許志波

葡萄膜黑色素瘤是一種罕見(jiàn)的癌癥, 也是最多見(jiàn)的一種成人原發(fā)性眼內(nèi)腫瘤[1］。雖然通過(guò)手術(shù)摘除或放射治療是控制眼內(nèi)腫瘤的好方法, 但高達(dá)一半的病人會(huì)發(fā)展為遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移性疾病, 致使病人預(yù)后很差[2-3］。對(duì)于轉(zhuǎn)移性葡萄膜黑色素瘤尚無(wú)有效的治療方法, 大多數(shù)病人轉(zhuǎn)移后存活不到12個(gè)月[3］。目前, 葡萄膜黑色素瘤的發(fā)病機(jī)制仍不明確, 并且缺乏有效的生物標(biāo)志物能夠識(shí)別高風(fēng)險(xiǎn)病人。因此迫切需要篩選腫瘤特異性預(yù)后因子以預(yù)測(cè)病人預(yù)后。微RNA（miRNA/miR）是一類高度保守的小分子內(nèi)源性非編碼RNA, 日益成為腫瘤等各種疾病發(fā)生的重要調(diào)節(jié)因子[4］, 也可作為葡萄膜黑色素瘤的潛在生物標(biāo)志物[5］。有研究對(duì)不同病理類型的葡萄膜黑色素瘤組織和正常葡萄膜黑色素組織進(jìn)行miRNA的差異分析, 發(fā)現(xiàn)microRNA-132-3p（miRNA-132-3p, miR-132-3p）在梭形和上皮細(xì)胞型葡萄膜黑色素瘤組織中表達(dá)上調(diào)[6］, 然而miR-132-3p對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞生物行為的影響及其機(jī)制尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究于2018年2月至2019年7月利用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn), 觀察miR-132-3p在葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞增殖和凋亡中的作用, 并進(jìn)一步探索其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料正常葡萄膜上皮細(xì)胞系A(chǔ)RPE-19和葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞系SP6.5、M23購(gòu)自武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心, 胎牛血清、洛斯維·帕克紀(jì)念研究所-1640（RPMI-1640）培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司, Lipofectamine 2000試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司, 膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（PI）凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物公司, 甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）、第10號(hào)染色體上缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物（PTEN）、B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、周期素依賴激酶抑制劑p21（P21）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）一抗購(gòu)自美國(guó)Cellular Signaling Technology公司, 辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所, miR-132-3p、miR-132-3p干擾質(zhì)粒（anti-miR-132-3p）、PTEN過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA3.1-PTEN）、熒光素酶報(bào)告載體購(gòu)自上海吉瑪生物有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染正常葡萄膜上皮細(xì)胞系A(chǔ)RPE-19、葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞系SP6.5、M23細(xì)胞中接種至含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基內(nèi), 培養(yǎng)于飽和濕度、37 ℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SP6.5細(xì)胞, 按2×105個(gè)/mL接種至6孔板, 利用Lipofectamine 2000試劑, 將miR-132-3p、anti-miR-132-3p、pcDNA3.1-PTEN及其相應(yīng)的陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至SP6.5細(xì)胞, 轉(zhuǎn)染完成48 h后進(jìn)行后續(xù)研究。

1.3 定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）檢測(cè)miR-132-3p表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ARPE-19、SP6.5、M23細(xì)胞, TRIzol法提取總RNA并將其逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA）, 進(jìn)行qPCR反應(yīng)。miR-132-3p正向引物5'GCGCGCGTAACAGTCTACAGC-3', 反向引物5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCC-3'。U6正向引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3', 反向引物5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGT-3'。以U6為內(nèi)參, 根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算miR-132-3p的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖收集各組SP6.5細(xì)胞, 加胰酶消化并調(diào)整細(xì)胞密度為2×104個(gè)/毫升。將細(xì)胞懸液接種至96孔板（100微升/孔）, 常規(guī)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后, 分別加入100 μL的MTT溶液孵育4 h, 加入200 μL的二甲基亞砜后置于搖床上孵育10 min。多功能酶標(biāo)儀測(cè)定各孔490 nm波長(zhǎng)處SP6.5細(xì)胞吸光度值, 吸光度值越大, 表明細(xì)胞活性越強(qiáng)。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡收集各組SP6.5細(xì)胞, 加入500 μL結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞, 分別加入5 μL Annexin V-FITC染色液和5 μL PI染色液, 室溫條件下避光反應(yīng)15 min, 通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)PTEN、cyclin D1、P21、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)收集各組SP6.5細(xì)胞, 分別加入放射免疫沉淀法（RIPA）裂解液, 提取總蛋白, 將蛋白沸水浴變性后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）, 轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉常溫封閉1 h, 加入一抗（稀釋比1∶1 000）4 ℃孵育24 h, 加Tris-HCl-Tween緩沖鹽溶液（TBST）漂洗3次, 加入二抗（稀釋比1∶2 000）37 ℃孵育1 h, 再次用TBST進(jìn)行充分漂洗后加化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯影。以GAPDH為內(nèi)參, 計(jì)算PTEN、cyclin D1、P21、Bcl-2、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.7 雙螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)利用TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-132-3p的靶基因, 發(fā)現(xiàn)miR-132-3p與PTEN的3'非編碼區(qū)（3'UTR）存在結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建含miR-132-3p結(jié)合位點(diǎn)的PTEN 3'UTR野生型（WT- PTEN）及突變型（MUT- PTEN）報(bào)告基因載體, 將其分別與miR-132-3p、miR-132-3p陰性對(duì)照（miRNC）共轉(zhuǎn)染至S65細(xì)胞, 48 h后根據(jù)雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒操作步驟, 檢測(cè)細(xì)胞雙螢光素酶相對(duì)活性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。計(jì)量數(shù)據(jù)表示為xˉ ±s, 兩組間比較用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較用單因素方差分析, 多組間兩兩比較比較用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-132-3p在細(xì)胞ARPE-19、SP6.5和M23中的表達(dá)qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示, miR-132-3p在葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞SP6.5、M23及正常葡萄膜上皮細(xì)胞ARPE-19中表達(dá)量為0.94±0.09、0.81±0.08、0.26±0.02（F=78.70,P＜0.001）；SP6.5、M23均高于ARPE-19（P＜0.05）。選擇差異最顯著的SP6.5細(xì)胞開(kāi)展后續(xù)研究。

2.2 抑制miR-132-3p對(duì)細(xì)胞SP6.5增殖、凋亡的影響在SP6.5細(xì)胞中轉(zhuǎn)染anti-miR-132-3p, 與antimiR-NC組比較, miR-132-3p表達(dá)量大幅減少, 24 h、48 h、72 h的細(xì)胞活性明顯降低, 細(xì)胞凋亡率顯著增加, cyclin D1、Bcl-2蛋白表達(dá)量降低而P21、Bax水平提高, 上述差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖1, 2；表1, 2。

表1 抑制miR-132-3p對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞SP6.5增殖的影響/xˉ ±s

圖1 抑制miR-132-3p對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞SP6.5凋亡的影響

圖2 抑制miR-132-3p對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞SP6.5增殖、凋亡蛋白表達(dá)的影響

表2 抑制miR-132-3p對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞SP6.5凋亡的影響/xˉ ±s

2.3 miR-132-3p靶向、調(diào)控PTEN生物學(xué)信息工具預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn), PTEN的3'UTR部分堿基內(nèi)含有miR-132-3p的結(jié)合位點(diǎn), 見(jiàn)圖3A。與miR-NC組比, miR-132-3p組WT- PTEN熒光素酶相對(duì)活性顯著降低（1.02±0.10比0.21±0.02,t=13.76、P＜0.05）, MUT- PTEN熒光素酶相對(duì)活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1.00±0.10比0.98±0.09,t=0.26、P＞0.05）。與miR-NC組比, miR-132-3p組PTEN表達(dá)量顯著降低（0.22±0.02比0.07±0.01,t=11.62、P＜0.05）, 與anti-miR-NC組比, anti-miR-132-3p組PTEN表達(dá)量顯著升高（0.19±0.02比0.60±0.06,t=11.23、P＜0.05）, 見(jiàn)圖3B。

圖3 miR-132-3p靶向、調(diào)控PTEN：A為PTEN的3＇非翻譯區(qū)（3'UTR）含有miR-132-3p的互補(bǔ)序列；B為miR-132-3p調(diào)控PTEN的表達(dá)

2.4 過(guò)表達(dá)PTEN對(duì)細(xì)胞S65增殖、凋亡的影響在S65細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PTEN, 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 相比于pcDNA3.1-PTEN陰性對(duì)照（pcDNA3.1）組, PTEN蛋白表達(dá)量明顯升高, 24 h、48 h、72 h的細(xì)胞活性逐漸降低, 細(xì)胞凋亡率有所增加, Bcl-2、cyclin D1水平顯著降低而P21、Bax表達(dá)量明顯提高, 上述差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3, 4。

表3 過(guò)表達(dá)PTEN對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞SP6.5增殖的影響/xˉ ±s

2.5 抑制PTEN可逆轉(zhuǎn)抑制miR-132-3p對(duì)細(xì)胞SP6.5增殖、凋亡的影響與anti-miR-NC組比較, 抑制miR-132-3p顯著影響SP6.5細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)量、24 h、48 h、72 h的細(xì)胞活性、細(xì)胞凋亡率和cyclin D1、P21、Bcl-2、Bax蛋白水平（P＜0.05）, 結(jié)果同“2.2”“2.3”。與anti-miR-132-3p+si-NC組比較, antimiR-132-3p和si-PTEN共轉(zhuǎn)染入SP6.5細(xì)胞, 24 h、48 h、72 h的細(xì)胞活性和cyclin D1、Bcl-2蛋白表達(dá)水平提高, 細(xì)胞凋亡率和PTEN、P21、Bax蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。見(jiàn)表5, 6。

表5 抑制PTEN可逆轉(zhuǎn)抑制miR-132-3p對(duì)細(xì)胞SP6.5增殖的影響/xˉ ±s

表4 過(guò)表達(dá)PTEN對(duì)細(xì)胞SP6.5凋亡的影響/xˉ ±s

表6 抑制PTEN能逆轉(zhuǎn)抑制miR-132-3p對(duì)細(xì)胞SP6.5凋亡的影響/xˉ ±s

3 討論

miRNA是一種短鏈非編碼RNA, 長(zhǎng)度從18到25個(gè)核苷酸不等, 在葡萄膜黑色素瘤等腫瘤進(jìn)程中發(fā)揮抑癌或致癌作用[7］, 如miR-21[8］, miR-9[9］, miR-181[10］。既往研究表明, miR-132-3p參與結(jié)直腸癌[11］、血管平滑肌脂肪瘤[12］、胃癌[13］等腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程。miR-132-3p在神經(jīng)膠質(zhì)瘤內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)明顯上調(diào)[14］, miR-132-3p在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào), 上調(diào)miR-132-3p的表達(dá)可顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和遷移并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15］。miR-132-3p過(guò)表達(dá)顯著抑制骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖, 并使細(xì)胞凋亡率明顯增加, 在骨肉瘤中起腫瘤抑制因子作用[16］。本研究中, miR-132-3p在SP6.5、M23細(xì)胞中表達(dá)上調(diào), 與前人研究[7, 15］結(jié)果一致。同時(shí), 抑制miR-132-3p表達(dá)顯著降低24 h、48 h、72 h的SP6.5細(xì)胞活性及cyclin D1、Bcl-2蛋白表達(dá)水平（P＜0.05）, 提高細(xì)胞凋亡率和P21、Bax蛋白表達(dá)水平（P＜0.05）, 表明抑制miR-132-3p表達(dá)可以抗葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡, 具有抗葡萄膜黑色素瘤作用。

PTEN是一種著名的抗腫瘤基因[17］, 在葡萄膜黑色素瘤中具有抑癌作用[18］。Abdel-Rahman等[19］第一次證明PTEN是一種腫瘤抑制因子, 參與葡萄膜黑色素瘤的發(fā)病機(jī)制, 可能與臨床結(jié)果有關(guān)。PTEN載體的過(guò)度表達(dá)抑制葡萄膜黑色素瘤MUM-2B細(xì)胞的侵襲[20］。在惡性黑色素瘤中, PTEN表達(dá)量明顯降低, 其缺失與惡性黑色素瘤進(jìn)展密切相關(guān)[21］。本研究中, 過(guò)表達(dá)PTEN明顯抑制24 h、48 h、72 h的SP6.5細(xì)胞活性和Bcl-2、cyclin D1水平（P＜0.05）, 提升細(xì)胞凋亡率和P21、Bax表達(dá)量（P＜0.05）, 與抑制miR-132-3p表達(dá)結(jié)果相同。PTEN抑制葡萄膜黑色素瘤的作用與前述報(bào)道相同, 為PTEN作為腫瘤抑制因子增加了新的證據(jù)。

大量資料顯示, miRNA通過(guò)與靶mRNA的3'UTR互補(bǔ)位點(diǎn)堿基配對(duì), 導(dǎo)致mRNA降解、裂解或翻譯抑制, 從而調(diào)控基因表達(dá)[22］。研究表明, 在乳腺癌細(xì)胞中, PTEN是miR-132和miR-212的直接靶點(diǎn), miR-132或miR-212處理顯著降低乳腺癌細(xì)胞MCF-7中PTEN表達(dá)[23］。在阿爾茨海默病中, miR-132關(guān)鍵靶點(diǎn)之一的PTEN表達(dá)上調(diào)[24］。在膠質(zhì)瘤內(nèi)皮細(xì)胞中, PTEN被鑒定為miR-132-3p的直接和功能性下游靶標(biāo)[15］。本研究的生物信息學(xué)和雙螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了miR-132-3p對(duì)PTEN的靶向結(jié)合關(guān)系。另外, 抑制PTEN能逆轉(zhuǎn)抑制miR-132-3p對(duì)SP6.5細(xì)胞抗增殖、促凋亡的作用, 表明miR-132-3p可能是通過(guò)調(diào)控PTEN表達(dá)影響葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞增殖和凋亡的。

綜上所述, miR-132-3p在葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào), miR-132-3p可通過(guò)靶向調(diào)控PTEN的表達(dá)抑制葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡, 這為葡萄膜黑色素瘤提供了新的候選預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。