周文期，張賀通，何海軍，龔佃明，楊彥忠，劉忠祥，李永生，王曉娟，連曉榮，周玉乾，邱法展

調(diào)控玉米株高和穗位高候選基因的定位

周文期1，張賀通2，何海軍1，龔佃明2，楊彥忠1，劉忠祥1，李永生1，王曉娟1，連曉榮1，周玉乾1，邱法展2

1甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，蘭州 730070；2華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良全國重點實驗室，武漢 430070

【目的】株高是玉米株型育種的重要目標(biāo)性狀之一，不僅與玉米籽粒的機械化收獲及抗倒伏相關(guān)，也與玉米產(chǎn)量密切相關(guān)。因此，挖掘玉米株高QTL/基因并解析其功能具有重要的理論和育種價值，定位一個新的玉米矮稈基因，闡明其生物學(xué)功能，為加速改良玉米的株型提供重要的理論依據(jù)和基因資源?！痉椒ā坷没瘜W(xué)誘變劑甲基磺酸乙酯（EMS）誘變甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所自育玉米骨干自交系LY8405，M2后代分離獲得一個單基因調(diào)控隱性遺傳的玉米矮稈低穗位突變體，M3、M4后代能穩(wěn)定遺傳，命名為（），通過與Mo17雜交構(gòu)建F2分離群體，借助極端性狀混池測序分析法（BSA-seq）及目標(biāo)區(qū)段重組交換鑒定的方法，基于Mo17參考基因組對目標(biāo)區(qū)段內(nèi)的基因進行挖掘和功能注釋，定位候選基因。【結(jié)果】開展了表型鑒定，突變體苗期表型與對照LY8405無顯著性差異，成熟期植株株高和穗位高較LY8405分別降低87.2和55.4 cm，為35.0%和62.9%，差異極顯著。細胞形態(tài)學(xué)觀察表明，穗下節(jié)間數(shù)減少及節(jié)間細胞長度縮短是導(dǎo)致的株高和穗位高顯著降低的主要原因。利用F2﹕3遺傳群體，進行突變基因的遺傳分析，后代野生型和突變體植株分離比例符合3﹕1（χ2=2.854），說明突變基因為細胞核遺傳的單隱性基因。因此，根據(jù)BSA-seq結(jié)果，將候選基因初步定位在玉米第1染色體Bin1.09-1.10區(qū)段約15 Mb區(qū)間內(nèi)，進一步利用Mo17和重測序結(jié)果開發(fā)多態(tài)性分子標(biāo)記，通過圖位克隆手段精細定位目標(biāo)基因，最終將候選基因定位到約600 kb大小區(qū)間，該區(qū)間內(nèi)有16個候選基因。比對重測序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在第2 062位置堿基G變成A，導(dǎo)致氨基酸由甘氨酸變成絲氨酸，且轉(zhuǎn)錄水平表達比LY8405極顯著降低，第223位置堿基由T變成C，導(dǎo)致第75位氨基酸由絲氨酸變成脯氨酸，轉(zhuǎn)錄水平無顯著差異，通過對該候選區(qū)段群體關(guān)聯(lián)分析及功能注釋發(fā)現(xiàn)，和均與玉米生長發(fā)育相關(guān)?！窘Y(jié)論】定位到第1染色體末端Bin1.09區(qū)段候選基因，有效調(diào)控玉米株高和穗位高，精細定位縮小目標(biāo)區(qū)段至600 kb，區(qū)間內(nèi)與株高顯著關(guān)聯(lián)。

玉米；株高；穗位高；BSA-seq；基因定位；關(guān)聯(lián)分析

0 引言

【研究意義】玉米（L.）是集糧、經(jīng)、飼于一體的三元作物，是國內(nèi)外種植面積最大的農(nóng)作物之一，玉米生產(chǎn)對維護糧食安全、促進畜牧業(yè)發(fā)展、滿足工業(yè)原料需求等發(fā)揮舉足輕重的作用，對提高人們生活水平和國民經(jīng)濟收入具有非常重要的意義[1-2]。玉米株高（plant height，PH）和穗位高（ear height，EH）是影響產(chǎn)量和對某些非生物脅迫耐受性的重要農(nóng)藝性狀，因此，了解PH和EH的遺傳控制對闡明玉米生長發(fā)育的調(diào)控具有重要意義。【前人研究進展】PH和EH是與植物光合效率、種植密度、抗倒性和產(chǎn)量密切相關(guān)的重要農(nóng)藝性狀，縱觀農(nóng)業(yè)發(fā)展史，糧食作物整體株高的降低對世界農(nóng)業(yè)產(chǎn)生了深遠的影響[3]。從1960年以來，小麥和水稻半矮稈品種的大面積種植和推廣，以及后來“綠色革命”基因（）和（）的發(fā)掘，促進了小麥和水稻產(chǎn)量迅速增加，其中，參與了GA合成通路中GA20氧化酶（）的生物合成[4-5]，而作為GA信號通路上的抑制因子，編碼GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵調(diào)控元件DELLA蛋白[6]，二者的發(fā)現(xiàn)有效地將高稈變?yōu)榘捄桶氚?。然而，在玉米中這種能有效降低株高且對產(chǎn)量性狀沒有負效應(yīng)的半矮化基因已有應(yīng)用，但基因資源相對匱乏，亟待更多優(yōu)異等位基因的挖掘和利用。玉米育種的理想株型包括株型、葉型、穗型和生育期等，理想的株型能充分利用太陽能，最大程度提高玉米產(chǎn)量，現(xiàn)階段提高玉米種植密度已經(jīng)成為產(chǎn)量增加的最有效途徑之一，研究表明，PH與EH是直接影響玉米種植密度和產(chǎn)量的2個關(guān)鍵因子，并且還影響到玉米的抗倒伏性和收獲指數(shù)[7]。PH是由節(jié)間數(shù)目和節(jié)間長度構(gòu)成，因此，矮稈玉米主要通過減少節(jié)間數(shù)目和縮短節(jié)間長度來實現(xiàn)[8]。2003年，Multani等[9]利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法克隆了玉米矮稈基因（），編碼一個調(diào)控玉米莖稈中生長素極性運輸?shù)奶堑鞍?，由于糖蛋白的缺失，?dǎo)致玉米突變體穗下節(jié)間顯著縮短，PH和EH極顯著降低，莖稈變粗，雄穗和雌穗及葉片無顯著差異，因此，優(yōu)良的綜合性狀使在矮稈育種過程中發(fā)揮了重要作用，其等位基因在生產(chǎn)上被廣泛應(yīng)用[10]。前人研究已經(jīng)克隆了一些控制玉米PH的基因，也對玉米矮稈相關(guān)的突變體表型、控制PH和EH遺傳機制進行了闡述[11-12]。如，已經(jīng)公布的第1染色體有影響生長素極性運輸?shù)腫9-10]；與油菜素內(nèi)酯合成酶基因（）[13]、植物G蛋白基因（）[14]、赤霉素運輸相關(guān)DELLA蛋白基因（）[15]、（）[16]、玉米中葉綠體基因（）[17]、株高降低基因（）[18]和轉(zhuǎn)錄因子基因（）[19]；第2染色體有（）[20]和矮化基因[21]；第3染色體的（）[22]、（）[23]、（）[24]、[25]；第5染色體的矮小植株（）[26]、[27]、（）[28]、[29]；第6染色體的（）[30]、（）[31]；第8染色體有通過生長素合成途徑參與玉米株高調(diào)控的基因（）[32]、微管運動相關(guān)基因（）[33]、BR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因（）[34]、第9染色體有與赤霉素合成相關(guān)的[35-36]、與生長素轉(zhuǎn)運相關(guān)的（）[37]；第10染色體有與激酶調(diào)控相關(guān)的[38]等。以上基因大多數(shù)與激素合成、代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)，比如通過赤霉素合成途徑調(diào)控玉米PH和EH的基因有、、和等[17, 22, 36, 39]，通過赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與調(diào)控的有和[29]；通過生長素合成途徑參與調(diào)控的基因有[32]，通過生長素極性運輸調(diào)控的基因有、和等[9, 26, 37]。通過油菜素內(nèi)酯生物合成途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑分別參與玉米株高調(diào)控的相關(guān)基因有、、等[13, 24, 27]和[34]。在玉米育種中，PH和EH是影響玉米株型進而影響產(chǎn)量的重要農(nóng)藝性狀之一，矮稈玉米株型緊湊，穗位適中，更適合高密度種植，它能使作物具有較強的抗倒伏能力和較高的光能利用率?！颈狙芯壳腥朦c】雖然前人對控制玉米株高的QTL及基因進行了大量挖掘和克隆，但大多數(shù)突變體因過度矮化或不具備實用性的農(nóng)藝性狀，對玉米產(chǎn)量構(gòu)成因素產(chǎn)生不良效果，育種利用價值較小，因此，挖掘具有理想農(nóng)藝性狀的矮稈資源，克隆能降低玉米PH和EH，且對產(chǎn)量無負效應(yīng)的關(guān)鍵基因，對選育耐密植、宜機收新品種具有應(yīng)用價值?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究擬克隆玉米候選基因，解析調(diào)控玉米株高的遺傳機理并評估其育種價值，為加速矮化株型改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

玉米骨干自交系LY8405（甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自育自交系，以美國雜交種先玉335為基礎(chǔ)材料，經(jīng)過連續(xù)8代以上的自交選擇育成純系，屬于SS類型），花粉經(jīng)EMS誘變處理（未處理的LY8405為對照），誘變處理參考周文期等[40-41]，收獲M0代，在甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院張掖試驗場和海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院樂東縣試驗基地，夏季和冬季分別交替種植，M2后代篩選分離到矮稈低穗位核隱性遺傳突變株，M3、M4后代能穩(wěn)定遺傳，命名為（），本研究對突變體和突變體進行等位性檢測，發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致矮化的可能是一個不同于的新基因。因此，將與LY8405回交，獲得BC2F2代植株，進行候選基因定位。

1.2 BC2F2遺傳分離群體的構(gòu)建

前期研究經(jīng)過正反交測定，表型是核單基因隱性遺傳突變引起。利用與LY8405進行2代回交，純化突變基因，獲得BC2材料，再與不同基因型自交系Mo17雜交，F(xiàn)1代自交，構(gòu)建BC2F2分離群體，從F2中分離純合株，用于候選基因的定位。

1.3 候選基因的初步定位

利用二代測序技術(shù)，根據(jù)BSA極端性狀混池測序原理，提取親本LY8405、和Mo17親本各3株，選擇Mo17×2子代池株高和穗位最高的植株30株，株高和穗位最低的植株30株，混池提取其RNA，建庫進行轉(zhuǎn)錄組測序，DNA水平的全基因組測序提取了PH和EH極高和極低植株各100株。在分離群體搭建過程中，子代會根據(jù)表型進行選擇，篩選出突變型子代池和野生型子代池，根據(jù)遺傳連鎖交換定律，子代池的基因型會和表型產(chǎn)生共分離，反映在物理圖譜層面，與表型連鎖的染色體區(qū)段會和不連鎖的染色體區(qū)間產(chǎn)生穩(wěn)定的SNP-index差異。差異大小范圍為0—1。若該參數(shù)為0，代表子代所有測到的Reads都來自野生親本；若該參數(shù)為1，代表子代所有Reads都來自突變親本；該參數(shù)為0.5，則代表此子代混池中SNP來自2個親本基因組的頻率一致[42-43]。

1.4 基因型的鑒定及候選基因的精細定位

利用圖位克隆和全基因組高通量測序技術(shù)相結(jié)合，確定候選基因。在玉米抽穗期，用取樣器進行取樣，葉片面積約1 cm2，采用CTAB法提取葉片DNA。采用NanoDro2000檢測提取的DNA質(zhì)量和濃度。將提取的DNA稀釋到合適濃度進行PCR擴增，引物序列見表1。擴增的PCR產(chǎn)物用全自動毛細管電泳系統(tǒng)（大片段分析儀）或者聚丙烯酰胺凝膠電泳進行基因型分型。SSR、InDel標(biāo)記根據(jù)差異帶型分別標(biāo)記為A、B、H，與LY8405帶型一致的記為A，與Mo17帶型一致的記為B，雜合帶型記為H，缺失帶型記為—，N表示樣品數(shù)。根據(jù)以下公式計算突變基因重組交換率，交換率越低，說明分子標(biāo)記距離候選基因位置越近。

交換率=[(2×B+1×H+0×A)/N×2]×100%。

表1 本研究使用的部分引物序列

2 結(jié)果

2.1 Zmdle1與LY8405苗期表型無顯著差異

在LY8405誘變材料中，M2代分離到1個株型矮化、穗位高度極顯著降低突變株，M2分離比例符合3﹕1（野生型﹕突變株），M3和M4矮稈低穗位性狀純合且穩(wěn)定遺傳，該突變體苗期表型與對照LY8405無明顯差異（圖1-A—F），浸種發(fā)芽后3 d，LY8405平均株高6.9 cm，根長6.0 cm，平均株高6.8 cm，根長6.1 cm，無差異。統(tǒng)計第7、14、21、28和35天生長的LY8405和莖葉長度，均無顯著差異（圖1-G）。田間種植表型觀察，植株第六片葉展開，第七片葉露出葉心時期逐漸表現(xiàn)出株高差異，后期越來越明顯，成熟期植株P(guān)H和EH較對照LY8405分別降低了87.2和55.4 cm，為35.0%和62.9%，差異極顯著（＜0.01），將其命名為矮稈低穗位突變體（，，表2和圖2）。

A：萌發(fā)后3 d的植株，株高及根長無顯著差異，標(biāo)尺=5 cm；B—F：分別表示種子萌發(fā)后生長7、14、21、28和35 d的植株表型；G：苗期株高，無顯著差異。標(biāo)尺=10 cm

2.2 Zmdle1與LY8405成熟期PH和EH的差異性

野生型LY8405成熟期株高平均為248.9 cm，穗位高為88.1 cm；株高為161.7 cm，與LY8405相比，平均降低了87.2 cm，約下降35.0%，穗位高僅為32.7 cm，平均降低了55.4 cm，約下降62.9%，差異極顯著（＜0.01）（表2、圖2-A—B和圖2-D）；分別與Mo17和B73雜交，F(xiàn)2后代分離到表型穩(wěn)定的（圖2-C）。對和LY8405植株節(jié)間數(shù)及節(jié)間長度進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)LY8405和總節(jié)間數(shù)相同，都有15個節(jié)間（部分共14節(jié)），但是LY8405穗上共8節(jié)，穗下7節(jié)，而穗上9節(jié)或8節(jié)，穗下6節(jié)，穗位降低一個節(jié)間，且穗位節(jié)、穗上3節(jié)和穗下3節(jié)長度均極顯著減?。▓D2-E，穗上節(jié)橙色標(biāo)注極顯著性差異，穗下節(jié)藍色標(biāo)注極顯著性差異），說明穗下節(jié)間數(shù)減少及節(jié)間長度縮短是導(dǎo)致的PH和EH顯著降低的主要原因。

為了更直觀地看到PH和EH降低的原因，將整株植株進行節(jié)間剖析，發(fā)現(xiàn)穗位節(jié)第7節(jié)降低，與LY8405相比，穗位節(jié)節(jié)下部分降低最為顯著（圖3-A，1—7節(jié)），穗上節(jié)1—2節(jié)差異較為顯著，其他節(jié)間長度差異不明顯；隨后利用不同生育期的植株切片觀察，統(tǒng)計每個節(jié)間的細胞形態(tài)及數(shù)目，數(shù)據(jù)顯示節(jié)間細胞總數(shù)目并未減少，莖節(jié)細胞長度變短導(dǎo)致節(jié)間長度縮短，從而降低PH和EH（圖3-C—E）。另外，株型矮小，與LY8405相比，其根系顯著變小，須根沒有對照發(fā)達（圖3-B）。

A、B：Zmdle1突變體比LY8405株型矮小，穗位更低；C：LY8405×Mo17，F(xiàn)2分離出Zmdle1純合表型，矮稈低穗位；D：PH和EH統(tǒng)計；E：LY8405和Zmdle1節(jié)間數(shù)及每一節(jié)的長度，共15節(jié)，穗位節(jié)及穗上三節(jié)（橙色）和穗下三節(jié)（藍色）均差異極顯著。標(biāo)尺=30 cm。**表示差異極顯著（P＜0.01）

2.3 Zmdle1和LY8405其他農(nóng)藝性狀調(diào)查對比

LY8405與雌雄穗發(fā)育、授粉結(jié)實均正常，說明PH和EH降低的同時，未影響果穗的正常結(jié)實（圖4），穗長及穗粗沒有顯著變化（=0.16），禿尖稍長（圖4-A）。統(tǒng)計測量了雌穗穗長、穗粗、軸粗、穗行數(shù)和行粒數(shù)，除軸粗有顯著差異外，其他農(nóng)藝性狀均無顯著性變化（表2），但是粒型性狀發(fā)生了明顯變異，相比LY8405，粒長變短，粒寬變寬，差異極顯著（＜0.01）（表2和圖4-G—H）；而千粒重平均為300 g，無顯著差異（表2、圖4-C和圖4-E）。與LY8405總?cè)~片數(shù)目相同，均為20—21片。與LY8405相比，倒3葉變長、變窄，差異顯著（＜0.01）（表2和圖4-B）；雄穗穗長無變化，但雄穗分枝數(shù)較LY8405減少（表2和圖4-F），開花期提前5—7 d。上述農(nóng)藝性狀的調(diào)查結(jié)果表明，除PH和EH降低，其他農(nóng)藝性狀如生育期、籽粒及根等也發(fā)生了一些改變，但是該突變體區(qū)別其他已報道的株高極度矮化突變體，其單株產(chǎn)量及千粒重并沒有下降，是一個新類型的株高突變體。

表2 突變體Zmdle1和對照LY8405的農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)分析

*表示差異顯著（＜0.05），**表示差異極顯著（＜0.01）。下同

* mean significant difference with the control (＜0.05), ** mean very significant difference (＜0.01). The same as below

A：Zmdle1與LY8405每節(jié)節(jié)間圖，Zmdle1穗下節(jié)及穗上2節(jié)均較LY8405短；B：Zmdle1的根較LY8405變??；C、D：LY8405與Zmdle1穗下莖細胞的電子掃描形態(tài)圖；E：穗下莖節(jié)縱面細胞長度。A、B標(biāo)尺=5 cm；C、D標(biāo)尺=200 μm

A：Zmdle1與LY8405果穗，結(jié)實良好；B：從左往右，分別是劍葉、倒2葉和倒3葉，Zmdle1倒3葉葉片變長，變窄；C、E：穗部和籽粒性狀；D：Zmdle1與LY8405幼穗發(fā)育正常，無差異；F：LY8405和Zmdle1雄穗發(fā)育正常，Zmdle1分枝數(shù)明顯減少2—4個，花期提前一周；G、H：Zmdle1籽粒粒長較LY8405變短，粒寬變寬，n=20。A、B、D—H：標(biāo)尺=5 cm；C：標(biāo)尺=2 cm

2.4 Zmdle1遺傳群體構(gòu)建及分離規(guī)律分析

將分別與Mo17和B73雜交，構(gòu)建了兩套F2遺傳群體，對F2后代分別進行遺傳統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)×Mo17 F2群體中，野生型和突變體植株分離比例符合3﹕1（χ2=2.854）（表3），說明突變基因為細胞核遺傳的單隱性基因。但是×B73 F2群體中分離到純合表型植株明顯減少，分析其原因是LY8405自交系中含有20%—30%的B73基因型，突變體與B73雜交，后代親緣關(guān)系較近，基因型未能發(fā)生充分重組交換及分離，因此，本研究利用×Mo17雜交F2:3遺傳群體，進行候選基因精細定位。

表3 F2群體中正常植株和矮稈植株的分離比檢測

2.5 轉(zhuǎn)錄組測序及候選基因初定位

利用BSA及BSR極端分離群體混池測序的原理，對F2后代PH和EH極高和極矮2種極端性狀植株，分別選取30株，取倒3葉葉片（葉片變長變窄的表型與株高表型連鎖，且有差異顯著性），等量混合提取RNA，2個親本（Mo17、）各取3株，設(shè)置3個重復(fù)，進行了親本及子代的轉(zhuǎn)錄組測序。通過Trimmomatic軟件對12個樣本的原始數(shù)據(jù)進行過濾截短，去除低質(zhì)量堿基得到用于后續(xù)分析的過濾后數(shù)據(jù)，并且使用一種基于java的軟件fastqc進行數(shù)據(jù)質(zhì)控分析。對于每個SNP，使用經(jīng)驗貝葉斯方法來估計SNP標(biāo)記與突變體庫中的基因之間沒有重組的條件概率，給定SNP等位基因的特異性計數(shù)。而為了獲得最有可能與給定基因相關(guān)的區(qū)域，通過用固定數(shù)量的SNP（N=50）和步長為5個SNP的滑動窗口掃描整個基因組。結(jié)果表明，主要在第1染色體末端和第3染色體中部有顯著效應(yīng)位點，散點位置ΔSNP-index值大于0.5，說明候選基因可能位于該2個區(qū)間的一個之內(nèi)，推測控制PH和EH的主效基因可能位于第1染色體末端Bin1.08—1.10區(qū)間，或第3染色體Bin3.07—3.08位置（圖5）。

2.6 Zmdle1基因組重測序及候選基因連鎖定位分析

分析轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，散點不集中，定位區(qū)間不理想，因此，后續(xù)研究擴大分離群體樣本，種植約4 000株，再次采集了100株F2后代PH和EH極高、極低2個極端植株的倒3葉葉片，混池提取DNA，親本取樣3株，3個重復(fù)，進行了全基因組高通量測序，定位候選基因，分析數(shù)據(jù)時，選取ΔSNP-index定位，在超出置信線的染色體區(qū)域內(nèi)篩選候選基因，定位到2個區(qū)間，即第1染色體末端位置（圖6，黑色方框標(biāo)出）和第5染色體，置信區(qū)間更高。因此，結(jié)合RNA轉(zhuǎn)錄組和DNA的高通量測序數(shù)據(jù)，第1染色體末端區(qū)間在2次測序結(jié)果中均有定位，且物理位置完全吻合，確定為候選基因區(qū)段。通過對第1染色體Bin1.07、Bin1.08、Bin1.09及Bin1.10位置多態(tài)性分子標(biāo)記篩選，約65對引物可利用LY8405和Mo17親本區(qū)別的多態(tài)性標(biāo)記，其中BKN2-8和umc2510標(biāo)記位置交換頻率約為15%（表4），因此，將候選基因區(qū)間初步定位在Bin1.09、BKN2-8和umc2510標(biāo)記間，約為6.5 Mb。

表4 初步定位標(biāo)記與表型的交換頻率

2.7 候選基因ZmDLE1精細定位

以BC2F2分離群體為材料，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序及重測序初步定位結(jié)果，將第1染色體末端區(qū)間的多態(tài)性分子標(biāo)記用于F2分離群體的基因型驗證和分析，確保了該位點的準確性，定位到1 Mb區(qū)間。進一步開發(fā)并加密新的分子標(biāo)記，利用BSA測序結(jié)果對LY8405、和Mo17及其子代DNA測序的大數(shù)據(jù)，設(shè)計和篩選有較多堿基差異（＞10 bp）的多態(tài)性分子標(biāo)記（表1），利用4 000株F2純合表型單株，將目標(biāo)基因精細定位在InDel-25和InDel-26之間約600 kb（255.26—255.86 Mb）的區(qū)間內(nèi)（圖7），區(qū)間內(nèi)有16個候選基因。利用重測序數(shù)據(jù)分析，以及功能注釋和關(guān)聯(lián)群體的SNP關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明，的cDNA全長為2 145 bp，在第2 062位置堿基G變成A，導(dǎo)致第688位置的氨基酸由甘氨酸（G）變成絲氨酸（S），且轉(zhuǎn)錄水平檢測基因表達量比LY8405極顯著降低（表4），的cDNA全長共1 416個堿基，第223位置堿基由T變成C，導(dǎo)致第75位氨基酸由絲氨酸（S）變成脯氨酸（P），轉(zhuǎn)錄水平無顯著差異（表5）。提取513份關(guān)聯(lián)群體中定位區(qū)段內(nèi)的多態(tài)性數(shù)據(jù)（SNP和Indel標(biāo)記）和株高表型數(shù)據(jù)，使用Tassel 5軟件的GLM方法進行候選區(qū)段關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果顯示，存在于株高顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點（圖8）。綜上，確定主要候選基因是和，編碼擴展蛋白Expansin-4蛋白，編碼生長素相關(guān)PINOID蛋白激酶，均可能通過植物細胞擴張、激素調(diào)節(jié)等影響植物的生長發(fā)育，確定為重點基因，下一步將進行測序驗證、生物信息學(xué)分析和功能解析，確定功能基因。

黑色方框標(biāo)出可能存在的候選基因區(qū)間Black boxes indicate possible candidate gene intervals

ΔSNP-index為該群體的連鎖定位圖。黑色方框標(biāo)出可能存在的候選基因區(qū)間。綠色點和藍色點為SNP-index或ΔSNP-index；紅色線為SNP-index或ΔSNP-index劃窗后的擬合線；紫色線為95%置信線；橙黃色線為99%置信線；SNP-index (highbulk)為突變子代的連鎖定位圖；SNP-index（lowbulk）為野生子代的連鎖定位圖

圖7 ZmDLE1候選基因的精細定位圖

表5 區(qū)段內(nèi)候選基因

株高性狀關(guān)聯(lián)位點基因是Zm00001d033231 The gene associated with plant height trait was Zm00001d033231

3 討論

3.1 Zmdle1株高和穗位降低主要原因是穗下節(jié)間數(shù)目的減少和莖節(jié)間細胞縮短

矮稈基因是導(dǎo)致株高矮化的直接原因，表現(xiàn)在作物細胞學(xué)和形態(tài)學(xué)的變化。從形態(tài)上觀察，植株矮化直接表現(xiàn)在節(jié)間數(shù)目的減少或者節(jié)間長度的變短，或兩者同時變少，導(dǎo)致株高降低；從細胞水平觀察，株高矮化作物莖節(jié)間單位面積內(nèi)細胞數(shù)目減少以及單個細胞的縱向平均長度減小，或兩者同時變小，均會導(dǎo)致玉米植株的矮化[8]。因此，通過改變總節(jié)間數(shù)量和單個節(jié)間長度可產(chǎn)生株高差異，而獨立的莖節(jié)長度又與莖稈細胞的縱向長度和單位面積的細胞數(shù)目密切相關(guān)[44-45]。Tang等[44]研究說明玉米株高的變化主要因為平均莖稈節(jié)間長度的改變。Salvi等[45]在對玉米穗上部、穗下部節(jié)間數(shù)目的研究分析發(fā)現(xiàn)，穗下節(jié)間數(shù)的差異與PH顯著相關(guān)，莖稈節(jié)間數(shù)目的變化導(dǎo)致了PH的升高或降低。Lv等[46]研究發(fā)現(xiàn)玉米突變體莖稈縱切面單個莖節(jié)細胞大小沒有顯著差異，但突變體莖稈節(jié)間細胞排列緊湊，數(shù)目減少，導(dǎo)致PH明顯降低。以上研究結(jié)論同本文的研究結(jié)果一致。本研究中，與LY8405相比，穗下節(jié)間數(shù)減少，且細胞學(xué)觀察表明，與LY8405縱向細胞數(shù)目不變，細胞長度顯著變短，可能是突變體中細胞伸長受到了抑制。莖的伸長過程受赤霉素、生長素和油菜素內(nèi)酯等植物激素的調(diào)控，生長素合成受阻或信號傳導(dǎo)中斷最顯著的表現(xiàn)就是植株矮化。同時，根細胞的伸長可能受到不同程度抑制，與LY8405相比，突變體的根系變小，根系發(fā)達程度降低，可能會存在潛在倒伏風(fēng)險，但因為PH和EH極顯著降低，尤其是平均穗位高僅有33 cm，使整個植株重心下移，不同生態(tài)環(huán)境輪替田間種植了6年，未發(fā)生倒伏現(xiàn)象，與其他自交系組配的雜交種，田間種植3年以上，也未發(fā)生倒伏。

3.2 植物激素調(diào)控玉米株高相關(guān)基因研究進展

目前研究表明調(diào)控玉米株高涉及到的植物激素主要有赤霉素（gibberellin，GA）、油菜素內(nèi)酯（brassinolide，BR）及生長素（Auxin）[47]。GA是一類廣泛存在的植物激素，其化學(xué)結(jié)構(gòu)屬于四環(huán)二萜類化合物，對植物生長發(fā)育、開花結(jié)果、發(fā)育及成熟等都有作用，尤其對于莖稈伸長發(fā)揮關(guān)鍵作用。鑒別獲得如、、、、、等多個突變體與GA合成相關(guān)，此類突變體中活性赤霉素含量大幅減少，植株表現(xiàn)出矮化現(xiàn)象，如是一個與赤霉素合成相關(guān)的基因，阻止GA20向GA1的轉(zhuǎn)化，編碼細胞色素P450類蛋白，參與GA合成早期階段GA12向GA53的轉(zhuǎn)化，從而影響玉米株高[3, 22, 35]。AN1參與GA生物合成途徑中貝殼杉烯的合成，影響赤霉素的合成途徑，最終抑制莖間細胞的伸長，導(dǎo)致玉米植株矮化[17]。DELLA蛋白是GA信號通路的重要負調(diào)控因子，可阻斷GA誘導(dǎo)的基因表達，玉米中與“綠色革命”基因高度同源的和基因顯性突變均可引起玉米株高顯著降低[29, 48]。BR是一類多羥基的類固醇植物激素，也是促進植物節(jié)間伸長的內(nèi)源激素之一，調(diào)控植株高矮。突變體和都涉及到BR合成途徑，突變體嚴重矮化，節(jié)間距很短，莖節(jié)不伸長，沒有成熟的花粉，根數(shù)減少，編碼BR合成途徑中的C-6氧化酶[13]。（）突變體中株高降低，節(jié)數(shù)不變，株高的降低是由于節(jié)間長的縮短導(dǎo)致的，葉片長度為野生型的60%，是擬南芥的同源突變，發(fā)生了終止突變，導(dǎo)致油菜素內(nèi)酯合成受阻[24]。與擬南芥同源，突變體極端矮化，雄穗結(jié)粒雌穗小花等表型，在還原24-methyhloesterol的C-24過程中存在缺陷[27]。Auxin合成、分布、代謝及其極性運輸和不平均分布影響植物的生長發(fā)育，可促進細胞擴增及伸長，從而影響到植物的莖稈伸長。玉米短軸突變體，節(jié)間顯著縮短，尤其果穗下部節(jié)間位點縮短導(dǎo)致PH和EH極顯著降低，參與調(diào)控生長素極性運輸，調(diào)節(jié)玉米莖的生長發(fā)育[9]。Li等[37]發(fā)現(xiàn)表達產(chǎn)生PIN- FORMED（PIN）蛋白影響IAA的極性運輸，將IAA從植株莖稈中運輸?shù)礁浚偈褂衩讉?cè)根增加，抑制地上組織莖的節(jié)間伸長，過表達會降低株高、節(jié)間長和穗位高。而本研究的突變體具有典型的生長素調(diào)控基因類型的表型，突變體株高矮化，穗位高降低顯著。

3.3 關(guān)鍵候選基因功能預(yù)測和同源基因分析

本研究將控制株高基因初步確定為候選基因為和，（Chr.1：255266246-255275500）編碼Expansin-B4，同源性分析發(fā)現(xiàn)，該基因在擬南芥中的同源基因是，該蛋白通過調(diào)控細胞壁的松弛程度參與植物激素調(diào)節(jié)、細胞擴張等植物生長過程[49]。前人研究發(fā)現(xiàn)擴展蛋白（Expansins）是一類細胞壁蛋白，Expansin蛋白可分為4個亞家族-expansin A（EXPA）、EXPB、expansin-like A（EXLA）和EXLB，能夠通過打斷細胞壁多聚物之間的氫鍵誘導(dǎo)酸依賴的細胞壁延展和壓力松弛[50-51]。在植物細胞的伸展及一系列涉及細胞壁修飾的生命活動中，Expansin蛋白起著關(guān)鍵作用。例如在水稻中，細胞壁松弛蛋白OsEXPA4的表達對莖稈節(jié)間的伸長起著關(guān)鍵作用，在植物組織伸長區(qū)特異性表達，過量表達或者抑制其表達都會影響組織伸長區(qū)的變化進而造成節(jié)間長度差異，過表達通過增加細胞大小來刺激植物生長，而敲除該基因則減緩植物生長[52]。此外，至少6個EXPANSIN蛋白基因在負責(zé)節(jié)間伸長的分生區(qū)和伸長區(qū)之間表達，分別是、、、、和這些擴展蛋白基因的表達都會造成水稻的節(jié)間差異[49, 53]。本研究電鏡觀察發(fā)現(xiàn)莖節(jié)細胞長度縮短，與細胞壁松弛蛋白作用機理非常相似。

（Chr.1：255293638-255295053）編碼PINOID蛋白激酶，在擬南芥中的同源基因是，編碼一種蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶，該激酶可能作為細胞生長素外排的正調(diào)節(jié)因子。生長素輸出載體PIN是一類膜蛋白，和生長素極性運輸相關(guān)，在擬南芥中，pin-formed（）和p-glycoprotein（）突變體，因為體內(nèi)生長素極性運輸受阻，表現(xiàn)為植株矮化[54-55]。水稻與擬南芥絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶PID同源，可能參與控制水稻生長素極性轉(zhuǎn)運，通過分析在地上部分生組織的分布，說明該基因可能在形態(tài)建成和器官發(fā)生的過程中起重要作用[56]，OsPID通過磷酸化OsPIN1a和OsPIN1b而調(diào)控生長素的運輸，改變生長素的極性分布，調(diào)控水稻花器官的形成和發(fā)育，OsPID與LAX1/LAX2互作，通過控制水稻的分枝和分蘗等性狀[57]。介導(dǎo)生長素從地上部向根莖結(jié)合部轉(zhuǎn)運，調(diào)控分蘗角度和株高性狀[58]。前人研究表明玉米和通過生長素極性運輸參與調(diào)控玉米PH和EH發(fā)育，株高顯著降低。Xing等[10]研究表明QTL的SNP變異使RIL88（）的節(jié)間縱向細胞數(shù)目和株高降低了20%，并且比已知的突變體表型更弱，對產(chǎn)量影響不顯著。與表型非常相似，其節(jié)間縮短，細胞長度變短，基因功能缺陷引起生長素運輸不足，影響細胞壁各組分的生物合成、物質(zhì)運輸和代謝等，突變型和野生型植株在發(fā)育早期表型無顯著差異[9, 26]。ZmPIN1a蛋白在調(diào)節(jié)生長素時空不對稱分布中起重要作用，影響植物多個器官的生長發(fā)育，在玉米中過表達可以降低節(jié)間長度、PH和EH[37]。綜上，PINOID蛋白激酶功能保守，通過調(diào)控生長素運輸控制植株形態(tài)建成和花的發(fā)育，可能調(diào)控玉米PH和EH發(fā)育[59]。候選基因及功能仍需進一步驗證，更深入研究包括候選基因表達模式分析、亞細胞定位、遺傳互補試驗、超表達及CRISPR/Cas 9載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化，解析候選基因的生物學(xué)功能及調(diào)控株高的遺傳機理。

4 結(jié)論

確定了2個調(diào)控玉米株高和穗位高的關(guān)鍵候選基因和，將為玉米株高性狀的遺傳改良提供重要的基礎(chǔ)材料和基因選擇位點。

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candidate gene Localization ofgene regulating plant height and ear height in maize

1Crops Research Institute, Gansu Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730070;2National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070

【Objective】Plant height is one of the important target traits in maize plant type breeding, which isclosely related not only to mechanized grain harvesting and lodging resistance, but also to maize yield. Therefore, it is of great theoretical and breeding value to isolate QTL/gene of maize plant height and analyze its function. This study aims to locate a novel maize dwarf gene, clarify its biological function, and provide important theoretical basis and gene resources for accelerating the improvement of maize plant type. 【Method】A single recessive mutant was derived in maize inbred line LY8405, from Crop Research Institute of Gansu Academy of Agricultural Sciences, by chemical mutagenic agent Ethyl Methyl Sulfonate (EMS). A maize dwarf and low ear mutant was isolated from the M2progeny, and the M3and M4progeny could stably inherit, which was named(). The F2population was constructed by hybridization with Mo17 and was identified by bulked segregate analysis-sequencing (BSA-seq) and target segment recombination exchange. Based on the Mo17 reference genome, the genes in the target region were obtained and functionally annotated to locate candidate genes.【Result】Phenotypic identification ofwas carried out, and the phenotype ofat seedling stage was not significantly different from that of the control LY8405. The plant height and ear height ofat mature stage were reduced by 87.2 cm and 55.4 cm, respectively, accounting for about 35.0% and 62.9%, difference is extremely significant. Morphological observation showed that the decrease of internode number and the shortening of internode cell length were the main reasons for the significant decrease of plant height and ear height of. The genetic analysis of the mutant gene was conducted by using the F2:3genetic populations. Themutant is inherited in a 3﹕1 (χ2=2.854) ratio and is a single recessive gene. Therefore, according to the results of BSA-seq, the candidate genewas initially located in the 15 Mb region of Bin1.09-1.10 on chromosome 1 of maize. The polymorphism molecular markers were further developed using the re-sequencing results of Mo17 and, and the target gene was accurately cloned by map-based cloning. Finally, the candidate genes were mapped to the size range of 600 kb, and there were 16 candidate genes in this range. By comparing the re-sequencing data, it was found thatgene changed into A at the 2062 position G, which resulted in amino acid changing from glycine to serine, and the transcription level expression was significantly reduced compared with LY8405.changed from T to C at the 223rd position leading to the 75th amino acid changed from serine to proline, and there was no significant difference in transcription level. Through association analysis of natural populations and the predicted genes for functional annotation, it was found thatandwere related to the growth and development of maize. 【Conclusion】The candidate genewas genetic locus significantly associated with plant height within the target region.

maize; plant height; ear height; BSA-seq; fine mapping; association analysis

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.05.002

2022-10-26；

2022-12-25

國家自然科學(xué)基金（32160490）、作物遺傳改良全國重點實驗室開放課題資助、甘肅省重大專項（21ZD11NA005，21ZD10NF003）、甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物育種專項共同資助（2022GAAS04）

周文期，E-mail：zhouwenqi850202@163.com。通信作者周玉乾，E-mail：yuqianzhou2008@163.com。通信作者邱法展，E-mail：qiufazhan @mail.hzau.edu.cn

（責(zé)任編輯 李莉）