王脈，董清峰，高珅奧，劉德政，盧山，喬朋放，陳亮，胡銀崗,2

小麥苗期根系性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析與優(yōu)異位點(diǎn)挖掘

王脈1，董清峰1，高珅奧1，劉德政1，盧山1，喬朋放1，陳亮1，胡銀崗1,2

1西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100；2中國旱區(qū)節(jié)水農(nóng)業(yè)研究院，陜西楊凌 712100

【目的】植物根系對水分及營養(yǎng)的獲取、作物的生長發(fā)育和產(chǎn)量的形成至關(guān)重要。挖掘小麥苗期根系性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)，預(yù)測相關(guān)候選基因，為解析小麥根系建成遺傳機(jī)制及選育具有優(yōu)良根系構(gòu)型的小麥品種奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā恳?89份小麥品種組成的自然群體為供試材料，調(diào)查2種培養(yǎng)條件（霍格蘭營養(yǎng)液和去離子水）下培育21 d的苗期根系總長度（TRL）、根系總表面積（TRA）、根系總體積（TRV）、根系平均直徑（ARD）及根系干重（RDW）等5個(gè)根系性狀，試驗(yàn)進(jìn)行2次重復(fù)，同時(shí)結(jié)合小麥660K SNP芯片的分型結(jié)果進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS）。此外，通過序列比對、結(jié)構(gòu)域分析和注釋信息預(yù)測候選基因，并采用競爭性等位基因（kompetitive allele specific PCR，KASP）技術(shù)開發(fā)根系性狀的分子標(biāo)記?！窘Y(jié)果】霍格蘭營養(yǎng)液培養(yǎng)條件下的根系性狀變異范圍較大，根系整體粗短；而去離子水條件下的根系細(xì)長、側(cè)根較多。選用貝葉斯信息與連鎖不平衡迭代嵌套式模型（BLINK）、壓縮式混合線性模型（CMLM）、固定隨機(jī)循環(huán)概率模型（FarmCPU）以及混合線性模型（MLM）4個(gè)模型，結(jié)合2種培養(yǎng)條件下的根系性狀進(jìn)行全基因關(guān)聯(lián)分析，共檢測到95個(gè)與小麥苗期根系性狀顯著關(guān)聯(lián)的QTL位點(diǎn)（＜10-3），其中，有18個(gè)QTL在2個(gè)條件下同時(shí)被檢測到，分布在7A、1B、2B、3B、7B、1D、2D及3D染色體，可解釋8.68%—14.07%的表型變異。篩選獲得的顯著性位點(diǎn)中，有4個(gè)與前人的研究相近或一致，其余為新發(fā)現(xiàn)QTL位點(diǎn)。對共定位的SNP進(jìn)行單倍型分析，有10個(gè)SNP能夠?qū)⒐┰嚥牧戏譃?種單倍型，且單倍型間的根系性狀具有顯著差異，同時(shí)，基于這些SNP開發(fā)KASP標(biāo)記，篩選到與根系總體積及根系干重相關(guān)的2個(gè)KASP標(biāo)記（和）。進(jìn)一步挖掘共定位SNP位點(diǎn)上下游區(qū)間內(nèi)的基因，篩選到12個(gè)可能與根系發(fā)育相關(guān)的候選基因，其中，編碼?；d體蛋白合成酶，參與根系脂肪酸的合成；編碼突觸融合蛋白，對植物重力向性具有重要作用；編碼醛脫氫酶，參與脫落酸的合成，從而調(diào)控作物根系發(fā)育?！窘Y(jié)論】小麥根系性狀在不同基因型間差異顯著，在2個(gè)條件下同時(shí)檢測到18個(gè)顯著QTL位點(diǎn)，開發(fā)了2個(gè)根系分子標(biāo)記（和），并篩選出12個(gè)與根系性狀相關(guān)的候選基因。

小麥；根系性狀；全基因組關(guān)聯(lián)分析；共定位SNP位點(diǎn)；KASP標(biāo)記；候選基因

0 引言

【研究意義】小麥（L.）是世界三大主糧作物之一，全球小麥種植面積2.17億hm2，年產(chǎn)量約7.65億t[1]，為人類提供近20%的熱量。近年來，隨著全球人口的急劇增長，人類對小麥的需求也隨之增加。據(jù)聯(lián)合國農(nóng)業(yè)組織預(yù)測：到2050年，每年至少需要生產(chǎn)8.4億t小麥[2]。因此，提高小麥單產(chǎn)對保障全球糧食生產(chǎn)具有重要作用。根系作為植物三大器官之一，是植物吸收礦物質(zhì)養(yǎng)分及水分的第一部位，對植物生長起著固定和支撐作用[3]。根系建成（root system architecture，RSA）包括根系長度、根系表面積、根系體積、根系直徑、根尖數(shù)以及根系傾角等根系性狀[4]，根系構(gòu)型的好壞是決定作物生長發(fā)育和提高小麥產(chǎn)量及抗逆性的必要因素。解析作物根系相關(guān)性狀的遺傳機(jī)制，優(yōu)化作物根系構(gòu)型對小麥育種具有重要意義[4-6]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來，國內(nèi)外研究人員在根系研究方面做了大量工作，并已取得階段性成果。研究表明[7]，優(yōu)良的根系構(gòu)型可響應(yīng)各種生物與非生物脅迫，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響地上部的生長，與千粒重、粒長、粒寬等產(chǎn)量性狀顯著正相關(guān)。Xie等[8]研究發(fā)現(xiàn)根長較短的小麥品種穗數(shù)、穗粒數(shù)和植株生物量均較低，而根長較長的品系生物量和籽粒產(chǎn)量較高。Man等[9]研究指出小麥根系干重與籽粒產(chǎn)量和水分利用效率呈正相關(guān)關(guān)系。此外，隨著基因組學(xué)和分子生物學(xué)研究的不斷深入，分子育種的優(yōu)勢逐漸凸顯。目前，利用小麥不同遺傳群體已經(jīng)定位到了許多與根系性狀相關(guān)的位點(diǎn)。如，Ma等[10]利用388份小麥品種在室內(nèi)和室外盆栽2種環(huán)境下對根系性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS），在2A、2B、3A、3B、3D、4A、5B、5D、6B染色體共檢測到36個(gè)和根系建成顯著關(guān)聯(lián)的QTL位點(diǎn)；陳貴菊等[11]對160份來自于河南和山東等地小麥品種的總根長、總根表面積、總根體積、平均根直徑和根尖數(shù)進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，檢測到23個(gè)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，可解釋7.2%—12.8%的表型變異；Huang等[12]通過對周8425B×中國春構(gòu)建的重組自交系群體進(jìn)行根毛長度的QTL分析，檢測到4個(gè)主效QTL位點(diǎn)（LOD＞2.5），解釋3.32%—6.52%的表型方差。Khodaee等[13]將170份春小麥材料種植于土壤的PVC管里，對水分脅迫和正常供水條件下的根系長度及根系體積等性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，鑒定出186個(gè)顯著性SNP位點(diǎn)，其中一些SNP證實(shí)了先前報(bào)道的根長位點(diǎn)。同時(shí)，由于SNP在基因組分布廣泛且穩(wěn)定性高，基于SNP檢測的競爭性等位基因（kompetitive allele specific PCR，KASP）技術(shù)已普遍用于小麥抗病性和抗非生物脅迫相關(guān)基因的檢測和輔助選擇[14-16]。Qureshi等[17]借助20對KASP標(biāo)記證實(shí)了小麥抗條銹病和為同一個(gè)基因。Fang等[18]開發(fā)了2對小麥抗葉銹基因的KASP標(biāo)記：和，以加速小麥育種中對的輔助選擇。Rehman等[19]開發(fā)了16個(gè)與小麥抗旱相關(guān)基因座等位基因的KASP標(biāo)記，分析了47份小麥材料的等位變異與籽粒產(chǎn)量的相關(guān)性。王志偉等[20]利用3對抗旱及抗穗發(fā)芽基因的KASP標(biāo)記，對云南育成的小麥品種（系）進(jìn)行基因型檢測，表明其能夠有效區(qū)分抗穗發(fā)芽和易穗發(fā)芽的品種及抗旱和非抗旱品種。【本研究切入點(diǎn)】鑒于小麥根系的難獲取性及數(shù)量性狀遺傳調(diào)控的復(fù)雜性，目前得到的小麥根系構(gòu)型相關(guān)位點(diǎn)的數(shù)量并不多，因此，亟需擴(kuò)大基因組篩選的廣度和深度，增加分子標(biāo)記的數(shù)目及種類，挖掘更多主效QTL，從而對調(diào)控根系發(fā)育的基因進(jìn)行精細(xì)定位?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以189份小麥品種（系）組成的自然群體為材料，在霍格蘭營養(yǎng)液和去離子水2種培養(yǎng)條件下，測定苗期根系的總根長、根系總表面積、根系總體積、根系平均直徑及根系干重（與根系構(gòu)型相關(guān)的性狀）；進(jìn)一步結(jié)合高通量660K SNP芯片的基因型分析結(jié)果，對根系性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，以期發(fā)掘調(diào)控小麥根系性狀的QTL位點(diǎn)，開發(fā)根系分子標(biāo)記，并預(yù)測與根系構(gòu)型相關(guān)的候選基因，為小麥根系改良及抗逆育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以實(shí)驗(yàn)室通過多年試驗(yàn)，并結(jié)合35K芯片進(jìn)行基因型分析的565份小麥種質(zhì)中篩選出189份小麥品種（系）組成的自然群體為材料，這些品種遺傳多樣性豐富，來源廣泛，主要來自河南（73份）、陜西（51份）、山東（21份）、甘肅（16份），以及河北、江蘇、寧夏、山西、北京、安徽等地，還包括部分從澳大利亞、美國及墨西哥引進(jìn)的種質(zhì)（電子附表1）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

供試材料于2021年7—8月及2022年1—2月在西北農(nóng)林科技大學(xué)旱區(qū)逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室光照培養(yǎng)間進(jìn)行水培試驗(yàn)，分別采用霍格蘭營養(yǎng)液（hogland，HL）和去離子水（pure water，PW）進(jìn)行培養(yǎng)，試驗(yàn)均重復(fù)2次。選用大小均勻一致的小麥種子，采用75%的酒精消毒1 min，用蒸餾水沖洗，擺放在培養(yǎng)皿中進(jìn)行發(fā)芽。幼苗長至1葉1心期時(shí)（約7 d），每個(gè)品種選擇長勢一致的4株幼苗，移栽并定植于泡沫板上，每孔種植1粒，放置于根箱中（50 cm×40 cm×30 cm），20℃恒溫培養(yǎng)，光照16 h/黑暗8 h，濕度為70%。每天通過氧氣泵間斷通氣10 h，培養(yǎng)21 d。期間每隔3 d更換1次營養(yǎng)液和去離子水，營養(yǎng)液用稀NaOH和0.1 mmol·L-1HCl調(diào)節(jié)pH至6.5。

1.3 測定指標(biāo)及測定方法

植株水培21 d后，使用EPSON Perfection V700 Photo掃描儀掃描根系存成圖片，然后通過萬深LA-S根系分析儀系統(tǒng)（www.wseen.com）處理并分析掃描的圖片，得到根系總長度（total root length，TRL，cm）、根系總表面積（total root area，TRA，cm2）、根系總體積（total root volume，TRV，cm3）、根系平均直徑（average root diameter，ARD，mm）等參數(shù)。掃描后的根系105℃殺青30 min后，80℃烘干至恒重，用萬分之一天平測定根系干重（root drought weight，RDW，g）。

1.4 表型數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2019和IBM SPSS Statistics 25（https://www.ibm.com/cn-zh/spss）對根系總長度、根系總表面積、根系總體積、根系平均直徑及根系干重等5個(gè)性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分別計(jì)算2個(gè)培養(yǎng)條件下各根系性狀的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)以及廣義遺傳力。運(yùn)用R語言繪制各根系性狀的頻率分布圖，利用Origin 2021（https://www.originlab.com/origin）軟件對各根系性狀進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.5 群體結(jié)構(gòu)與連鎖不平衡分析

采用改良的CTAB法提取小麥幼嫩葉片的總基因組DNA，質(zhì)檢合格后，由北京博奧生物技術(shù)有限公司利用小麥660K SNP芯片對189個(gè)小麥品種進(jìn)行基因分型，并采用TASSEL 5.0軟件[21]對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制和過濾，剔除缺失率和雜合度＞20%，次等位基因頻率＜5%[22]的SNP位點(diǎn)?；谶^濾后的高質(zhì)量SNP標(biāo)記，采用Power Marker V3.25軟件[23]分析供試材料的遺傳多樣性和多態(tài)信息含量（polymorphic information content，），=1-Σ(P)2（P表示位點(diǎn)的第個(gè)等位變異出現(xiàn)的頻率）。進(jìn)一步使用Admixture軟件[24]進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析：令K=2—15，對交叉驗(yàn)證錯(cuò)誤率CV值（cross-validation error）進(jìn)行5次訓(xùn)練，最終將5個(gè)模型的預(yù)測值做平均，CVmin對應(yīng)的K值即為最佳亞群數(shù)目。采用Origin 2021對189份小麥材料進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA），并繪制亞群的3D圖。以位點(diǎn)間的相關(guān)系數(shù)平方（2）為參數(shù)衡量多態(tài)性位點(diǎn)兩兩之間的連鎖不平衡度（linkage disequilibrium，LD），使用PopLDdecay軟件[25]進(jìn)行ABD基因組的連鎖不平衡分析，2的參數(shù)設(shè)置為：-MaxDist30000[25-26]。將30 000 kb LD區(qū)間劃分為10 kb的區(qū)間，以第95百分位的2值作為閾值估測LD衰減距離。

1.6 全基因組關(guān)聯(lián)分析與候選基因挖掘

通過對小麥660K SNP芯片的基因分型結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控和過濾，最終獲得296 111個(gè)高質(zhì)量SNP標(biāo)記，用于后續(xù)的全基因組關(guān)聯(lián)分析。通過基于R語言的Gapit包（http;//www.zzlab.net/GAPIT），選用BLINK（bayesian-information and linkage-disequilibrium iteratively nested keyway）、CMLM（compressed mixed linear model）、FarmCPU（fixed and random model circulating probability unification）和MLM（mixed linear model）4個(gè)模型進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，以=1.0×10-3為閾值，判定與目標(biāo)性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)。基于共定位的SNP位點(diǎn)，將供試品種分為2種單倍型，采用SPSS的ANOVA檢測比較2種單倍型間目標(biāo)根系性狀的差異顯著性。運(yùn)用Origin 2021繪制單倍型分析的箱線圖。采用R包的CMPlot繪制QQ圖和曼哈頓圖，并在共定位SNP位點(diǎn)LD衰減范圍內(nèi)挖掘小麥根系性狀的候選基因。在NCBI數(shù)據(jù)庫（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov）、InterPro（https://www.ebi.ac.uk/interpro）、WheatOmics（http://wheatomics.sdau.edu.cn）和Ensembl plants（http://plants.ensembl.org/index.html）等網(wǎng)站進(jìn)行候選基因的序列比對、保守結(jié)構(gòu)域分析和功能注釋。利用expVIP（http://www.wheat-expression.com）獲取小麥候選基因在不同組織的表達(dá)量，并運(yùn)用TBtools軟件[27]繪制基因表達(dá)量熱圖。

1.7 顯著性SNP分子標(biāo)記開發(fā)及檢測

根據(jù)660K SNP芯片的遺傳圖譜信息，基于與根系性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)開發(fā)KASP標(biāo)記?；谠诰€網(wǎng)站Poly Marker（http://www.polymarker.info）設(shè)計(jì)KASP引物（表1），在2條正向引物序列的5′端分別加上FAM和HEX熒光接頭序列，其中，F(xiàn)AM接頭序列為：5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′，HEX（VIC）為：5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGAT T-3′。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

利用根系性狀極端的小麥材料進(jìn)行引物的初步篩選，篩選出具有多態(tài)性且分群明顯的KASP標(biāo)記（和X），進(jìn)一步在189份小麥品種組成的自然群體中進(jìn)行基因型分析。KASP分型系統(tǒng)操作參考北京嘉程生物科技有限公司的AQP基因分型說明：384孔板反應(yīng)體系包含Higeno 2×Probe Mix B 2.5 μL、引物Mix 0.07 μL（2條正向引物12 mmol·L-1，反向引物30 mmol·L-1）、DNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)至5 μL。PCR反應(yīng)采用touchdown程序：95℃ 10 min；95℃ 20 s，61—55℃ 40 s，10個(gè)循環(huán)（每個(gè)循環(huán)降0.6℃）；95℃20 s，55℃ 40 s，32個(gè)循環(huán)，共計(jì)42個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后讀取熒光數(shù)據(jù)，通過Klustercaller SNP分型軟件檢測分型結(jié)果。

表1 多態(tài)性KASP標(biāo)記的引物序列

F-P：連接FAM熒光序列的正向引物；V-P：連接HEX（VIC）熒光序列的正向引物；R-P：反向引物

F-P: Forward primer with FAM fluorescence sequence; V-P: Forward primer with HEX(VIC) fluorescence sequence; R-P: Reverse primer

2 結(jié)果

2.1 不同環(huán)境下小麥苗期根系性狀的表型分析

通過對霍格蘭營養(yǎng)液（HL）和去離子水（PW）2個(gè)培養(yǎng)條件下供試品種的根系總長度、根系總表面積、根系總體積、根系平均直徑以及根系干重等性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（電子附表2），發(fā)現(xiàn)2個(gè)培養(yǎng)條件下各根系性狀的頻率呈正態(tài)分布（圖1），表明各根系性狀是數(shù)量性狀，受多基因控制，其表型數(shù)據(jù)可用于后續(xù)的全基因組關(guān)聯(lián)分析。2種培養(yǎng)條件下的各根系性狀均表現(xiàn)出廣泛變異，變異范圍為15.43%—66.38%（表2），其中，在HL培養(yǎng)下的各根系性狀變異幅度較大，PW培養(yǎng)下的變幅相對較小。2個(gè)培養(yǎng)條件下的根系性狀差異明顯，HL培養(yǎng)下的根系總長度、根系總表面積及根系干重均顯著低于PW，而根系平均直徑及根系總體積高于PW。方差分析表明，各根系性狀在小麥品種間、培養(yǎng)條件間以及品種與培養(yǎng)條件互作下均呈極顯著差異。各根系性狀的廣義遺傳力為60.41%— 65.30%，其中，根系干重的廣義遺傳力最大（表3），表明根系性狀的遺傳穩(wěn)定性較強(qiáng)。

表2 不同處理下小麥種質(zhì)各根系性狀的描述統(tǒng)計(jì)分析

HL：霍格蘭營養(yǎng)液；PW：去離子水；TRL：根系總長度；TRA：根系總表面積；TRV：根系總體積；ARD：根系平均直徑；RDW：根系干重。下同

HL: hogland; PW: pure water; TRL: total root length; TRA: total root area; TRV: total root volume; ARD: average root diameter; RDW: root dry weight. The same as below

表3 小麥種質(zhì)各根系性狀的方差分析及廣義遺傳力

***表示在＜0.001水平差異顯著 *** represents significance of difference at＜0.001

A—E：霍格蘭營養(yǎng)液培養(yǎng)；F—J：去離子水培養(yǎng) A-E: Hogland culture; F-J: Pure water culture

相關(guān)分析表明（圖2），在HL和PW 2種培養(yǎng)條件下的根系總長度、根系總表面積、根系總體積和根系干重等根系性狀之間呈極顯著正相關(guān)。HL條件下的根系總體積、根系總長度和根系總表面積的相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.92和0.81，而根系總長度和根系平均直徑呈負(fù)相關(guān)；PW條件下的根系總長度、根系總體積與根系總表面積的相關(guān)系數(shù)為0.96和0.90，而根系總長度與根系平均直徑呈極顯著負(fù)相關(guān)，根系干重及根系平均直徑呈顯著負(fù)相關(guān)?？傊?種培養(yǎng)條件下的各根系性狀間的相關(guān)性基本一致。

A：霍格蘭營養(yǎng)液培養(yǎng)；B：去離子水培養(yǎng)。*、**和***分別表示在P＜0.05、P＜0.01以及P＜0.001水平差異顯著。下同

2.2 SNP分布及多態(tài)性分析

利用CMplot對660K SNP標(biāo)記在染色體的位置進(jìn)行繪制，發(fā)現(xiàn)SNP標(biāo)記基本覆蓋所有染色體區(qū)段，然而這些標(biāo)記在各染色體的分布并不均勻，總體表現(xiàn)出“兩邊多中間少”的趨勢（圖3）。通過對獲得的SNP數(shù)據(jù)進(jìn)行高質(zhì)量質(zhì)控，最終篩選出296 111個(gè)具有遺傳多樣性的SNP標(biāo)記，其在A、B、D基因組的數(shù)目分別為115 694、140 634和39 783個(gè)，分別占總基因組的39.1%、47.5%和13.4%（表4）；其中，3B染色體的SNP最多（36 612個(gè)），而4D染色體的SNP最少（2 408個(gè)）。A、B基因組的遺傳多樣性分別為0.3575和0.3660，均大于D基因組。全基因組的多態(tài)信息量均值為0.2858，各亞基因組的多態(tài)信息量表現(xiàn)為B基因組（0.2926）＞A基因組（0.2860）＞D基因組（0.2789），說明B基因組的等位基因頻率更平等。

2.3 群體結(jié)構(gòu)與連鎖不平衡分析

基于Admixture軟件對群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析的結(jié)果表明，K=8時(shí)，CV error達(dá)到最小值，因此，可將189份小麥材料分為8個(gè)類群，將K=8生成的Q矩陣作為協(xié)變量用于后續(xù)的全基因組關(guān)聯(lián)分析（圖4-A和圖4-B）。進(jìn)一步對189份小麥材料進(jìn)行主成分分析，其中，前3個(gè)主成分分別可解釋表型變異的17.79%、16.09%以及14.87%（圖4-C）。該189份小麥品種（系）大多來自中國西北、華中及華東地區(qū)，其中，亞群Ⅰ有25個(gè)（13%）品種，主要包含陜西和甘肅品種；亞群Ⅱ和亞群Ⅲ分別有25個(gè)（13%）和10個(gè)（5%）品種，均主要來自河南；亞群Ⅳ有34個(gè)（18%）品種，主要包含陜西品種及少量河南品種；亞群Ⅴ有37個(gè)（20%）品種，主要為山東和河南品種，還有少量江蘇及河北品種；亞群Ⅵ有11個(gè)（6%）品種，均來自河南；亞群Ⅶ有37個(gè)（20%）品種，主要來自陜西，還有一些品種來自甘肅、河北及河南；亞群Ⅷ有10個(gè)（5%）品種，主要來自河南（電子附表1和電子附圖1）。通過PopLDdecay對小麥A、B和D亞基因組及全基因組的SNP位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析表明，隨著物理距離的增加，LD明顯衰減，但整個(gè)基因組和A、B、D亞基因組的衰減存在一定差異（圖4-D）。2衰減到0.3時(shí)，整個(gè)基因組的LD平均衰減距離約為1.5 Mb，而A和B基因組的LD平均衰減距離約為1和3 Mb，D基因組的衰減距離約為0.7 Mb，與小麥進(jìn)化史上D基因組的快速衰減是一致的[28]。

圖3 SNP標(biāo)記在小麥各染色體的分布

A：亞群的CV error值；B：群體結(jié)構(gòu)示意圖；C：189份小麥品種（系）的主成分分析；D：各亞基因組的連鎖不平衡衰減距離

表4 小麥各染色體SNP標(biāo)記的數(shù)目及多態(tài)性

2.4 小麥苗期根系性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析

利用BLINK、CMLM、FarmCPU以及MLM模型分別對189份小麥群體的根系總長度、根系總表面積、根系總體積、根系平均直徑以及根系干重5個(gè)根系性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，在4個(gè)模型共有且閾值＜10-3的條件下，共檢測到2個(gè)培養(yǎng)條件與根系性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)95個(gè)（圖5和電子附表3）。

為了確保關(guān)聯(lián)的可靠性，篩選2個(gè)培養(yǎng)條件下同時(shí)檢測到的18個(gè)與小麥根系性狀顯著關(guān)聯(lián)且穩(wěn)定遺傳的SNP位點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)分析（表5），其中，與根系總長度關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)5個(gè)，與根系干重關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)6個(gè)，與根系總表面積關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)4個(gè)，與根系總體積關(guān)聯(lián)的7個(gè)，分布在7A、1B、2B、3B、7B、1D、2D和3D染色體，解釋了表型變異的8.68%—14.07%，而未檢測到在2個(gè)培養(yǎng)條件下均與根系直徑關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)。此外，有些顯著性SNP位點(diǎn)同時(shí)關(guān)聯(lián)到多個(gè)根系性狀，如AX-108888527同時(shí)關(guān)聯(lián)到根系總長度及根系總表面積，AX-109029863同時(shí)關(guān)聯(lián)到根系總長度及根系干重，AX-108792070和AX-110097055關(guān)聯(lián)到根系總表面積及總體積。

A—E：霍格蘭營養(yǎng)液培養(yǎng)；F—J：去離子水培養(yǎng)；曼哈頓圖：從里環(huán)到外環(huán)分別為各根系性狀的BLINK、CMLM、FarmCPU以及MLM模型

A-E: Hogland culture; F-J: Pure water culture; Manhattan plots: The BLINK, CMLM, FarmCPU and MLM models of root traits from the inner to outer were respectively showed

圖5 不同培養(yǎng)條件下各根系性狀的環(huán)形曼哈頓圖及QQ圖

Fig.5 Circular Manhattan plots and QQ plots of root traits in different culture conditions

2.5 小麥苗期根系性狀關(guān)聯(lián)位點(diǎn)的單倍型分析

對2個(gè)環(huán)境中同時(shí)檢測到的顯著性SNP位點(diǎn)進(jìn)行單倍型分析，其中，5個(gè)SNP位點(diǎn)（AX-108924279、AX-110371944、AX-110455550、AX-110567747和AX-109933707）共定位于2B染色體57.144—57.960 Mb的連鎖群，與根系干重顯著相關(guān)（圖6-A），其分別處于的外顯子和內(nèi)含子、的下游以及的內(nèi)含子區(qū)域。利用其將189份小麥品種分為2個(gè)單倍型（Hap1和Hap2；圖6-B），其中Hap1出現(xiàn)的頻率為56.8%，Hap2的頻率為43.2%。在HL和PW培養(yǎng)條件下，2個(gè)單倍型之間的根系干重存在顯著和極顯著差異（圖6-C），Hap2顯著提高了小麥苗期的根系干重，是優(yōu)異單倍型。

此外，除連鎖群內(nèi)的SNP外，進(jìn)一步對7個(gè)單個(gè)SNP將供試品種分為2種單倍型進(jìn)行分析（圖7）。其中，2D染色體的AX-108888527位于下游397 bp，與根系總長度及根系總表面積顯著關(guān)聯(lián)。在HL培養(yǎng)條件下，2種單倍型的根系總長度及根系總表面積均存在極顯著差異；PW培養(yǎng)條件下，2種單倍型的根系總長度存在顯著差異，而根系總表面積間差異不顯著（圖7-A—B）。1B染色體的AX-109555941位于的3端非翻譯區(qū)，與根系總長度顯著關(guān)聯(lián)，2種單倍型間的根系總長度在HL和PW培養(yǎng)條件下存在極顯著和顯著差異（圖7-C）。1B染色體的AX-110491393位于上游616 bp，與根系總體積顯著關(guān)聯(lián)，在HL和PW培養(yǎng)條件下，Hap2的根系總體積極顯著和顯著高于Hap1（圖7-D）。1D染色體的AX-94823257位于的外顯子區(qū)域，與根系總體積顯著關(guān)聯(lián)，在HL和PW培養(yǎng)條件下，Hap2的根系總體積分別極顯著和顯著高于Hap1的根系總體積（圖7-E）。2B染色體的AX-111514405位于和之間，與根系總長度顯著關(guān)聯(lián)，2種培養(yǎng)條件下Hap1的根系總長度均顯著高于Hap2（圖7-F）。2B染色體的AX-108889829及7B染色體的AX-110122975分別與根系總長度和根系總體積顯著關(guān)聯(lián)。在PW培養(yǎng)條件下，2種單倍型間的根系總長度和根系總體積差異極顯著，而在HL培養(yǎng)條件下差異不顯著（圖7-G—H）。

表5 2種培養(yǎng)條件下同時(shí)檢測到的顯著性SNP位點(diǎn)

2.6 候選基因預(yù)測及表達(dá)量分析

依據(jù)LD衰減距離，通過中國春基因組數(shù)據(jù)庫，對上述18個(gè)顯著SNP連鎖區(qū)間內(nèi)的序列進(jìn)行檢索和比對，共篩選出12個(gè)主效候選基因，利用Ensemble Plants及WheatOmics等網(wǎng)站對候選基因進(jìn)行功能注釋，發(fā)現(xiàn)其主要編碼MLO蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、解毒蛋白、?；d體蛋白合成酶和醛脫氫酶等（表6）。

基于expVIP網(wǎng)站獲取這12個(gè)候選基因在不同組織中的表達(dá)信息，這些候選基因均在根系中高表達(dá)，根據(jù)表達(dá)模式可將其分為4類（圖8）。第1類包含3個(gè)基因（、和），在根系中表達(dá)量最高，在莖葉、穗部和籽粒當(dāng)中表達(dá)量均較少；第2類包含4個(gè)基因（、、和），在各組織中的表達(dá)量為根系＞穗部＞莖葉＞籽粒；第3類包含2個(gè)基因，和，在根系和籽粒中表達(dá)量較高，莖葉和穗部較少；第4類包含3個(gè)基因（、和），在根系當(dāng)中表達(dá)量最高，穗部和籽粒次之，莖葉中幾乎不表達(dá)。

A：2B染色體57.144—57.960 Mb連鎖熱圖；B：不同等位基因的2種單倍型；C：不同單倍型的表型效應(yīng)

表6 根系相關(guān)性狀候選基因及其功能注釋

圖7 小麥苗期根系性狀顯著性SNP位點(diǎn)的單倍型分析

紅色代表該基因在某組織中表達(dá)量高；粉色或白色則代表在某組織表達(dá)量低

2.7 KASP標(biāo)記開發(fā)及小麥自然群體的檢測

為了對小麥根系進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇，依據(jù)2個(gè)培養(yǎng)條件下共定位到的顯著性SNP設(shè)計(jì)KASP引物，在根系極端材料中進(jìn)行初步篩選，最終依據(jù)AX-110497143和AX-109933707開發(fā)了2個(gè)KASP標(biāo)記（和），對189份小麥品種組成的自然群體進(jìn)行檢測，2個(gè)標(biāo)記能夠?qū)ζ渲?71份小麥品種進(jìn)行明顯分型，而剩余18份材料分型不明顯（圖9）。標(biāo)記鑒定出基因型為CC的小麥品種165份，基因型為TT的6份，兩者間的根系總體積差異極顯著（=2×10-6）；標(biāo)記鑒定出CC基因型的94份，TT基因型的77份，兩者間的根系干重差異顯著（=0.001，表7）。

3 討論

3.1 不同培養(yǎng)條件下小麥苗期根系性狀的表型差異

苗期是小麥形態(tài)器官建成的關(guān)鍵階段[29]，苗期的生長發(fā)育直接關(guān)系到后期生長的好壞。而根系作為植物三大器官之一，是植物吸收礦物質(zhì)養(yǎng)分、水分傳導(dǎo)的第一部位，是植物生長發(fā)育的源泉，對植物生長起著固定和支持作用。有研究表明[30]小麥成穗數(shù)與小麥根系發(fā)達(dá)程度，特別是和種子根數(shù)和根系表面積及體積呈明顯的正相關(guān)，從而促進(jìn)小麥產(chǎn)量的提高。在本研究中，2種培養(yǎng)條件下的根系構(gòu)型具有明顯差異：HL培養(yǎng)條件下的根系整體較粗且短；PW培養(yǎng)條件下的主根細(xì)而長，側(cè)根也較多。相關(guān)性分析表明，各根系性狀間具有顯著的相關(guān)性，說明根系總長度、根系總表面積和總體積等根系性狀間可能存在協(xié)同互作，有效地提高水分吸收效率[31]。此外，根系長度和根系直徑負(fù)相關(guān)，這可能是造成PW培養(yǎng)條件下根系較長但直徑較小的原因。由此推測在PW培養(yǎng)條件下，植株胚乳中的養(yǎng)分足以供給苗期小麥的生長發(fā)育，過多的營養(yǎng)可能會抑制幼苗根系的生長。營養(yǎng)元素對小麥植株的生長不可或缺，但施用過多非但無益，反而造成更嚴(yán)重的后果。有研究表明[32]，氮素過剩會導(dǎo)致植株生育延遲，易感病蟲害；鎂元素過剩會阻礙植株生長等。因此，在短期的苗期水培試驗(yàn)中可直接采用去離子水培養(yǎng)，可能取得更佳的效果。

3.2 小麥苗期根系性狀顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)分析

本研究對5個(gè)小麥苗期的根系性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，2個(gè)培養(yǎng)條件下共檢測到95個(gè)顯著性關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，2個(gè)條件下均檢測到的有18個(gè)。其中，4個(gè)SNP位點(diǎn)與前人通過不同小麥群體進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析定位的位點(diǎn)相近或一致。如本研究檢測到的4A和5B染色體上與根系干重顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記AX-109480568和AX-111009146和王博華等[33]利用國內(nèi)外300份小麥群體定位的根系干重顯著關(guān)聯(lián)標(biāo)記及分別相距6.5和6.0 Mb；1D染色體與根系總長度顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記AX-111062954和Xu等[34]利用中國黃淮麥區(qū)196份小麥材料在2個(gè)環(huán)境下共定位的根系總長度關(guān)聯(lián)標(biāo)記相距0.1 Mb；3B染色體與根系總面積顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記AX-109948487和Liu等[35]利用黃淮麥區(qū)165份小麥群體定位的根系總表面積相關(guān)標(biāo)記相同。其余顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)為新發(fā)現(xiàn)的，進(jìn)一步對其進(jìn)行深入分析可能對解析根系建成遺傳機(jī)制具有重要意義。

表7 XNR7143和XNR3707在小麥自然群體中的表型驗(yàn)證

**表示在＜0.01水平差異顯著 ** represent significance of difference at＜0.01

紅色代表標(biāo)記的堿基紅色代表標(biāo)記的堿基為TT的純合個(gè)體；藍(lán)色代表標(biāo)記的堿基為CC的純合個(gè)體；黑色代表無DNA對照；粉色是無法分型的個(gè)體

3.3 小麥根系候選基因功能預(yù)測

本研究通過小麥根系性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記序列對小麥中國春基因組序列進(jìn)行比對分析，依據(jù)基因功能注釋發(fā)現(xiàn)了12個(gè)可能調(diào)控小麥根系發(fā)育的候選基因。其中位于7A染色體的（）編碼3-氧?；??；d體蛋白合成酶，研究表明該酶參與植物脂肪酸從頭合成的縮合反應(yīng)，在脂肪酸合成過程中扮演重要角色[36]。水稻同源基因過表達(dá)，其主根長和側(cè)根明顯縮短，根部伸長區(qū)和成熟區(qū)的細(xì)胞長度變短，根中棕櫚酸和亞麻酸含量明顯增加[37]，推測可能是通過參與根系脂肪酸的合成影響小麥根系發(fā)育。位于1B染色體的（）編碼突觸融合蛋白，具有SNARE結(jié)構(gòu)域，該蛋白除參與膜泡運(yùn)輸外，還與植物抗病性及植物的向重力性有關(guān)[38]，推測可能通過參與根冠造粉體的形成，從而保證根系的向地生長。位于2B染色體的（）和（）編碼MLO蛋白，研究表明，植物MLO蛋白除與白粉病菌互作外，還受到干旱脅迫和脫落酸誘導(dǎo)，擬南芥突變會導(dǎo)致其不正常的根部形態(tài)，發(fā)生嚴(yán)重的卷曲[39]。位于2B染色體的（）編碼WUSCHEL蛋白，WUSCHEL相關(guān)同源盒是植物特異轉(zhuǎn)錄因子家族，具有調(diào)節(jié)植物干細(xì)胞分裂分化動態(tài)平衡和植物器官發(fā)育等重要功能[40]。其水稻同源基因是不定根生長發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，過量表達(dá)使不定根提早產(chǎn)生，數(shù)目增加；此外該基因的表達(dá)還受外源生長素和細(xì)胞分裂素的誘導(dǎo)[41]。位于2B染色體的（）編碼三磷酸腺苷雙磷酸酶，該酶調(diào)節(jié)胞內(nèi)外ATP穩(wěn)態(tài)，在植物的各種應(yīng)激適應(yīng)及脅迫中發(fā)揮重要作用[42]。其水稻同源基因的一個(gè)單堿基替換導(dǎo)致異常的cDNA剪接，從而影響水稻根毛細(xì)胞的膨大，對水稻根毛伸長及植株生長發(fā)育十分重要[43]。位于7B染色體的TraesCS7B02G417900（）編碼醛脫氫酶，而植物醛脫氫酶是植物激素脫落酸生物合成的最后一步，因此可能通過合成ABA進(jìn)而調(diào)控主根、側(cè)根及根毛的生長發(fā)育[44]。位于3D染色體的（）編碼分子伴侶dnaJ，參與新生肽的折疊、裝配和運(yùn)輸過程。研究表明dnaJ-like蛋白在植物形態(tài)建成及非生物脅迫方面具有重要作用[45]，推測可能通過調(diào)節(jié)根系發(fā)育來響應(yīng)干旱脅迫、參與重金屬解毒。對這些候選基因的進(jìn)一步功能解析，將有助于構(gòu)建小麥根系調(diào)控的基因網(wǎng)絡(luò)。

3.4 小麥根系分子標(biāo)記的開發(fā)與檢測

KASP技術(shù)作為一種基于熒光檢測的基因分型技術(shù)，具有高通量、低成本、準(zhǔn)確性高及減少傳統(tǒng)育種工作量等優(yōu)點(diǎn)，目前，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物、動物和人類的遺傳學(xué)研究與群體分型[46-49]。本研究通過對2種培養(yǎng)條件下共定位的顯著性SNP進(jìn)行KASP標(biāo)記開發(fā)，最終篩選出能夠明顯分型的和2個(gè)KASP標(biāo)記，其中將171份小麥群體分為根系總體積不同的2個(gè)基因型，頻率分別為96.5%和3.5%；而將供試材料分為與根系干重相關(guān)的2個(gè)基因型，頻率為55.0%和45.0%。此外，試驗(yàn)表明分型的2個(gè)亞群之間的數(shù)目具有明顯差異，CC基因型為主要亞群，這可能是由于人工選擇等因素導(dǎo)致。以上2個(gè)分子標(biāo)記可用作小麥優(yōu)異種質(zhì)資源的快速鑒定，為輔助選擇優(yōu)良根系建成的基因型提供了分子標(biāo)記。

4 結(jié)論

不同水培條件下，小麥苗期根系性狀存在不同程度的差異：霍格蘭營養(yǎng)液培養(yǎng)條件下的根系直徑較粗且根長較短；而去離子水培養(yǎng)條件下的主根細(xì)長，側(cè)根居多。通過利用660K SNP芯片對小麥苗期的5個(gè)根系性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)：4個(gè)模型同時(shí)檢測到95個(gè)顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)，其中，在2種培養(yǎng)條件下均檢測到的SNP位點(diǎn)有18個(gè)，同時(shí)基于上述共定位的多態(tài)性SNP開發(fā)了與根系總體積及根系干重相關(guān)的2個(gè)KASP標(biāo)記（和），挖掘到12個(gè)可能與根系發(fā)育相關(guān)的候選基因。

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Genome-Wide Association Studies and Mining for Favorable Loci of Root Traits at Seedling Stage in Wheat

WANG Mai1, DONG QingFeng1, GAO ShenAo1, LIU DeZheng1, LU Shan1, QIAO PengFang1, CHEN Liang1, HU YinGang1,2

1College of Agronomy, Northwest A & F University/State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas, Yangling 712100, Shaanxi;2Institute of Water-Saving Agriculture in Arid Areas of China, Yangling 712100, Shaanxi

【Objective】Plant roots are critical for water and nutrient acquisition, crop growth and development as well as yield formation. Exploring SNP loci significantly associated with root traits in wheat at seedling stage and mining candidate genes, will lay a foundation for understanding the genetic mechanism of wheat root system architecture and breeding wheat elite varieties with better root architecture.【Method】In this study, 189 diverse wheat cultivars were assembled as an association-mapping panel, five root traits including total root length (TRL), total root area (TRA), total root volume (TRV), average root diameter (ARD) and root dry weight (RDW) were investigated by growing in two culture conditions (Hoagland nutrient solution and pure water), and the experiments were repeated twice. Then, genome-wide association studies (GWAS) were performed for the five root traits with genotypic data derived from Wheat 660K SNP Array. Candidate genes were predicted by sequence alignment, domain analysis, and annotation information. Futhermore, kompetitive allele specific PCR (KASP) markers were developed for root traits. 【Result】The root traits varied greatly among the 189 cultivars, and the roots were thick and short cultured under Hoagland nutrient solution, while slender seminal roots and more lateral roots were observed under pure water. A total of 95 QTLs significantly associated with root traits cultured in two conditions (＜10-3) were identified by genome-wide association studies with four models of BLINK (bayesian-information and linkage-disequilibrium iteratively nested keyway), CMLM (compressed mixed linear model), FarmCPU (fixed and random model circulating probability unification) and MLM (mixed linear model). Among them, 18 QTLs were detected in both culture conditions and distributed on chromosomes of 7A, 1B, 2B, 3B, 7B, 1D, 2D, and 3D, which explained 8.68%-14.07% of phenotypic variation. Of those significant loci, 4 QTLs were similar or consistent with thatreported previously, and the rest were novel ones. Haplotype analysis conducted for co-localization QTLs of 10 SNPs revealed significant differences in root traits between the two haplotypes of wheat cultivars. Based on these SNPs, KASP markersandwere developed for total root volume and root dry weight, respectively. In addition, 12 candidate genes possibly regulating root development were found by mining the genes within the interval of co-localization significant SNPs. Of them,, encoding 3-oxoacyl-[acyl-carrier-protein] synthase, is involved in the synthesis of root fatty acids;,encoding syntaxin, plays an important role in plant tropism;, encoding aldehyde oxidase, contributes to the synthesis of abscisic acid and regulation of crop root development. 【Conclusion】The root traits of wheat varied significantly among the wheat genotypes. Genome-wide association studies detected 18 significant QTLs linked with root traits simultaneously in two culture conditions, two KASP markers were developed for root traits, and 12 candidate genes related to root development were screened, which might provide reference for understanding the regulation mechanism of wheat root traits and molecular marker-assisted breeding for wheat improvement.

wheat; root traits; genome-wide association study; co-localization SNPs; KASP (kompetitive allele specific PCR) markers; candidate genes

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.05.001

2022-10-06；

2022-12-13

陜西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021KWZ-23）

王脈，E-mail：599157540@qq.com。通信作者胡銀崗，E-mail：huyingang@nwafu.edu.cn

（責(zé)任編輯 李莉）