潘鳳英，曲俊杰，劉露露，孫大運，郭澤西，韋曉麗，韋淑梅，尹玲

葡萄霜霉菌糖基水解酶基因的表達模式與功能分析

潘鳳英，曲俊杰，劉露露，孫大運，郭澤西，韋曉麗，韋淑梅，尹玲

廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學院廣西作物遺傳改良生物技術重點開放實驗室，南寧 530007

【目的】克隆葡萄霜霉菌（）糖基水解酶（glycosyl hydrolase，GH）基因（），分析其特征以及在葡萄霜霉菌侵染葡萄葉片過程中的表達模式，研究其抑制/促進煙草葉片程序性細胞死亡（PCD）以及影響煙草疫霉（）侵染的能力，為深入探究調(diào)控寄主植物免疫的機制提供理論依據(jù)。【方法】以葡萄霜霉菌Pv5-27菌株作為試材，采用RT-PCR方法擴增獲得8個基因全長，并對其基因及編碼蛋白進行生物信息學分析；利用酵母信號肽誘捕系統(tǒng)（SST）驗證PvGH的分泌活性；利用實時熒光定量PCR技術檢測葡萄霜霉菌侵染葡萄葉片過程中的表達模式；同時利用農(nóng)桿菌介導的PVX病毒表達系統(tǒng)在本氏煙上瞬時表達PvGH效應蛋白，分析其對INF1和BAX觸發(fā)的煙草PCD的抑制能力以及促進煙草疫霉侵染的能力?！窘Y(jié)果】8個基因序列與通過全基因組預測的序列完全一致，長度為1 092—1 392 bp，分別編碼364—464個氨基酸，與其他卵菌同源蛋白相似性高達60.62%—86.36%。8個PvGH均不含跨膜結(jié)構(gòu)域，其二級結(jié)構(gòu)差異較大，三級結(jié)構(gòu)與其他蛋白三級結(jié)構(gòu)相似性較低，呈現(xiàn)非常獨特的三級結(jié)構(gòu)。使用SingalP 5.0軟件對編碼的蛋白進行信號肽預測，發(fā)現(xiàn)它們均含有20—26 aa的信號肽，但通過SST驗證結(jié)果顯示PvG09279和PvG13517并不具有分泌特性。保留、缺失或者替換信號肽的8個PvGH均可抑制BAX觸發(fā)的本氏煙PCD，并促進煙草疫霉的侵染，表明PvGH效應蛋白發(fā)揮其毒力不依賴于信號肽。在葡萄霜霉菌侵染初期表達上調(diào)，進一步表明其在病原菌與寄主互作中的重要作用?！窘Y(jié)論】在侵染寄主過程中，葡萄霜霉菌分泌的PvGH通過抑制寄主PTI反應參與致病過程。

葡萄霜霉菌；糖基水解酶；生物信息學；功能分析

0 引言

【研究意義】由葡萄霜霉菌（）引起的霜霉病是全球葡萄產(chǎn)業(yè)共同面臨的一大卵菌病害，嚴重制約著葡萄與葡萄酒產(chǎn)業(yè)的綠色健康發(fā)展。該病原菌可以侵染葡萄的葉片、花序、幼果等幼嫩的綠色組織，在高溫、高濕的季節(jié)極易暴發(fā)成災。目前關于葡萄對霜霉病的抗性機制研究較多，但關于葡萄霜霉菌的致病機理研究較少。因此，明確葡萄霜霉菌糖基水解酶（glycoside hydrolase，GH）的蛋白特征和功能，能夠為進一步分析病原菌與寄主之間的相互作用機制提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M展】細胞壁是植物抵御病原菌侵染的一道天然屏障，由多糖、蛋白質(zhì)以及脂肪酸構(gòu)成。病原物在侵染的過程中會分泌一些效應因子干擾或者破壞寄主植物的免疫反應，促進其侵染和繁殖[1-3]。這些效應因子大都是一些激發(fā)子或細胞內(nèi)毒素等分子，能夠?qū)е录闹骷毎Y(jié)構(gòu)和功能的改變，從而激發(fā)或抑制植物的免疫反應。GH是一類重要的胞外效應因子，致病菌在侵染寄主植物過程中分泌的GH可以將植物多糖分解成寡糖或者單糖，從而破壞植物細胞壁結(jié)構(gòu)，使其突破寄主植物表皮障礙成功侵染寄主植物的同時汲取自身繁殖所需的營養(yǎng)物質(zhì)[4-7]。已有的研究表明，GH家族蛋白在侵染寄主的過程中不僅可以發(fā)揮毒力因子作用，幫助病原菌成功侵染植物[8-9]，而且在卵菌和真菌中還發(fā)現(xiàn)GH能夠作為病原體相關分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP），激發(fā)寄主活性氧迸發(fā)、胼胝質(zhì)積累、防衛(wèi)基因的表達和過敏性細胞壞死等典型的PAMP觸發(fā)免疫（PAMP-triggered immunity，PTI）反應[10-12]。例如，大豆疫霉（）PsXEG1[12]、灰葡萄孢（）的BcXYG1[13]和BcXYL1[14]、棉花黃萎病菌（）的VdEG1和VdEG3[15]以及膠酸裂解酶VdPEL1[16]和角質(zhì)酶VdCUT11[17]、尖鐮孢（）的FoEG1[18]均被發(fā)現(xiàn)在侵染過程中，不僅發(fā)揮毒力因子的作用，而且能夠作為PAMP，引起植物葉片死亡和誘發(fā)植物自身一系列的免疫反應。此外，還有一些GH被植物受體直接地識別為PAMP，調(diào)控植物免疫反應。例如，真菌內(nèi)聚半乳糖醛酸酶可以被擬南芥的富含亮氨酸重復序列類受體樣蛋白（LRR-RLP）AtRLP42識別為PAMP[19]；乙烯誘導木聚糖酶被番茄LRR-RLP的LeEIX識別并誘導傳遞過敏反應信號[20]。最近，從黃萎病菌中鑒定出一種新的乙烯誘導木聚糖酶VdEIX3，該蛋白被本氏煙（）NbEIX2識別為PAMP，誘導本氏煙產(chǎn)生免疫反應[21]?！颈狙芯壳腥朦c】盡管近年來的研究證明了GH家族在真菌和卵菌對植物宿主的入侵、致病性或毒力中的作用，但深入確切的機制仍然知之甚少。本項目組前期已完成了多個不同致病力葡萄霜霉菌菌株的全基因組測序[22]，并通過生物信息學方法從中挖掘出在多個菌株中高度保守的PvGH蛋白，這些保守PvGH蛋白在霜霉菌致病過程中的作用有待于驗證?！緮M解決的關鍵問題】解析葡萄霜霉菌分泌的PvGH蛋白在侵染寄主過程中的作用，為進一步研究葡萄霜霉菌與寄主之間的互作機制打下基礎。

1 材料與方法

試驗于2020—2022年在廣西農(nóng)業(yè)科學院廣西作物遺傳改良生物技術重點開放實驗室完成。

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 供試菌株葡萄霜霉菌Pv5-27，由本實驗室葡萄分子設計育種團隊分離純化并保存；由馬鈴薯X病毒（potato virus X，PVX）改造的植物雙元表達載體pGR107為南京農(nóng)業(yè)大學竇道龍教授饋贈；酵母菌株YTK12和酵母信號肽誘捕載體pSUC2由上海交通大學盧江教授饋贈；煙草疫霉（）由廣西農(nóng)業(yè)科學院劉增亮副研究員饋贈。

本氏煙置于25℃溫室中，16 h/8 h光暗交替培養(yǎng)4—5周使用。

1.1.2 試劑 植物總RNA提取試劑盒購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Takara（大連）公司；高保真DNA聚合酶、感受態(tài)細胞Fast-T1和克隆試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；膠回收試劑盒購自德國凱杰公司；質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技有限公司；酵母一步法轉(zhuǎn)化試劑盒、CMD-W培養(yǎng)基、YPRAA培養(yǎng)基購自北京酷萊博科技有限公司；熒光定量試劑盒購自廣州聚研生物科技公司；所用引物（表1）由南寧擎科生物有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1的克隆 提取葡萄霜霉菌Pv5-27菌株孢子囊和孢子囊梗的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。根據(jù)葡萄霜霉菌基因組預測的各基因全長，設計合適的引物，克隆，連接T載體，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5，提取質(zhì)粒，送至上海生工生物工程有限公司（上海生工）進行測序，將測序正確的質(zhì)粒保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PvGH蛋白的生物信息學分析 使用Protparam、Prot Scale、SingalP 5.0、TMHMM Server v.2.0、SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）和SWISS-MODEL（https:// swissmodel.expasy.org/）對PvGH蛋白的基本理化性質(zhì)、親/疏水性、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)分別進行預測分析。

1.2.3 PvGH信號肽功能驗證 根據(jù)1.2.2所預測的信號肽序列，設計相應引物，以1.2.1中的質(zhì)粒為模板，分別擴增PvGH的信號肽編碼序列。通過雙酶切連接方法構(gòu)建pSUC2--載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，提取質(zhì)粒，測序正確的pSUC2--質(zhì)粒及pSUC2-（陰性對照）、pSUC2-（陽性對照）使用酵母一步法轉(zhuǎn)化試劑盒轉(zhuǎn)化至YTK12，涂布于CMD-W培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)3 d，篩選轉(zhuǎn)化子。陽性轉(zhuǎn)化子分別轉(zhuǎn)接至以棉子糖作為全部碳源的YPRAA培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2 d。通過觀察缺陷型酵母對棉子糖的利用能力來判斷信號肽是否具有分泌功能。另外，從YPRAA培養(yǎng)基上挑取少量菌體接種于YPRAA液體培養(yǎng)基，30℃ 250 r/min培養(yǎng)過夜。吸取2 mL菌液到離心管中，700×室溫離心2 min收集菌體。使用滅菌水重懸菌體后離心去上清。用450 μL CMD-W液體培養(yǎng)基重懸菌體，加入50 μL 1% TTC溶液混勻后35℃孵育30 min，觀察各個樣品中溶液的顏色變化。

表1 本研究所用引物信息

續(xù)表1 Continued table 1

1.2.4 PVX表達載體的構(gòu)建 根據(jù)SignalP 5.0預測PvGH蛋白的信號肽序列，使用重疊PCR法，使得PvGH保留、去除信號肽以及替換為本氏煙PR1蛋白信號肽。使用CE Design軟件設計含有Ⅰ和Ⅰ酶切位點的引物，以保留、去除以及替換信號肽的相應質(zhì)粒為模板，擴增目的序列，利用同源重組的方式構(gòu)建含有目的序列的pGR107載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5感受態(tài)細胞，涂布至含100 mg·L-1卡那霉素的LB平板上，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。挑取單克隆并進行菌液PCR驗證后，將陽性克隆送至上海生工進行測序。選擇經(jīng)測序驗證序列正確的菌液保存并提取重組質(zhì)粒DNA，分別記為pGR107-、pGR107-、pGR107-PvGH。利用液氮凍融法分別將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞，隨機挑取單克隆使用菌液PCR方法進行驗證，驗證正確的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子用于下一步試驗。

1.2.5 瞬時轉(zhuǎn)化本氏煙研究PvGH功能 選用小鼠細胞凋亡誘導因子BAX和能激發(fā)PTI的致病疫霉（）PAMP激發(fā)子INF1作為細胞壞死激發(fā)因子。農(nóng)桿菌介導的本氏煙瞬時表達方法參考尹玲[23]，使用在溫室中生長30 d的本氏煙，用無針頭的1 ml注射器從背面注射含有pGR107-、pGR107-、pGR107-PvGH的農(nóng)桿菌重懸液至第3—6葉片中，以pGR107空載作為陰性對照，激發(fā)子BAX和INF1作為陽性對照，并做好標記。24 h后，在pGR107-、pGR107-、pGR107-PvGH區(qū)域注射含有不同激發(fā)子（BAX、INF1）的農(nóng)桿菌重懸液，暗光下培養(yǎng)5 d后觀察葉片注射區(qū)域壞死情況。每次試驗注射3株煙草，每株煙草注射3片葉子，重復3次。

1.2.6 葡萄霜霉菌侵染階段的表達 使用霜霉菌Pv5-27菌株侵染歐亞種‘赤霞珠’葡萄嫩葉葉盤，采集霜霉菌孢子囊期、游動孢子期以及侵染后12、24、48、72、96 h的材料，分別提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃保存?zhèn)溆?。以葡萄霜霉菌為?nèi)參，使用Roche 480熒光定量PCR儀測定的表達情況。實時熒光定量PCR反應體系20.0 μL：2×FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）10.0 μL，正、反引物各0.8 μL（10 μmol·L-1），cDNA模板2.0 μL，ddH2O 6.4 μL。擴增程序：95℃預變性10 min；95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，收集熒光信號，40個循環(huán)；95℃ 5 s，65℃ 60 s進行熔解曲線分析。采用2-??CT法，以孢子囊期基因表達量為對照，計算目的基因相對表達量，并采用SPSS25.0進行單因素方差分析。

1.2.7 本氏煙瞬轉(zhuǎn)PvGH蛋白對煙草疫霉侵染的影響 農(nóng)桿菌介導的本氏煙瞬時表達方法參考尹玲[23]，選擇在溫室中生長30 d的本氏煙，使用無針頭的1 mL注射器從背面注射含有pGR107-的農(nóng)桿菌重懸液至第3—6葉片的一側(cè)，另一側(cè)葉片注射pGR107-作為對照。2 d后摘下葉片，鋪在浸濕水的濾紙平板上。葉片的兩側(cè)分別用針頭刺傷，刺傷處各接種一個5 mm的25℃黑暗保濕培養(yǎng)生長4 d的煙草疫霉菌塊，菌絲塊與葉片背面接觸。置于25℃黑暗保濕培養(yǎng)2 d后，測量病斑長度并在紫外光下對侵染狀況進行觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 PvGH的克隆和蛋白結(jié)構(gòu)域分析

根據(jù)課題組前期對葡萄霜霉菌Pv5-27菌株全基因組測序得到的候選CDS序列，設計引物擴增8個基因序列。如圖1所示，PCR擴增得到符合預期大小的目的條帶，長度在1 092—1 392 bp。目的條帶經(jīng)回收、連接T載體、轉(zhuǎn)化大腸桿菌后進行測序，測序比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因序列與基因組預測的CDS序列完全一致，表明成功克隆了這8個，其編碼的蛋白序列長度為364—464 aa。NCBI同源比對分析發(fā)現(xiàn)，8個PvGH蛋白與大豆疫霉、丁香疫霉（）、致病疫霉、仙人掌疫霉（）等其他卵菌同源蛋白的同源性高達60.62%—86.36%；其中PvG02199與大豆疫霉GH7蛋白相似度最高，達86.36%（表2）。

1: PvG11117; 2: PvG13516; 3: PvG10113; 4: PvG01792; 5: PvG09279; 6: PvG02199; 7: PvG13517; 8: PvG13010

表2 PvGH及編碼蛋白序列特征

使用NCBI CDD和PFAM兩個數(shù)據(jù)庫對8個PvGH的氨基酸序列進行保守結(jié)構(gòu)域預測，發(fā)現(xiàn)兩個數(shù)據(jù)庫預測的結(jié)果基本一致，它們都含有GH家族結(jié)構(gòu)域（表2）。其中3個（PvG11117、PvG10113和PvG13010）含有糖苷水解酶Glyco_hydro_6亞家族保守結(jié)構(gòu)域，3個（PvG13516、PvG01792和PvG13517）含有Glyco_hydro_17亞家族保守結(jié)構(gòu)域，PvG09279含有糖苷水解酶Glyco_hydro_28亞家族保守結(jié)構(gòu)域，PvG02199含有Glyco_hydro_7亞家族的GH7_CBH_EG結(jié)構(gòu)域。此外，PvG10113除了具有保守的Glyco_hydro_6亞家族保守結(jié)構(gòu)域外，在羧基端還具有一個與細胞周期調(diào)控有關的DedD結(jié)構(gòu)域。分析跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽發(fā)現(xiàn)，這些PvGH蛋白在氨基端均含有長度為20—26 aa的信號肽，但均不含跨膜結(jié)構(gòu)域，都屬于分泌蛋白。

2.2 PvGH蛋白的二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)預測

利用SOPMA在線軟件和SWISS-MODEL對PvGH蛋白的二級、三級結(jié)構(gòu)預測分析。如表3所示，8個PvGH蛋白之間的二級結(jié)構(gòu)差異較大，其中PvG11117、PvG13516、PvG10113、PvG01792、PvG13517和PvG13010富含-螺旋和無規(guī)則卷曲，二者所占比例達到77.69%—82.77%；而PvG09279和PvG02199則以無規(guī)則卷曲和延伸鏈兩種結(jié)構(gòu)為主，二者所占比例超過77%；-轉(zhuǎn)角在這8個PvGH蛋白中所占比例均最少，僅占3.31%—7.78%。PvGH蛋白的三級結(jié)構(gòu)與數(shù)據(jù)庫中已知蛋白三級結(jié)構(gòu)相似性在24.49%—59.86%，其中有5個（Pv13516、Pv01792、Pv09279、Pv02199、Pv13517）相似性超過30%（表3）。利用SWISS-MODEL軟件對這8個PvGH蛋白進行同源建模，得到的三維效果圖如圖2所示。

2.3 PvGH信號肽功能驗證

將8個PvGH蛋白的信號肽編碼序列連接到pSUC2酵母信號肽誘捕載體質(zhì)粒上，利用酵母信號肽誘捕系統(tǒng)（SST）來驗證這些信號肽的分泌功能。結(jié)果如圖3所示，除了未轉(zhuǎn)質(zhì)粒的YTK12酵母菌不能在CMD-W培養(yǎng)基上正常生長外，所有轉(zhuǎn)化子都能正常生長，說明所有質(zhì)粒均成功轉(zhuǎn)入了YTK12酵母菌株。將陽性轉(zhuǎn)化子重新接種于YPRAA培養(yǎng)基，其中攜帶PvG11117、PvG13516、PvG10113、PvG01792、PvG02199、PvG13010這6個PvGH信號肽序列的轉(zhuǎn)化菌株與陽性對照菌株相同，可在棉籽糖為唯一碳源的YPRAA培養(yǎng)基上正常生長，這說明6個效應蛋白的信號肽均具有分泌活性，能夠使SUC2正常分泌到胞外，從而將棉籽糖分解為酵母可直接利用的單糖。相反地，攜帶PvG09279、PvG13517信號肽序列的轉(zhuǎn)化菌株則與陰性對照和缺陷型菌株YTK12相同，不能在YPRAA培養(yǎng)基上正常生長，不具備分泌特性。TTC顯色試驗結(jié)果進一步表明，PvG11117、PvG13516、PvG10113、PvG01792、PvG02199、PvG13010這6個PvGH的信號肽具有分泌活性，能夠?qū)⒄崽寝D(zhuǎn)化酶分泌到體外，將TTC還原成紅色的TTF，而PvG09279和PvG13517則不具有分泌活性。

表3 PvGH蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)

圖2 PvGH蛋白的三級結(jié)構(gòu)

圖3 PvGH預測信號肽的功能驗證

2.4 PvGH蛋白誘發(fā)或抑制煙草細胞死亡的能力

為了明確PvGH是否可以誘發(fā)或抑制本氏煙細胞死亡及其發(fā)揮功能是否需要作用于植物質(zhì)外體空間，利用overlap PCR方法，將PvGH的信號肽進行缺失和替換，分別構(gòu)建相應的pGR107表達載體，在本氏煙葉片上觀察PvGH全長、缺失和替換信號肽后誘發(fā)或抑制細胞死亡的能力變化。信號肽的替換是將PvGH的信號肽替換為本氏煙PR1蛋白的信號肽（圖4-A）。如圖4-B所示，8個保留、缺失或者替換信號肽的PvGH蛋白均不能直接誘導煙草細胞壞死，但它們均可完全抑制BAX觸發(fā)的煙草葉片PCD，暗示這8個PvGH效應蛋白具有潛在的毒性功能，可以抑制植物的免疫反應，而且其毒性功能不依賴于信號肽的存在。但是它們對于激發(fā)子INF1誘導的細胞壞死的影響卻不盡相同，其中5個保留、缺失或替換信號肽的PvGH蛋白（Pv11117、Pv10113、Pv01792、Pv09279、Pv13010）可以完全抑制INF1誘導的本氏煙葉片細胞壞死，而缺失信號肽的PvG13516只能部分抑制，缺失信號肽的PvG02199和PvG13517則完全不能抑制，但保留和替換PR1信號肽的PvG13516、PvG02199和PvG13517均可抑制INF1觸發(fā)的細胞死亡。上述結(jié)果說明，大部分PvGH抑制寄主PTI的能力不依賴于信號肽，而PvG02199、PvG13516、PvG13517抑制寄主植物PTI的能力則部分需要依賴于信號肽，將它們分泌到植物質(zhì)外體空間發(fā)揮作用。

n=27表示重復的葉片數(shù)n=27 represented the number of duplicate leaves。圖6同The same as Fig. 6

2.5 PvGH在葡萄霜霉菌侵染寄主過程中的表達模式

本研究中的是從多個葡萄霜霉菌基因組數(shù)據(jù)中預測得到的保守效應蛋白基因，尚未清楚其在Pv5-27菌株侵染寄主過程中是否表達及表達模式。使用實時熒光定量PCR技術對在霜霉菌孢子囊期、游動孢子期以及不同侵染階段的表達模式進行分析。以孢子囊期表達量為對照，計算各侵染階段的相對表達量。結(jié)果顯示（圖5），除外，其余7個均在游動孢子期表達量大幅增高，和在侵染后12 hpi（hours post-inoculation）或/和24 hpi的表達水平也存在不同程度的提高。這表明葡萄霜霉菌在孢子囊釋放游動孢子階段和侵染早期即大量表達，以幫助其降解寄主的細胞壁，或抑制寄主早期的PTI反應，從而有利于促進其成功侵染。僅在游動孢子期的表達量較高，僅在24 hpi表達量較高，為其余侵染時間點表達量的8.46—41.02倍，推測這兩個GH蛋白促進病原菌侵染的機制可能與其余6個GH蛋白不同。

孢子囊期：Sporangium stage；游動孢子期：Zoospore stage。柱上不同小寫字母表示差異顯著Different lowercases on the bars indicate significant differences (P＜0.05)

2.6 PvGH蛋白對煙草疫霉侵染的影響

煙草疫霉接種結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖6），與pGR107-對照相比，注射pGR107-葉片產(chǎn)生的病斑直徑顯著大于對照組，表明葡萄霜霉菌的8個PvGH蛋白均可促進煙草疫霉侵染。

*：在P＜0.05水平差異顯著significant differences at P＜0.05 level

3 討論

3.1 PvGH信號肽的分泌功能

分泌特性是效應蛋白發(fā)揮功能的必要條件，因為效應蛋白只有從病原菌中分泌出來，才能靶向寄主的特定組分發(fā)揮生物功能。本研究所利用的SST系統(tǒng)是一種檢測效應蛋白分泌特性的快捷而簡單的方法，已被用于植物病原菌效應蛋白分泌特性鑒定[24-26]。本研究中，葡萄霜霉菌的8個PvGH蛋白中有6個在該系統(tǒng)中展示出分泌特性，有2個未檢測出分泌活性?？紤]到該系統(tǒng)是異源表達，信號肽的識別可能受影響，因此該SST系統(tǒng)的檢測結(jié)果僅作為初步參考，對8個PvGH蛋白需要后續(xù)的生物學功能研究。

許多病原菌糖基水解酶與寄主植物的互作發(fā)生在植物質(zhì)外體空間。GH12家族的大豆疫霉PsXEG1蛋白[9]和尖鐮孢FoEG1蛋白[18]保留或替換為PR1信號肽的蛋白均能引起細胞壞死，但缺失信號肽的蛋白不能引起細胞壞死，說明這兩種半活體營養(yǎng)型病原菌的GH12蛋白需要在信號肽的作用下分泌到質(zhì)外體空間才可以發(fā)揮功能。與上述研究結(jié)果類似，PvG02199、PvG13516、PvG13517抑制INF觸發(fā)的細胞死亡的能力也要依賴于信號肽的存在。而與此相反，葡萄霜霉菌的8個PvGH蛋白抑制BAX引起的PCD完全不依賴于其信號肽的存在，這也暗示著GH蛋白在不同營養(yǎng)類型的病原菌中發(fā)揮作用的場所和作用機制有所不同。

3.2 PvGH在病原菌侵染過程中的功能

疫霉菌激發(fā)子蛋白INF1能夠在本氏煙葉片引起細胞死亡，激活植物的HR反應，被認為是卵菌的PAMP，其激活的HR反應被認為是PTI[27]。小鼠細胞促凋亡因子BAX在煙草葉片表達，也會引起煙草葉片細胞死亡，類似于抗病基因介導的HR反應[28]。本研究利用農(nóng)桿菌介導的PVX病毒表達系統(tǒng)在本氏煙上瞬時表達PvGH效應蛋白，分析其對INF1和BAX觸發(fā)的煙草細胞死亡的抑制能力。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葡萄霜霉菌在侵染寄主過程中，PvGH能夠抑制寄主PTI，具有潛在的毒性功能，幫助病原菌成功侵染寄主，但是都不能作為PAMP，在異源的煙草葉片上引起壞死反應。與活體營養(yǎng)的葡萄霜霉菌不同，GH在其他營養(yǎng)類型，尤其是死體營養(yǎng)的病原菌中，常常作為毒力因子并作為PAMP誘發(fā)寄主植物抗性反應，例如在半活體營養(yǎng)型的大豆疫霉中，GH12家族蛋白PsXEG1和GH7家族PsGH7a、PsGH7c不僅發(fā)揮毒力因子的作用，而且能夠作為激發(fā)子，誘發(fā)植物自身一系列的免疫反應[9,12,29-30]。死體營養(yǎng)型灰葡萄孢GH12家族的木葡聚糖酶BcXYG1，可在雙子葉植物中誘導強烈的壞死和抗性反應[13]；同樣地，來自死體營養(yǎng)型的棉花黃萎病菌的兩種具有纖維素酶活性的GH12蛋白VdEG1和VdEG3也被發(fā)現(xiàn)具有PAMP的功能，可以在本氏煙中觸發(fā)細胞死亡以及與其酶活性無關的免疫反應[15]。此外，來自死體營養(yǎng)型尖鐮孢GH12家族蛋白FoEG1，其酶活性為尖鐮孢毒力作出貢獻，并且還可以作為PAMP來誘導植物防御反應[18]。另外，灰葡萄孢的木聚糖酶BcXyl1和黃萎病菌的膠酸裂解酶VdPEL1、角質(zhì)酶VdCUT11也都可以作為PAMP促進毒力并同時觸發(fā)植物免疫[14,16-17]。因此，結(jié)合本研究的結(jié)果，筆者推測植物病原菌的GH效應蛋白功能差異可能與營養(yǎng)方式有關，活體營養(yǎng)型病原菌需要從寄主活細胞中吸取養(yǎng)分，因而需要與寄主細胞建立密切的關系并抑制寄主細胞死亡，從而保證其從寄主活細胞中不斷吸取養(yǎng)分，而死體營養(yǎng)型病原菌通常先殺死寄主細胞，然后從死亡的細胞中獲取營養(yǎng)。

3.3 PvGH蛋白異源表達

農(nóng)桿菌介導的煙草瞬時表達系統(tǒng)是病原菌效應蛋白功能研究中普遍使用的一種方法，但是Chen等在對炭疽菌（）效應子蛋白研究過程中建立了適用于葫蘆科植物的農(nóng)桿菌瞬時表達體系，并發(fā)現(xiàn)保守效應子蛋白NLP1和NIS1誘導煙草和甜瓜細胞的死亡與作用機制不同，NLP1切除信號肽（NLP1?SP）后表達在甜瓜子葉上，仍可清晰地誘導葉片細胞壞死，但在煙草上已完全失去活性，揭示了NLP1致死兩種植物細胞的機制存在本質(zhì)區(qū)別[31]。此外，番茄葉霉病菌（）的糖基水解酶CfGH17-1，在所測試的4個Moneymaker番茄系中，有3個番茄系會觸發(fā)細胞死亡，但在非宿主植物煙草中則不能引起壞死[10]。因此，在研究植物病原菌效應子蛋白的過程中，除利用常規(guī)的煙草農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系，還需要建立寄主植物相應的瞬時表達系統(tǒng)才能更好地探索病原菌效應子蛋白的功能。在本研究中，PvGH蛋白雖然都不能異源引起煙草葉片細胞的壞死，但在其寄主植物葡萄葉片中瞬時表達是否會有不同的結(jié)果，仍待進一步的深入研究。

4 結(jié)論

成功克隆了葡萄霜霉菌的8個，發(fā)現(xiàn)其均具有抑制煙草葉片細胞壞死和促進煙草疫霉侵染的能力，且大部分在游動孢子階段和侵染早期不同程度地上調(diào)表達，推測PvGH在侵染早期可以通過抑制寄主的免疫反應參與致病過程。

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Expression and Functional Analysis of Glycosyl Hydrolase Genes from

PAN FengYing, QU JunJie, LIU LuLu, SUN DaYun, GUO ZeXi, WEI XiaoLi, WEI Shumei, YIN Ling

Key Lab of Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning 530007

【Objective】The objective of this study is to clone glycosyl hydrolase genes from(s), analyze their characteristics and expression patterns in infected grape leaves, and the abilities to inhibit or promote programmed cell death (PCD) and affectinfectionin tobacco leaves, so as to provide a theoretical basis for further study on mechanism of regulating host plant immunity.【Method】Eights with full-length were amplified by RT-PCR fromPv5-27 strain. The sequences of these eights and encoded proteins were analyzed by bioinformatics. Yeast signal peptide trap system (SST) was used to verify the secretory activity of the PvGH proteins. The expression pattern ofs during infection grape leaves was detected by qRT-PCR. At the same time, eight PvGH effector proteins were transiently expressed inby-mediated PVX virus expression system. Moreover, their inhibitory abilities to inhibit INF1- and BAX-triggered PCD and to promoteinfection were also analyzed.【Result】The sequences of eights were completely consistent with the prediction in genome sequence, with the length of 1 092 to 1 392 bp, encoding 364-464 amino acids, respectively. The similarity with homologous proteins from other oomycetes was as high as 60.62%-86.36%. None of them had transmembrane domains. Their secondary structures were quite different from each other, and their tertiary structures were less similar to those of other proteins, which showed a very unique tertiary structure. SingalP 5.0 software was used to predict signal peptide of these proteins. It was found that all the PvGH proteins contained signal peptide sequences of 20-26 aa in length. However, the SST verification results showed that PvG09279 and PvG13517 do not have secretion activity. The retention, deletion or replacement of signal peptide sequences of the eight PvGH proteins could inhibit the BAX-triggered PCD and all these PvGH proteins could promoteinfectionin tobacco leaves. It suggests that the potential virulence of eight PvGH effectors does not dependent on the signal peptide. The up-regulated expression ofs in the early stage of infection offurther indicated that PvGHs play an important role in the interaction between pathogen and host.【Conclusion】During downy mildew infection, PvGHs secreted byare involved in pathogenic process by inhibiting the host PTI response.

; glycosyl hydrolase; bioinformatics; function analysis

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.05.006

2022-10-21；

2022-11-24

國家自然科學基金（31860493）、中央引導地方科技發(fā)展專項資金（桂科ZY21195039）、廣西重點研發(fā)計劃（桂科AB21076001）、“廣西八桂青年學者”專項、廣西農(nóng)業(yè)科學院基本科研業(yè)務專項（2021YT121）

潘鳳英，E-mail：251853746@qq.com。通信作者尹玲，E-mail：779335723@qq.com

（責任編輯 岳梅）