郭倩, 張秦, 管群

圍絕經(jīng)期綜合征（MPS）是指婦女在絕經(jīng)前后出現(xiàn)以自主神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂為主、伴有低雌激素癥狀的一組證候群[1］。中醫(yī)學(xué)將本病歸屬于“絕經(jīng)前后諸證”“經(jīng)斷前后諸證”等范疇。國醫(yī)大師夏桂成教授提出本病的病因病機(jī)以腎陰虛為本、心肝火旺為標(biāo), 主張以清心滋（肝）腎、燮理陰陽為治療大法[2］, 故創(chuàng)立名方清心滋腎湯。清心滋腎湯問世至今, 幾經(jīng)化裁, 治療MPS驗(yàn)效頗豐[3］。方中鉤藤清心除煩、平肝安神, 蓮子心清心除煩安神, 黃連有清熱瀉火、燥濕解毒之效, 淮山藥有補(bǔ)脾養(yǎng)胃、生津益肺、補(bǔ)腎澀精之功, 山茱萸能滋補(bǔ)肝腎、止汗, 太子參有益氣健脾、生津潤肺之效, 茯苓有健脾寧心、利水滲濕之能, 熟地能滋陰養(yǎng)血、益精充髓。諸藥合用, 使得心腎相交、水火既濟(jì)、臟腑平秘。但尚未有關(guān)于其藥理作用的研究, 對于清心滋腎湯治療MPS的有效成分、作用靶點(diǎn)和機(jī)制仍不是十分明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是運(yùn)用數(shù)據(jù)庫檢索、計(jì)算機(jī)模擬以及數(shù)據(jù)分析等方法, 構(gòu)建藥物成分-靶點(diǎn)-疾病的調(diào)控網(wǎng)絡(luò), 為中醫(yī)藥治療疾病提供理論支撐[4］。本研究于2021年1—6月運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討清心滋腎湯治療MPS的作用機(jī)制, 以及可能的信號通路, 以期為臨床實(shí)踐提供理論依據(jù)以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供方向。

1 資料與方法

1.1 清心滋腎湯藥物活性成分及靶點(diǎn)的收集和篩選通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫, 以口服生物利用度（OB）≥30%、藥物相似性（DL）≥0.18作為篩選條件, 對清心滋腎湯中8味中藥（鉤藤、蓮子心、黃連、淮山藥、山茱萸、太子參、茯苓、熟地）的活性成分和靶點(diǎn)進(jìn)行檢索。再將活性成分對應(yīng)的靶點(diǎn)基因?qū)氲鞍踪|(zhì)數(shù)據(jù)庫Uniprot, 限定物種為人（Homo sapiens）, 并對每個(gè)靶點(diǎn)對應(yīng)的基因進(jìn)行校正, 從而獲得標(biāo)準(zhǔn)化的名稱Gene Symbol, 簡稱Symbol。

1.2 MPS疾病靶點(diǎn)的預(yù)測將“Perimenopausal syndrome”和“Climacteric syndrome”作為檢索詞, 通過檢索基因名片數(shù)據(jù)庫GeneCards、人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫OMIM、治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫TTD、藥物基因組學(xué)知識庫PharmGkb、DrugBank等疾病相關(guān)數(shù)據(jù)庫, 去除重復(fù)的靶點(diǎn)后取并集, 獲得疾病靶點(diǎn)基因。

1.3 清心滋腎湯對MPS作用靶點(diǎn)的預(yù)測運(yùn)用Venn R對MPS疾病基因與清心滋腎湯藥物共同靶點(diǎn)進(jìn)行對比分析, 將MPS與中藥活性成分對應(yīng)的靶點(diǎn)基因取交集, 將交集靶點(diǎn)作為構(gòu)建中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的橋梁。

1.4 構(gòu)建清心滋腎湯“活性成分-靶點(diǎn)”中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)將藥物活性成分、MPS靶點(diǎn)基因、交集靶點(diǎn)基因?qū)隒ytoscape 3.8.0中, 構(gòu)建清心滋腎湯“活性成分-靶點(diǎn)”復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.5 構(gòu)建交集基因蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)運(yùn)用String數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI分析, 導(dǎo)入中藥活性成分對應(yīng)的靶點(diǎn)基因與疾病靶點(diǎn)基因的交集, 設(shè)置蛋白種類為“Homo sapiens”, 設(shè)置相互作用閾值為“medium confidence”（0.4）, 去除游離節(jié)點(diǎn), 建立PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.6 基因本體論（GO）與京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫（KEGG）富集分析將基因Symbol轉(zhuǎn)化為基因ID, 通過R軟件進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析, 繪制氣泡圖及相關(guān)信號通路圖。

2 結(jié)果

2.1 篩選清心滋腎湯有效活性成分通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索出清心滋腎湯中包含的藥物, 經(jīng)OB、DL值篩選出可被口服吸收的119個(gè)活性成分, 刪除無作用及重復(fù)靶點(diǎn), 獲得93個(gè)有效活性成分, 如表1。

表1 清心滋腎湯中藥活性成分

2.2 篩選MPS疾病基因以“Perimenopausal syndrome”和“Climacteric syndrome”為檢索詞在 Gene-Cards、OMIM、TTD、PharmGkb、DrugBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行查找, 最終在GeneCards、PharmGkb、DrugBank檢索到相應(yīng)內(nèi)容, 將3個(gè)數(shù)據(jù)庫檢索到的基因取并集、去重復(fù), 共得到451個(gè)MPS的基因靶點(diǎn)。

2.3 “藥物靶點(diǎn)-疾病基因”交集作用靶點(diǎn)的預(yù)測運(yùn)用R x64 4.1.1對清心滋腎湯中有效活性成分對應(yīng)的基因靶點(diǎn)和MPS疾病靶點(diǎn)進(jìn)行Venn分析, 獲得 54個(gè)顯效靶點(diǎn)基因交集, 主要有SCN5A、雌激素受體-1（ESR1）、OPRM1、AR、ADRA1B、ADRA1D、MAPK1、CDKN1A、血紅素加氧酶1（HMOX1）、孕激素受體（PGR）、CYP3A4等靶點(diǎn)。

2.4 構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)基因”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)基于Cytoscape構(gòu)建清心滋腎湯各藥物活性成分與MPS疾病靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)圖, 如圖1。其中度值（Degree）越高, 表示其在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用越強(qiáng)。圖1是由54個(gè)潛在靶點(diǎn)基因和69個(gè)活性成分組成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。由于每個(gè)潛在的靶點(diǎn)基因都與多個(gè)活性成分之間存在聯(lián)系, 可以推測清心滋腎湯治療MPS可能是多靶點(diǎn)、多途徑的。

圖1 清心滋腎湯治療圍絕經(jīng)期綜合征“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”可視化網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 清心滋腎湯與MPS交集基因PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將“2.3”中得到的54個(gè)交集基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫, 設(shè)置物種為Homo sapiens, medium confidence設(shè)置為0.400, 去除游離節(jié)點(diǎn), 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖, 如圖2。該圖由54個(gè)節(jié)點(diǎn)（Node）、350條邊（Edge）構(gòu)成, 平均節(jié)點(diǎn)度值為13。

圖2 清心滋腎湯治療圍絕經(jīng)期綜合征交集靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）圖

將構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)圖以tsv的形式導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0, 運(yùn)用CytoNCA對節(jié)點(diǎn)進(jìn)行BC（betweenness centralities）、CC（closeness centralities）、DC（degree centralities）、EC（eigenvector centralities）、LAC（local average connectivity-based centralities）、NC（network centralities）數(shù)值再計(jì)算一次, 選取數(shù)值大于中位值的節(jié)點(diǎn)構(gòu)建PPI核心, 該核心由12個(gè)節(jié)點(diǎn)、74條邊構(gòu)成, 根據(jù)度值由大到小依次為：白細(xì)胞介素（IL）-6（度值80）、IL-1β（度值64）、ESR1（度值54）、人纖溶酶原激活物抑制劑1（SERPINE1）（度值52）、過氧化物酶體增生激活受體γ（PPARG）（度值52）、補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白（CRP）（度值42）、細(xì)胞周期蛋白D1（CCND1）（度值40）、PGR（度值38）、HMOX1（度值38）、血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）（度值36）、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3（IGFBP3）（度值32）、細(xì)胞色素P450芳香化酶（CYP19A1）（度值30）, 以上

基因被認(rèn)為是治療MPS的核心靶點(diǎn)。

續(xù)表1 清心滋腎湯中藥活性成分

2.6 GO富集分析運(yùn)用R軟件將基因Symbol轉(zhuǎn)換為基因ID。對“2.5”中獲得的核心靶點(diǎn)基因進(jìn)行 GO 富集分析, 共獲得P＜0.05的GO功能條目1 280條, 其中生物過程（BP）1 180條, 細(xì)胞組分（CC）39條, 分子功能（MF）61條。其中生物過程、細(xì)胞組分、分子功能富集基因數(shù)排序前31位的GO分析結(jié)果繪制氣泡圖, 如圖3。生物過程主要富集在對藥物的反應(yīng)、多細(xì)胞生物過程、對脂多糖的反應(yīng)、對細(xì)菌來源分子的反應(yīng)等生物反應(yīng)。細(xì)胞組分主要富集在細(xì)胞膜筏、細(xì)胞膜微結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞膜小窩、血漿細(xì)胞膜筏等細(xì)胞部位。分子功能主要富集在核受體活動(dòng)、配體激活、轉(zhuǎn)錄因子活動(dòng)、G蛋白偶聯(lián)受體活性等。如圖3所示, 可以推測清心滋腎湯是通過調(diào)節(jié)多個(gè)GO功能來發(fā)揮治療作用的。

圖3 清心滋腎湯治療圍絕經(jīng)期綜合征GO富集氣泡圖

2.7 KEGG通路富集分析通過KEGG通路富集分析共獲得162條信號通路, 找到與MPS相關(guān)信號通路Estrogen signaling pathway（雌激素信號通路）繪制通路圖, 如圖4。篩選出前30條信號通路, 繪制氣泡圖, 如圖5。根據(jù)氣泡圖可以看出主要涉及的信號通路有糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE信號通路、化學(xué)致癌作用受體激活通路、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化信號通路、PI3K-Akt信號通路、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化通路、乳腺癌通路、細(xì)胞衰老通路等。由此可見, 清心滋腎湯通過協(xié)同作用于多條信號通路來治療MPS。選取相關(guān)性最大的AGE-RAGE信號通路繪制通路圖, 如圖6。

圖4 清心滋腎湯Estrogen signaling pathway（雌激素信號通路）潛在靶基因KEGG分析圖

圖5 清心滋腎湯治療圍絕經(jīng)期綜合征KEGG信號通路氣泡圖

圖6 清心滋腎湯AGE-RAGE信號通路潛在靶基因KEGG分析圖

3 討論

由圖1可以發(fā)現(xiàn), 清心滋腎湯中起作用的主要活性成分共69個(gè), 其中度值較高的活性成分有木樨草素、槲皮素、豆甾醇、谷固醇、山柰酚、四氫鴨腳木堿等, 提示這些活性成分在改善圍絕經(jīng)期癥狀中發(fā)揮重要作用, 推測其可能是清心滋腎湯治療MPS的有效成分。木樨草素是天然黃酮類化合物中的代表性成分, 具有抗炎、抗氧化、降血壓和舒張血管、抗動(dòng)脈硬化等藥理學(xué)作用[5］。山柰酚亦為黃酮類化合物, 研究顯示, 山柰酚和木樨草素具有抗脂代謝紊亂和抗細(xì)胞凋亡的功效, 從而起到保護(hù)缺血心肌的作用[6］。此外, 山柰酚可通過上調(diào)骨骼肌P13KAKT-GLUT4信號通路, 改善糖尿病小鼠胰島素抵抗[7］。由此可見, 山柰酚和木樨草素可以改善圍絕經(jīng)期女性糖脂代謝紊亂的狀態(tài), 降低心血管病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。槲皮素具有抗炎、抗氧化、降糖、降脂、促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖改善卵巢功能等作用[8］, 即通過改善卵巢功能, 提高雌激素水平從而降低MPS遠(yuǎn)期并發(fā)癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。豆甾醇和谷固醇分別作為植物甾醇和植物固醇, 具有抗炎、抗氧化、抗癌、降膽固醇、調(diào)節(jié)體內(nèi)激素和調(diào)節(jié)代謝的作用[9-10］。四氫鴨腳木堿是從雞骨常山中提取的生物堿類化合物, 具有抗高血壓、抗糖尿病、抗菌等作用[11］。故清心滋腎湯有效成分對高血壓、糖尿病、高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化、氧化應(yīng)激等圍絕經(jīng)期易出現(xiàn)的疾病均具有一定的干預(yù)作用。

通 過 構(gòu) 建PPI核 心 得 到IL-6、IL-1β、ESR1、PPARG、PGR、CYP19A1等12個(gè)與MPS關(guān)系較為密切的靶點(diǎn)基因。圍絕經(jīng)期病人由于雌激素水平明顯下降, 雌激素受體亦隨之下降, 導(dǎo)致免疫細(xì)胞不能產(chǎn)生足夠量的IL-6、IL-1β等免疫介質(zhì), 與去甲腎上腺素的比例失調(diào), 最終導(dǎo)致MPS臨床癥狀的發(fā)生[12］。ESR1表達(dá)水平和雌激素的生物學(xué)效應(yīng)相關(guān), ESR1基因中XbaI位和PvuI位多態(tài)性與早發(fā)性卵巢功能不全（POI）的發(fā)生存在相關(guān)性[13］。研究發(fā)現(xiàn)PGR信號傳導(dǎo)是卵母細(xì)胞排卵所必須的, PGR缺失小鼠無法排卵[14］。PPARG基因在調(diào)節(jié)胰島素敏感性、脂肪細(xì)胞特異基因表達(dá)方面有突出的作用, 可能與糖尿病、代謝綜合征的發(fā)生密切相關(guān)[15］。絕經(jīng)后使用芳香化酶抑制劑的乳腺癌病人的血脂水平與CYP19A1的單核苷酸多態(tài)性有關(guān)[16］。此外, 本研究 中 還 發(fā) 現(xiàn)CCND1、CRP、SERPINE1、HMOX1、VCAM-1、IGFBP3等基因也與MPS密切相關(guān)。

基于KEGG通路富集分析可以看出清心滋腎湯治療MPS的潛在信號通路包括糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE信號通路、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化信號通路、PI3K-Akt信號通路、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化通路等。研究顯示AGE-RAGE系統(tǒng)在炎癥反應(yīng)、細(xì)胞損傷等方面均有促進(jìn)作用, 參與心血管疾病、代謝綜合征、2型糖尿病、卵巢功能障礙等多種疾病的發(fā)生[17］。前期研究已經(jīng)證實(shí)清心滋腎湯能在一定程度上調(diào)節(jié)絕經(jīng)綜合征所引起的脂質(zhì)紊亂狀態(tài), 主要通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝發(fā)揮作用[18］, 推測與脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化信號通路有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)雌激素能增加一氧化氮（NO）的釋放, 降低內(nèi)皮素的產(chǎn)生, 而流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化信號通路可通過調(diào)控NO的釋放, 影響內(nèi)皮細(xì)胞的功能及血管通透性的改變, 促進(jìn)脂質(zhì)蓄積[19］, 故圍絕經(jīng)期女性由于卵巢功能的衰退, 雌激素水平下降, 易出現(xiàn)高血壓、代謝性疾病等。隨著生活質(zhì)量的提高, 對于圍絕經(jīng)期婦女心血管疾病的預(yù)防和治療引起了廣泛關(guān)注。PI3K-Akt信號通路是調(diào)控細(xì)胞生存、生長和增殖的經(jīng)典通路, 王君實(shí)等[20］研究發(fā)現(xiàn)亞麻木酚素的主要活性成分SDG可通過增加血清雌二醇水平激活ESR1, 從而激活PI3K-Akt-eNOS信號通路, 對去卵巢大鼠的心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。

綜上所述, 清心滋腎湯治療MPS可能是通過木樨草素、槲皮素、豆甾醇、谷固醇、山柰酚、四氫鴨腳木堿等有效成分作用于IL-6、IL-1β、ESR1、SERPINE1、PPARG、CRP、CCND1、PGR、HMOX1、VCAM-1、CYP19A1、IGFBP3等關(guān)鍵靶點(diǎn)通過調(diào)節(jié)糖脂代謝、抗氧化、改善雌激素代謝等作用機(jī)制達(dá)到治療MPS的作用。