富集因子為1.45。其次為泛醌和其他萜類-醌生物合成、卟啉和葉綠素代謝和甘油脂代謝。植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑富集到的差異基因個數(shù)最多為287個。這些代謝物質(zhì)和代謝通路可為紅葉和綠葉光合速率、葉綠素?zé)晒饧叭~綠素含量差異相關(guān)性狀的機理研究提供參考。

2.6 與葉片性狀相關(guān)的KASP標記驗證

為了解‘魯麗’ב紅1#’雜交群體的表型多樣性，利用SPASS 17.0軟件對親本及雜交后代葉片相關(guān)24個性狀進行表型描述性統(tǒng)計分析（表3）。結(jié)果顯示，親本‘魯麗’和‘紅1#’在葉片凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、葉綠素含量、花青素含量及單位面積電子傳遞的量子產(chǎn)額（ETo/CSo）等性狀均存在顯著差異。雜交后代表型變異幅度較大，各性狀分離明顯。如表3所示，雜交后代各性狀的表型值變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）變化范圍為6.12%— 84.19%，單位反應(yīng)中心耗散掉的能量（DIo/RC）的CV最高，進一步選擇的潛力較大，其次是花青苷，單位面積捕獲的光能（TRo/CSo）的CV最低。通過Shapiro-Wilk檢驗：胞間CO2濃度、Gs、蒸騰速率、葉綠素含量、葉面積等12個性狀表型呈正態(tài)分布（＞0.05），這些性狀為等效多基因控制的數(shù)量性狀。Pn、VPD、水分利用效率、花青素含量等其他12個性狀表型分布為偏態(tài)分布，表明這些性狀可能存在主效基因或非等效基因。

圖6 KASP標記所在基因的GO分類注釋圖

圖7 KASP標記所在基因的KEGG富集分析

表3 ‘魯麗’ב紅1#’雜交群體葉片性狀表型分析

Ci：胞間CO2濃度；Pn：凈光合速率；Gs：氣孔導(dǎo)度；Tr：蒸騰速率；VPD：葉面飽和蒸汽壓虧缺；WUE：水分利用效率；Vc：羧化效率；Chla：葉綠素a；Chlb：葉綠素b；Chl(a+b)：總?cè)~綠素；Anthocyanin：花青苷；Area：葉面積；Length：葉片長度；Width：葉片寬度；Perimeter：葉片周長；v/m：PSII最大光能轉(zhuǎn)化效率；ABS/RC：單位反應(yīng)中心吸收的光能；DIo/RC：單位反應(yīng)中心耗散掉的能量；TRo/RC：單位反應(yīng)中心捕獲的能量；ETo/RC；單位反應(yīng)中心用于電子傳遞的能量；ABS/CSo：單位面積吸收的光能；DIo/CSo：單位面積熱耗散；TRo/CSo：單位面積捕獲的光能；ETo/CSo：單位面積電子傳遞的量子產(chǎn)額。Non與Normal表示蘋果葉片不同性狀表型值正態(tài)性檢驗結(jié)果，前者為非正態(tài)分布，后者為正態(tài)分布（＞0.05）。不同小寫字母表示雙親葉片性狀表型值之間的差異顯著性（=0.05）。下同

Ci: Intercellular CO2concentration; Pn: Net photosynthetic rate; Gs: Stomatal conductance; Tr: Transpiration rate; VPD: Vapor pressure deficit; WUE: Water use efficiency; Vc: Ccarboxylation efficiency; Chla: Chlorophyll a; Chlb: Chlorophyll b; Chl(a+b): Total chlorophyll contents;v/m: Maximum quantum yield of PSII; ABS/RC: Aabsorption flux per reaction center; DIo/RC: Heat dissipation per reaction center; TRo/RC: Maximal trapping flux per reaction center; ETo/RC: Quantum yield of electron transport per reaction center; ABS/CSo: Absorption flux per cross-section; DIo/CSo: Heat dissipation per cross-section; TRo/CSo: Maximal trapping flux per cross-section; ETo/CSo: Quantum yield of electron transport per cross-section. Non and Normal represent non normally distributed and normally distributed for phenotypes of different traits, respectively (＞0.05). Different lowercase letters indicate significance between phenotype values of the leaf traits in both parents (=0.05). The same as below

Y軸代表各個KEGG通路的名稱；X軸代表富集因子。點的顏色代表q值的大小，點的大小代表注釋在該通路中基因的數(shù)目。q值的大小由點的顏色表示，q值越小，顏色越接近紅色，并且每個途徑涉及的基因的數(shù)量由點的大小表示

結(jié)合136個蘋果全基因組重測序數(shù)據(jù)，全基因組KASP標記以及基因功能注釋，對所有的KASP-SNP位點進行篩選。首先去除雙親基因型缺失，雙親間無差異及雜交后代不分離的SNP位點，隨后根據(jù)20個性狀表型數(shù)據(jù)，分別選出20株表型極端高的單株和20株極端低的單株，將SNP標記在極端表型中驗證，并對基因型進行卡方檢測，將卡方檢驗顯著的標記在38份種質(zhì)資源中驗證，最終開發(fā)了葉片性狀相關(guān)的KASP-SNP標記21個。其中與葉片長度相關(guān)的KASP標記4個，定位于9和15號染色體上；與葉片寬度相關(guān)的KASP標記4個，定位于5、11和14號染色體上。與葉面積相關(guān)的KASP標記有1個，位于15號染色體。與氣孔導(dǎo)度相關(guān)的KASP標記有2個，位于10號染色體上。與葉綠素a和葉綠素b相關(guān)的KASP標記有3個，位于11和16號染色體上，與花青素相關(guān)的KASP標記有1個，位于11號染色體上。與單位面積電子傳遞的量子產(chǎn)額相關(guān)的KASP標記有7個，位于5和14號染色體上（表4）。

利用這些KASP標記所在的基因及其功能注釋，篩選出與葉片葉綠素含量、氣孔導(dǎo)度性狀相關(guān)的候選基因。葉綠素b稱為光合作用的天線色素吸收光能。本研究中篩選到與葉片葉綠素b含量相關(guān)的KASP標記。該標記的A/C突變在母本‘魯麗’蘋果中的基因型為A:C，在父本‘紅1#’中的基因型為A:A。在其雜交后代葉綠素b含量極端高和極端低的各20個單株中A:A與A:C基因型分離比分別為8﹕6和15﹕1，2值為5.593，卡方檢驗達到顯著水平（20.05,1=3.84）。通過KASP標記所在的基因功能注釋，發(fā)現(xiàn)該標記位于乙烯響應(yīng)因子ERF轉(zhuǎn)錄因子家族的啟動子上。

氣孔導(dǎo)度是衡量植物與氣體間平衡的重要指標。本研究中，篩選到與氣孔導(dǎo)度性狀相關(guān)的KASP標記定位在蘋果8和10號染色體上，分別位于和啟動子上。在啟動子上T/C突變的KASP標記，在父本‘紅1#’中基因型為T:C，在母本‘魯麗’中的基因型為T:T，在各20株極端后代中T:T與T:C的分離比分別為8﹕9和14﹕3，2值為4.636，卡方檢驗達到顯著水平（20.05,1=3.84）。在啟動子上的A/G突變KASP標記，在父本‘紅1#’中基因型為G:G，在母本‘魯麗’中的基因型為A:G，在各20株極端后代中A:G與G:G的分離比分別為0:15和6:7，2值為8.811，卡方檢驗達到極顯著水平（20.01,1=6.63）。

表4 葉片性狀相關(guān)的21個KASP標記

*:＜0.05; **:＜0.01.20.05,1=3.84,20.01,1=6.63,20.05,2=5.99,20.01,2=9.21

3 討論

3.1 葉片相關(guān)性狀的候選基因預(yù)測

基于‘魯麗’和‘紅1#’及其134個雜交后代全基因組測序數(shù)據(jù)開發(fā)了全基因組KASP標記，KEGG聚類分析發(fā)現(xiàn)共有5 589個基因被聚類到133個途徑，其中差異基因富集最顯著的通路為葉酸介導(dǎo)的一碳代謝途徑。植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑富集到的差異基因個數(shù)最多。葉酸作為一碳單位的主要供體，在酶反應(yīng)中起到轉(zhuǎn)運一碳單位的作用，在植物中還參與了木質(zhì)素的形成以及光呼吸作用[39-40]。光呼吸與葉片光合作用密切相關(guān)，葉綠素b稱為光合作用的天線色素吸收光能。本研究中篩選到與葉片葉綠素b含量相關(guān)的KASP標記位于乙烯響應(yīng)因子ERF轉(zhuǎn)錄因子家族的啟動子上。ERF轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)被報道參與葉綠素合成與降解過程，如甜橙和，蘋果都能結(jié)合葉綠素降解相關(guān)結(jié)構(gòu)基因和啟動子，使和上調(diào)表達，從而促進果實或果皮葉綠素的降解[41-43]。

氣孔是光合作用吸收空氣中CO2的主要入口，氣孔導(dǎo)度（Gs）是衡量氣體通過氣孔的難易程度的重要指標，Gs越大，氣孔阻力越小，CO2和水汽等越易通過氣孔進行交換。目前普遍認為脫落酸含量與氣孔運動有關(guān)[44]，赤霉素[45]、油菜素內(nèi)酯[46]等植物激素在調(diào)節(jié)氣孔運動中也發(fā)揮重要作用，且大部分與ABA產(chǎn)生互作，共同調(diào)節(jié)Gs的變化。本研究中，通過KASP標記與性狀的相關(guān)性分析，結(jié)合基因功能注釋，重點篩選得到2個影響Gs的候選基因和。GID1（Gibberellin insensitive dwarf 1）為GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體。BSK1（BR-signaling kinase 1）為BR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的重要成員。根據(jù)雙親‘魯麗’（32×）和‘紅1#’（30×）的重測序數(shù)據(jù)，筆者實驗室建立了‘魯麗’ב紅1#’的高密度遺傳連鎖圖譜，利用該連鎖圖譜對蘋果葉片相關(guān)性狀進行了QTL定位，共定位了57個QTLs（數(shù)據(jù)未列出）。本研究中開發(fā)的KASP標記所在的基因、和均位于與葉片葉綠素b含量或氣孔導(dǎo)度相關(guān)的QTL區(qū)間，但是這些候選基因啟動子發(fā)生的突變是否影響其轉(zhuǎn)錄活性及影響葉片葉綠素含量或氣孔導(dǎo)度還需要進一步驗證。

3.2 蘋果葉片花青素對光合作用的影響

新疆野蘋果（Roem）是現(xiàn)代栽培蘋果（Borkh）的祖先種，遺傳多樣性豐富[47]。本研究所用的I型紅肉蘋果‘紅1#’屬于新疆紅肉蘋果（），是新疆野蘋果的變型，其枝葉都是紅色[28]。啟動子上的小衛(wèi)星重復(fù)序列調(diào)控紅肉蘋果果實著色的分子機制已有廣泛研究[48-50]，但是蘋果葉片色澤發(fā)育過程的分子機制至今尚不清楚。通過對紅葉桃的葉片著色性狀進行遺傳規(guī)律分析，發(fā)現(xiàn)桃葉片著色是一個質(zhì)量性狀，紅葉對綠葉為顯性，且該位點定位在桃基因組第6染色體上[51]。對該區(qū)間內(nèi)的進行表達量檢測，發(fā)現(xiàn)在紅葉桃中表達量顯著高于綠葉，過量表達能使桃葉片變紅，表明該基因控制桃葉片著色性狀，但是使在紅葉桃中表達量升高的變異位點還需探索[52]。

本研究中，‘紅1#’葉片為紅葉，‘魯麗’為綠葉，雜交后代的葉片全部表現(xiàn)為紅葉，表明蘋果葉片的著色性狀是顯性基因控制的質(zhì)量性狀。與蘋果中的轉(zhuǎn)錄因子（MDP0000573302）具有較高的相似性，與控制果肉著色的為同源基因，但是在這些基因上未找到與蘋果葉片花青苷含量顯著相關(guān)的遺傳變異位點。通過全基因組重測序，在11號染色體上獲得與蘋果葉片花青苷含量相關(guān)的KASP3343標記。該標記在20株花青苷含量極高的株系和20株極端低的株系中，3種基因型CC:CA:AA的比值分別為12﹕2﹕4和3﹕2﹕13，2檢驗達到極顯著水平。因此推測11號染色體上可能存在調(diào)控蘋果葉片色澤發(fā)育的位點，結(jié)合11號染色體上存在與互作的基因以提高蘋果果皮著色度的研究結(jié)果[14]，為進一步探討蘋果葉片色澤發(fā)育提供了參考。

已有研究表明，葉片變紅主要是由于葉片中產(chǎn)生了花青素類的紅色色素，新合成花青素需要消耗能量，可能使葉片光合效率降低[53-54]。然而本研究中，與綠葉相比，‘紅1#’葉片的PSⅡ的最大捕光效率（v/m）較高，單位反應(yīng)中心吸收的光能（ABS/RC）和單位反應(yīng)中心捕獲的能量（TRo/RC）顯著增加，而用于電子傳遞的能量（ETo/RC）顯著降低。v/m與非光化學(xué)猝滅有關(guān)，秋季葉片處于高光強下時，葉片捕獲的光能大于光能利用率，使葉片受到光損傷脅迫，而花青苷對葉片光合組織起到了光保護作用[55-56]。同時，紅葉通過減少用于電子傳遞的能量（ETo/RC）以緩解高光強對葉片的傷害。另外，紅葉中含有較高的黃酮類抗氧化化合物，這些物質(zhì)對葉片起到了光保護作用[54,57]。

4 結(jié)論

利用‘魯麗’‘紅1#’及其134個雜交后代全基因組重測序數(shù)據(jù)與參考基因組比對，共檢測到6 445 766個SNP位點。經(jīng)過濾后，將5 802個SNP位點成功轉(zhuǎn)化成KASP標記。通過對雜交群體葉片性狀表型值與KASP標記基因型進行相關(guān)性分析，結(jié)合KASP標記注釋，獲得了21個與葉片大小、氣孔導(dǎo)度和色素含量性狀顯著相關(guān)的KASP標記。

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Development and Validation of KASP Markers Based on a Whole- Genome Resequencing Approach in a Hybrid Population of Luli × Red No. 1

ZHENG WenYan1, CHANG YuanSheng1, HE Ping1, HE XiaoWen1, WANG Sen1, GAO WenSheng2, LI LinGuang1, WANG HaiBo1

1Shandong Institute of Pomology, Tai’an 271000, Shandong;2Shandong Agricultural Technology Extension Center, Ji’nan 250100

【Objective】A series of kompetitive allele-specific PCR (KASP) markers for traits related to apple leaves were developed to provide a reference to effectively utilize light in apple breeding using a Luli ×Red No. 1 hybrid population as materials. 【Method】This study investigated the leaf trait phenotypic data (including leaf length, width, contents of chlorophyll and anthocyanin, photosynthetic rate and chlorophyll fluorescence parameters) of Luli, a type I red-fleshed apple, Red No. 1, and 134 hybrids. Whole-genome resequencing was conducted on an Illumina HiSeq 2500 platform. The clean sequencing reads were mapped to the apple reference genome using BWA software. GATK software was used to identify single nucleotide polymorphisms (SNPs). 【Result】A total of 164 776 660, 149 482 876, and 3 927 370 200 clean reads were obtained by whole-genome resequencing from Luli, Red No. 1 and 134 hybrid individuals, respectively. The data were aligned to the reference genome sequences with mapping rates of 98.77%, 98.89%, and 97.79%, respectively. A total of 6 445 766 SNPs were identified. The SNPs were then filtered, and 94 208 accurate and high-quality SNPs were selected for subsequent KASP primer design. Finally, 5 802 KASP markers were developed based on a high-throughput whole-genome resequencing approach. The average polymorphism information content (PIC) of these KASP markers was 0.31, and there were 30.13% PICs＞0.35. The Simpson genetic diversity index ranged from 0.01 to 0.67, with an average value of 0.53. The mean observed heterozygosity was 0.32. A Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes enrichment analysis of the genes for KASP marker revealed that “one carbon pool by folate” was the most significant pathway. An analysis of the phenotypic data of leaf-related traits in both the parents and individuals from the Luli ×Red No. 1 cross showed that there were significant differences in the phenotypic values of leaf net photosynthetic rate, stomatal conductance (Gs) and other traits between the parents Luli and Red No. 1. The F1 generation exhibited a wide phenotypic variation, and the most traits segregated extensively. Α detailed study of the phenotypic data of leaf traits of the hybrid population with the genotype and annotations of the KASP markers finally resulted in the development of 21 KASP markers, which was correlated with leaf-related traits, including chlorophyll content, Gs and leaf length and width.【Conclusion】Use of the whole-genome resequencing data of Luli, Red No. 1 and 134 hybrid individuals resulted in the development of 5 802 KASP. A total of 21 of these KASP markers significantly correlated with leaf traits, which provided a theoretical reference for the high utilization of light energy in apple breeding.

apple; whole-genome resequencing; leaf-related traits; KASP marker

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.05.010

2022-04-26；

2022-07-14

山東省自然科學(xué)基金（ZR2021MC045）、山東省農(nóng)業(yè)良種工程項目（2021LZGC024）、國家自然科學(xué)基金（31901976）、泰山產(chǎn)業(yè)領(lǐng)軍人才工程項目（LJNY202026）、國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金（CARS-27）

鄭文燕，E-mail：1587493148@qq.com。通信作者王海波，E-mail：wanghaibo992@126.com。通信作者李林光，E-mail：llg6536@163.com

（責(zé)任編輯 趙伶俐）