崔方超，周閃閃，王當豐，檀茜倩，李秋瑩，李婷婷，勵建榮

氨基功能化抗菌碳量子點的制備及抗菌性能研究

崔方超1，周閃閃1，王當豐1，檀茜倩1，李秋瑩1，李婷婷2，勵建榮1

（1.渤海大學 a.食品科學與工程學院 b.生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；2.大連民族大學 生命科學學院，遼寧 大連 116600）

以精胺、多巴胺為原材料合成氨基功能化抗菌碳量子點，為進一步將其應(yīng)用于食源性致病菌消除領(lǐng)域提供參考。利用精胺、多巴胺通過熱解法合成精胺碳點、多巴胺碳點和精胺/多巴胺碳點（SPM–CDs、DA–CDs、SPM/DA–CDs），通過透射掃描電鏡，X射線光電子能譜、紅外光譜、Zeta電位、紫外光譜和熒光光譜對碳點進行表征，選取食源性致病菌金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作為供試菌株，采用微量肉湯稀釋法研究碳點及前體物的抗菌性能。SPM–CDs、DA–CDs、SPM/DA–CDs的分散性好，平均粒徑分別為（4.25±0.89）、（3.90±0.67）、（4.0±0.96）nm；在365 nm紫外燈照射下3種碳點均能發(fā)出熒光，表面都帶有較高的正電荷并且含有C=C、C?O、O?H等化學鍵；抗菌實驗表明，SPM/DA–CDs對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑制效果顯著，最小抑菌質(zhì)量濃度分別為0.25 mg/mL和0.5 mg/mL，而SPM–CDs、DA–CDs和前體物對2種菌的抑制效果較差；SEM結(jié)果表明碳點能造成細菌表面凹陷、破裂，從而導致細菌死亡。本研究合成的氨基功能化抗菌碳點具有優(yōu)異的抗菌效果，有望應(yīng)用于食源性致病菌的防治領(lǐng)域，降低食品中致病菌帶來的安全隱患，保障食品安全和人類身體健康。

碳量子點；熱解法；食源性致病菌；抗菌；抗菌機制

食源性致病菌是影響食品安全的最主要原因[1]，每年全球食源性疾病導致42萬人死亡，有70%以上食源性疾病患者是由于食物或飲用水中的微生物感染所致[2]，因此，解決食源性疾病問題首先要消滅致病菌。近年來，由于抗生素的廣泛使用，使許多細菌產(chǎn)生了耐藥性，使情況變得更加惡劣，因此，急需找到一種新型抗菌藥物去維持身體健康和保證食品安全[3]。

隨著納米科技的發(fā)展，納米粒子被開發(fā)用于抗菌領(lǐng)域。金[4]、銀[5]、氧化銅[6]、二氧化鈦[7]等納米粒子具有優(yōu)異的抗菌性能，由于NPs高的膜滲透性、多重抗菌效果和能夠作為細菌外排泵抑制劑等能力，不易使細菌產(chǎn)生耐藥性，但是在使用時，金屬和金屬氧化物NPs會釋放出金屬離子，對哺乳動物細胞造成損傷[8-9]，因此，需要開發(fā)一種有效、安全且不易引起細菌耐藥性的新型抗菌物質(zhì)。

碳量子點（碳點）是一類新型零維納米材料，平均粒徑小于10 nm。因其尺寸小、易于合成、熒光性能優(yōu)異和生物相容性好等優(yōu)點而備受關(guān)注[10]，這些特點使碳點能夠應(yīng)用于催化劑[11]、藥物遞送[12]、細胞成像[13]、光動力治療[8]、生物傳感[14]等多個領(lǐng)域。碳點的合成方法根據(jù)碳源不同可分為“自上而下”和“自下而上”2種方法[15]。“自上而下”的合成方法是以大型富含碳的材料為碳源，利用物理化學方法包括化學氧化[16]、激光燒蝕[17]等將其分解，然后利用物理方法剝離出碳點。“自下而上”的合成方法則用小的前體物質(zhì)通過水熱法[3]、熱分解法[18]、微波法[15]等方法合成碳點。有研究表明，碳點的抗菌性能好，不會使細菌產(chǎn)生耐藥性[18]，與金屬納米粒子相比，碳點的細胞毒性更低[19]，因此碳點在抗菌方面的研究越來越多。碳點有多種抗菌機制，包括產(chǎn)生活性氧[20]、抑制細菌細胞壁合成[21]、破壞細菌DNA[22]等。碳點表面有豐富的活性官能團，在碳點表面修飾特異性基團可以提高其抗菌性能。郁靜雯等[23]對合成的碳點進行氟化修飾，抗菌實驗表明修飾后的碳點抗菌性能有顯著提高。Chen等[24]用光敏劑姜黃素對碳點進行修飾，修飾后的碳點能夠光動力滅活副溶血弧菌并且能清除生物被膜。

碳點合成來源多樣，如蛋白質(zhì)[25]、細菌[26]、蛋清[27]和蜂蜜[28]等物質(zhì)都可以用來合成碳點。不同的前體賦予碳點不同的理化和功能特性[29]。有機碳源的碳點可通過多種方法制備，碳點會與合成它的有機試劑具有相似性，但是當反應(yīng)溫度過高時，相似性就消失了；納米碳粉和石墨是合成碳點最常用的無機碳源。石墨制備的碳量子點具有過氧化物酶活性，可催化H2O2分解并生成羥基自由基[30]；與合成碳源相比，天然碳源具有生態(tài)友好、經(jīng)濟高效、易得到等優(yōu)點[31-32]。碳點與其天然碳源的相似性主要是由于氧、氮、磷等雜原子的存在。雜原子存在的差異導致天然來源的碳點具有不同的性質(zhì)。Li等[33]使用賴氨酸和精氨酸通過熱解法一步合成碳點，該碳點具有良好的抗菌和抑制生物被膜的效果，而且無細胞毒性，并且對哺乳動物組織修復有促進效果。Wang等[21]利用雙季銨鹽通過水熱法合成了碳點，合成的碳點對抗藥性金黃色葡萄球菌具有顯著的抑制效果，并且能抑制和清除生物被膜。Zhao等[34]利用二甲基二烯丙基氯化銨和葡萄糖合成了季胺化碳點，通過實驗證明，該碳點具有優(yōu)異的抗菌性能，在混合菌感染創(chuàng)面小鼠模型中，碳點能明顯恢復小鼠體重，顯著降低嚴重感染導致小鼠死亡，促進感染創(chuàng)面恢復愈合，因此，選用碳點進行抗菌方面研究。

本研究以多巴胺和精胺為前體物，采用熱解法合成3種氨基功能化抗菌碳點，通過TEM、XPS、Zeta電位、紅外光譜、紫外光譜等方法對碳點結(jié)構(gòu)和光學性能進行表征，采用微量肉湯微量稀釋法研究3種氨基功能化碳點對食源性致病菌（金黃色葡萄球菌和大腸桿菌）的抗菌性能，并初步探索抗菌機制。研究發(fā)現(xiàn)碳點的抗菌效果隨合成材料的改變而發(fā)生變化，可以選擇合適的材料合成高效抗菌碳點作為抗生素替代品應(yīng)用于食源性致病菌消除領(lǐng)域。

1 實驗

1.1 材料與儀器

主要材料：金黃色葡萄球菌（）、大腸桿菌（），遼寧省渤海大學食品安全重點實驗室提供，在37 ℃，160 r/min下培養(yǎng)。多巴胺鹽酸鹽，上海源葉生物科技有限公司；精胺鹽酸鹽，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；LB肉湯、LB營養(yǎng)瓊脂，青島海博生物科技有限公司；氯化鈉，福辰化學試劑有限公司。

主要儀器：DHP–9082電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海齊欣科學儀器有限公司；1000TM梯度PCR儀，美國BIO–RAD公司；PowerPacTMBasic電泳儀，美國BIO–RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 氨基功能化抗菌碳量子點的制備

稱取0.5 g的精胺和0.5 g的多巴胺，1 g精胺和1 g多巴胺分別放入坩堝，各加入1 mL的超純水，放入馬弗爐中250 ℃加熱2 h，待坩堝溫度降到室溫之后，將20 mL的水加到坩堝中并超聲1 h使固態(tài)物質(zhì)溶解。然后在12 000 r/min下離心1 h，將上清液用500 u透析袋透析5 h，每隔1 h換一次水。透析后的碳點溶液置于4 ℃保存或凍干后使用。

1.2.2 氨基功能化抗菌碳量子點的表征

使用FEI–Talos F200X透射電子顯微鏡（TEM）分析碳點的形貌；使用NICOLET iS10傅里葉變換紅外光譜儀表征碳點的紅外光譜（FTIR）；使用UV–2550紫外–可見分光光度計記錄碳點的紫外吸收光譜；使用970CRT型熒光分光光度計測碳點的熒光光譜；使用賽默飛 EscaLab 250Xi X射線光電子能譜儀（XPS）測定碳點的元素組成。

1.2.3 氨基功能化抗菌碳量子點的抑菌實驗

參考方福玲等[15]的實驗方法，將培養(yǎng)至對數(shù)期生物細菌離心去除培養(yǎng)基，用生理鹽水洗3次后使用。將104CFU/mL的菌液與碳點混合，在160 r/min、37 ℃搖床中培養(yǎng)3 h，然后吸取100 μL菌液涂布于LB營養(yǎng)瓊脂，放入37 ℃培養(yǎng)16 h。每組3個平行，將能完全（＞99%）抑制細菌生長的最低濃度定義為最小抑菌濃度（min）。

1.2.4 細菌形態(tài)觀察（SEM）

參考梅佳林等[35]的方法，將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的和離心（6 000 r/min，10 min），并用生理鹽水洗3次收集菌體，然后將108CFU/mL的菌液與碳點混合，使碳點最終濃度為1min、2min，置于搖床中培養(yǎng)6 h后離心，并用生理鹽水洗3次，以5 mm×5 mm的鋅片為載體，用體積分數(shù)為2.5%的戊二醛固定4 h，最后依次用體積分數(shù)為30%、50%、70%、90%、100%的乙醇對鋅片梯度洗脫，每個濃度靜置處理15 min，將樣品放在室溫干燥，將干燥后的鋅片進行噴金處理，然后用掃描電鏡觀察細胞形態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基功能化抗菌碳點的結(jié)構(gòu)形態(tài)表征

2.1.1 透射電鏡分析

由圖1的量子點透射電鏡觀察可知，所得到的3種碳點均為類球狀，分布均勻，沒有聚集。SPM–CDs、DA–CDs、SPM/DA–CDs平均粒徑分別為（4.25±0.89）、（3.90±0.67）、（4.0±0.96）nm。從高分辨TEM圖像表明SPM–CDs、DA–CDs、SPM/DA–CDs有明顯的晶格條紋，晶格間距分別為0.21、0.24、0.26 nm，對應(yīng)石墨（102）（100）（020）的衍射面[19]，表明成功合成了碳點。超小的粒徑可以使碳點通過細胞壁、細胞膜進入細胞，起到殺菌的效果。

圖1 碳點的透射電鏡圖像

注：左下角插圖為碳點HR–TEM晶格條紋圖像。

2.1.2 紅外光譜分析

通過紅外光譜對3種碳點表面基團進一步進行分析，從圖2可以看出，3種碳點保留了許多前體的化學結(jié)構(gòu)，都在3 300～3 500 cm?1有吸收峰，表明3種碳點都含有N?H和O?H，在2 950 nm?1處的峰是由于C?H的伸縮振動，1 610、1 382、1 238 nm?1分別對應(yīng)C=C、C?N、C?O拉伸振動峰[10, 36]。在1 610 nm?1處，SPM–CDs、DA–CDs、SPM/DA–CDs對應(yīng)的峰強度逐漸增加，可能是由于石墨化程度的不同所致。從表1中可以看出，3種碳點中SPM/ DA?CDs碳元素含量最高，表明SPM/DA?CDs石墨化程度最高。

2.1.3 X射線光電子能譜分析

使用XPS測定了碳點表面的元素組成，由圖3a、b、c可以看出，3種碳點主要包含C（285 eV）、N（400 eV）、O（531 eV）3種元素。從高分辨圖譜C1s可以看出，3種碳點均含有C?C（284.4 eV±0.08 eV）、C=C（284.2 eV± 0.22 eV）、C?O（285.9 eV±0.26 eV）、C?N（285.2 eV± 0.28 eV）鍵，表明3種碳點表面均含有親水基團。從高分辨圖譜N1s可以看出，3種碳點均保留了前體的氨基，DA–CDs和SPM/DA–CDs 2種碳點都有吡咯氮和石墨氮結(jié)構(gòu)的形成，表明N原子成功摻雜到碳核中[37]，SPM–CDs表面酰亞胺鍵可能是由于精胺在高溫條件下發(fā)生縮合反應(yīng)形成的。高分辨O1s顯示3種碳點均含有C?O、O?H鍵。XPS結(jié)果與FTIR結(jié)果一致。

圖2 精胺、多巴胺、SPM–CDs、DA–CDs、 SPM/DA–CDs的FTIR光譜

表1 DA–CDs、SPM–CDs、SPM/DA–CDs的元素含量和zeta電位

Tab.1 Element content and zeta potential of DA–CDs, SPM–CDs and SPM/DA–CDs

表1為碳點所含3種元素的具體含量和碳點的電位。由表1可知，3種碳點均帶有較高的正電荷，可能是由于碳點表面有大量氨基的存在，高的電位使得碳點的水溶液有一個良好的穩(wěn)定性，正電荷使碳點能與細菌通過靜電作用結(jié)合，發(fā)揮抗菌作用。碳點的抗菌效果與表面電荷和所帶電荷量相關(guān)，帶正電的碳點的抗菌能力強于帶負電和不帶電碳點的抗菌能力[38]。

2.2 氨基功能化抗菌碳點的光學性質(zhì)

由圖4a可以看出，3種碳點在365 nm紫外燈照射下均發(fā)出熒光，多巴胺在加入亞精胺后，合成的碳點熒光強度變強。通過紫外–可見吸收光譜（圖4b）可以看出，3種碳點在280 nm都有吸收峰，歸因于共軛C=C的π–π*躍遷，在300 nm的吸收峰歸因于C?N的n–π轉(zhuǎn)移[3, 19]。由熒光光譜可知（圖4c），在360 nm的激發(fā)波長下，SPM/DA–CDs的熒光強度最強，這與在365 nm紫外燈下看到的結(jié)果一致，可能是由于碳點表面基團的改變和元素的摻雜導致熒光強度的變化。

2.3 氨基功能化抗菌碳量子點抗菌性能測試

以和為代表菌種，評估3種氨基功能化碳點和前體物的抗菌能力，如圖5所示，在相同質(zhì)量濃度（2 mg/mL）下，SPM/DA–CDs抗菌效果最好，DA–CDs有一定的抗菌效果，而SPM–CDs、精胺和多巴胺沒有抗菌效果。

SPM/DA–CD具有顯著的抗菌效果，測定了其對2種菌的最小抑菌濃度。由圖6可知，隨著碳點濃度的增加，平板上2種菌的菌落數(shù)量在逐漸減少，從涂布結(jié)果可以得出SPM/DA–CDs對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為0.25 mg/mL，對大腸桿菌的最小抑菌濃度為0.5 mg/mL。碳點對2種菌抑制效果的差異可能與細菌細胞壁結(jié)構(gòu)的差異有關(guān)。革蘭氏陽性菌表面有一層由肽聚糖和磷壁酸構(gòu)成的單層膜結(jié)構(gòu)，磷壁酸所帶的負電荷使碳點表面的氨基能快速結(jié)合，從而破壞細菌細胞壁使細胞內(nèi)物質(zhì)泄漏導致細胞死亡。革蘭氏陰性菌表面具有雙層膜結(jié)構(gòu)，外層含有通過與正價鍵交聯(lián)的脂多糖，使碳點與菌的結(jié)合較弱[39-40]。

圖3 碳點的XPS結(jié)果

圖4 碳點光學性能表征結(jié)果

圖5 對照組和用不同材料處理的S.aureus和E.coli在LB瓊脂板上形成的代表性菌落

圖6 SPM/DA–CDs對S.aureus和E.coli的最小抑菌濃度

2.4 抑菌機理

為了探究碳點抗菌機理，使用掃描電鏡觀察不同濃度SPM/DA–CDs處理后的細菌形貌。從圖7可以看出，碳點處理前，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌邊緣清晰，細胞壁完整。金黃色葡萄球菌呈球形結(jié)構(gòu)，大腸桿菌呈桿狀結(jié)構(gòu)，而經(jīng)過碳點處理的細胞膜受到嚴重破壞，隨著碳點濃度的增加，細菌被破壞的程度增大。當碳點濃度為1min時，細胞表面變得粗糙并且出現(xiàn)凹陷，當碳點濃度達到2min時，菌體遭到嚴重破壞，細菌細胞中內(nèi)容物流出，由此推測可能由于碳點表面的正電荷使其能快速與帶負電的細菌結(jié)合，破壞細菌細胞結(jié)構(gòu)，導致細胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，碳點進入細胞后，也會破壞細菌蛋白質(zhì)和核酸，最終導致細菌死亡[41]。

圖7 碳點處理前后S.aureus和E.coli的SEM圖像

圖8 碳點抗菌機制

3 結(jié)語

文中以多巴胺和精胺為原料，采用熱解法合成了3種氨基功能化碳點，并對碳點進行表征。結(jié)果顯示，SPM–CDs、DA–CDs、SPM/DA–CDs平均粒徑分別為（4.25±0.89）、（3.90±0.67）、（4.0±0.96）nm，3種碳點表面富含C=C、C?H、N?H等官能團，碳點表面大量氨基的存在使合成的3種碳點在水溶液中都帶有較高的正電荷，賦予碳點水溶液良好的穩(wěn)定性。3種碳點都具有熒光性能，其中SPM/DA–CDs熒光性能最優(yōu)異，可能是由于亞精胺的加入改變了碳點的表面狀態(tài)，從而引起了碳點的變化。抑菌實驗結(jié)果表明，SPM/DA–CDs對食源性致病菌（金黃色葡萄球菌和大腸桿菌）具有顯著的抑制效果，最小抑菌濃度分別為0.25 mg/mL和0.5 mg/mL。根據(jù)碳點處理后細菌的掃描電鏡結(jié)果推測，可能是由于碳點的小尺寸以及表面大量的正電荷使碳點能快速與細菌結(jié)合并進入細菌細胞內(nèi)，從而破壞細菌細胞結(jié)構(gòu)，造成胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，導致細菌死亡。根據(jù)實驗結(jié)果可知，SPM/DA–CDs具有良好的熒光性能和抗菌效果，有望在食源性致病菌防治領(lǐng)域得到應(yīng)用。

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Preparation and Antibacterial Properties of Amino Functionalized Antibacterial Carbon Quantum Dots

CUI Fang-chao1, ZHOU Shan-shan1, WANG Dang-feng1, TAN Xi-qian1, LI qiu-ying1, LI Ting-ting2, LI Jian-rong1

(1. a. College of Food Science and Engineering b. National & Local Joint Engineering Research Center of Storage, Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products, Bohai University, Liaoning Jinzhou 121013, China; 2. College of Life Science, Dalian Minzu University, Liaoning Dalian 116600, China)

The work aims to synthesize amino-functionalized antibacterial carbon quantum dots with spermine and dopamine as raw materials, to provide reference for their further application in elimination of foodborne pathogens. Spermine carbon dots, dopamine carbon dots and spermine/dopamine carbon dots (SPM–CDs, DA–CDs, SPM/DA–CDs) were synthesized by pyrolysis of spermine and dopamine. The carbon dots were characterized by transmission scanning electron microscopy, X-ray photoelectron spectroscopy, infrared spectroscopy, zeta potential, ultraviolet spectroscopy and fluorescence spectroscopy. Foodborne pathogenic bacteriaandwere selected as the test strains. The antibacterial properties of carbon dots and their precursors were studied by the micro broth dilution method. The results showed that SPM-CDs, DA-CDs and SPM/DA-CDs had good dispersion, with average particle sizes of (4.25±0.89), (3.90±0.67) and (4.0±0.96) nm, respectively. Under the irradiation of 365 nm UV lamp, the three carbon spots could emit fluorescence, and the surface had high positive charge and contained chemical bonds such as C=C, C?O, O?H; The antibacterial experiment showed that SPM/DA-CDs had significant inhibitory effect onand, and the minimum inhibitory concentration was 0.25 mg/mL and 0.5 mg/mL respectively, while SPM-CDs, DA-CDs and precursors had poor inhibitory effect on the two bacteria; SEM results showed that the carbon spots could cause the bacterial surface depression and rupture, leading to the death of bacteria. The amino functionalized antibacterial carbon dots synthesized in this work have superior antibacterial effect and are expected to be applied to the prevention and treatment of foodborne pathogens, reduce the potential safety hazards caused by pathogenic bacteria in food, and ensure food safety and human health.

carbon quantum dots; pyrolysis method; foodborne pathogenic bacteria; antibacterial; antibacterial mechanism

O613.71

A

1001-3563(2023)05-0121-09

10.19554/j.cnki.1001-3563.2023.05.016

2022?08?10

國家重點研發(fā)計劃課題（2019YFD0901702）

崔方超（1989—），男，博士，講師，主要研究方向為水產(chǎn)品貯藏加工及安全控制。

李婷婷（1978—），女，博士，教授，主要研究方向為水產(chǎn)品貯藏、加工及質(zhì)量安全控制；勵建榮（1964—），男，博士，教授，主要研究方向為生鮮食品貯藏加工及食品安全。

責任編輯：曾鈺嬋