于凡珍, 陳爍, 李家樹

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是呼吸系統(tǒng)疾病中的常見病和多發(fā)病, 是以持續(xù)氣流受限為特征的可以預防和治療的疾病, 其氣流受限多呈進行性發(fā)展。目前認為慢性炎癥和蛋白酶-抗蛋白酶失衡是COPD的主要發(fā)病機制[1］。鎖鏈素是近年發(fā)現(xiàn)的彈性蛋白特征性水解產(chǎn)物, 其體液含量可以反映肺組織中彈性蛋白的代謝情況, 被認為是肺損傷的敏感指標[2］。維生素K是γ-谷氨酰羧化酶的輔酶, 是激活凝血因子等多種蛋白質(zhì)的重要輔因子?；|(zhì)Gla蛋白（matrix gla protein, MGP）也是一種依賴維生素K激活的蛋白質(zhì), 具有抑制軟組織鈣化的重要作用。既往研究顯示維生素K可通過催化MGP的谷氨酸殘基羧化生成活性人羧化基質(zhì)Gla蛋白（cMGP）, 從而發(fā)揮抑制組織彈性蛋白鈣化、降解的作用[3-5］。循環(huán)中去羧化（Dp-uc；即非活性）MGP水平與維生素K水平呈負相關(guān), 已被用來評估血漿維生素K水平[6］。研究發(fā)現(xiàn)血漿維生素K水平下降可引起肺彈性蛋白降解增加, 并與肺氣腫的發(fā)生呈明顯負相關(guān)[7-8］。目前鎖鏈素、維生素K在COPD中的作用并未完全清楚, 本研究的目的在于探討COPD病人血漿鎖鏈素、維生素K水平及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2020年12月至2021年7月徐州醫(yī)科大學附屬連云港醫(yī)院收治的COPD病人為研究對象。病例納入標準：（1）納入COPD病人均符合中華醫(yī)學會呼吸學分會《慢性阻塞性肺疾病診治指南（2013年修訂版）》[1］中關(guān)于COPD的診斷標準。（2）一般資料完整, 能夠配合該研究順利進行。排除標準：（1）合并與鎖鏈素、MGP相關(guān)的系統(tǒng)性疾病如嚴重心血管及皮膚損傷性疾??；（2）合并除COPD以外的其他呼吸系統(tǒng)疾??；（3）合并有嚴重的肝腎、內(nèi)分泌、炎性腸道疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤及血液系統(tǒng)疾病；（4）服用維生素K拮抗劑（如苯丙酸酯和華法林等）或脂溶性維生素或其類似物治療者, 器官移植史病人等。

本研究共納入COPD病人60例為COPD組, 另選取同期體檢中心健康體檢病人30例為對照組。對照組一般資料完整, 能夠配合該研究順利進行。組間性別構(gòu)成、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、吸煙指數(shù)等一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）, 具有可比性。見表1。

表1 健康體檢對照組與慢性阻塞性肺疾病（COPD）組一般資料比較

本研究經(jīng)徐州醫(yī)科大學附屬連云港醫(yī)院倫理委員會審核批準（KY-20210714001-01）, 病人或其近親屬簽署知情同意書。

1.2 檢測指標

1.2.1 血漿鎖鏈素、非活性基質(zhì)Gla蛋白（Dp-uc-MGP）水平 COPD組與對照組病人均于就診當天, 用乙二胺四乙酸抗凝管抽取靜脈空腹晨血5 mL, 混合10～20 min后, 離心5 min左右（3 500 r/min）, 仔細收集上清, -80 ℃冰箱冷凍備用。血漿鎖鏈素、DpucMGP采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）進行檢測, 試劑盒均購自上海將來實業(yè)江萊生物。

1.2.2 血清炎性因子水平 COPD組與對照組病人均于就診當天, 用不含抗凝劑的真空采血管抽取靜脈空腹晨血5 mL, 混合10～20 min后, 離心5 min左右（3 500 r/min）, 仔細收集上清, 送該院檢驗科采用流式細胞儀（貝克曼庫爾特生物科技有限公司）檢測白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平。

1.2.3 肺功能 COPD組與對照組病人均于就診當天, 采用肺功能測量儀（德國JAEGER）進行肺功能測定, 記錄第1秒用力呼氣容積占預計值百分比（FEV1%）、一氧化氮彌散量（DLCO）。所有操作均由同一專業(yè)肺功能醫(yī)師在同一肺功能儀上進行。

1.3 COPD病人分組（1）根據(jù)2020年慢性阻塞性肺疾病全球倡議中規(guī)定的慢性阻塞性肺疾病急性加重期（AECOPD）診斷標準將不同進展期病人分為COPD穩(wěn)定期組和AECOPD組：COPD穩(wěn)定期組30例, 其中男25例, 女5例, 年齡（67.30±7.77）歲, 體質(zhì) 量 指 數(shù)（25.16±3.34）kg/m2, 吸 煙 指 數(shù)705.00±448.24；AECOPD組30例, 其中男25例, 女5例, 年齡（66.67±5.38）歲, 體質(zhì)量指數(shù)（24.82±4.42）kg/m2, 吸煙指數(shù)681.67±427.00。（2）根據(jù)COPD病人本次入院前1年內(nèi)急性加重次數(shù)分組：前一年發(fā)生2次及以上中/重度急性加重, 或1次及以上因急性加重住院的病人為COPD高風險組, 余為COPD低風險組。其中COPD高風險組27例, 其中男23例, 女4例, 年齡（66.70±7.66）歲, 體質(zhì)量指數(shù)（25.20±4.26）kg/m2, 吸煙指數(shù)709.26±472.52；COPD低風險組33例, 其中男27例, 女6例, 年齡（67.12±5.76）歲, 體質(zhì)量指數(shù)（24.81±3.61）kg/m2, 吸煙指數(shù)680.30±407.15。

以上COPD穩(wěn)定期組和AECOPD組、COPD高風險組和COPD低風險組組間性別構(gòu)成、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、吸煙指數(shù)等一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）, 具有可比性。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以±s表示, 方差齊的組間比較采用獨立樣本t檢驗, 方差不齊的組間比較采用Mann-Whitney檢驗；非正態(tài)分布的計量資料采用中位數(shù)（第25、第75百分位數(shù)）[M（P25,P75）］表示, 組間比較采用Mann-Whitney檢驗。計數(shù)資料采用例數(shù)表示, 組間比較采用χ2檢驗。相關(guān)性分析采用Pearson進行。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 COPD組與對照組鎖鏈素、Dp-ucMGP、炎性因子及肺功能指標比較與對照組相比, COPD組血鎖鏈素、Dp-ucMGP、IL-6、TNF-α水平較高（P＜0.05）, 肺功能指標FEV1%、DLCO較低（P＜0.05）, 見表2。

表2 健康體檢對照組與COPD組鎖鏈素、Dp-ucMGP、炎性因子及肺功能指標比較/±s

表2 健康體檢對照組與COPD組鎖鏈素、Dp-ucMGP、炎性因子及肺功能指標比較/±s

注：COPD為慢性阻塞性肺疾病, Dp-ucMGP為非活性基質(zhì)Gla蛋白, IL-6為白細胞介素-6, TNF-α為腫瘤壞死因子-α, FEV1%為第1秒用力呼氣容積占預計值百分比, DLCO為一氧化氮彌散量。

組別對照組COPD組t（Z）值P值例數(shù)30 60鎖鏈素/（μg/L）1.84±0.89 3.03±0.96 5.69＜0.001 Dp-ucMGP/（μg/L）8.93±1.78 11.24±1.45 6.60＜0.001 IL-6/（ng/L）2.45±1.41 3.97±1.91 3.86＜0.001 TNF-α/（ng/L）2.95±1.79 6.19±3.17（4.57）＜0.001 FEV1%/%81.65±11.46 53.44±16.43 6.68＜0.001 DLCO/mmol·min-1·kPa-1 6.22±0.94 4.31±1.29 5.85＜0.001

2.2 不同進展期COPD病人鎖鏈素、Dp-ucMGP、炎性因子、肺功能指標比較與COPD穩(wěn)定期組相比, AECOPD組血漿鎖鏈素、Dp-ucMGP水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）, 但炎性因子血清IL-6、TNF-α水平均明顯升高（P＜0.05）, 肺功能指標FEV1%、DLCO均明顯降低（P＜0.05）, 見表3。

表3 不同進展期COPD病人血鎖鏈素、Dp-ucMGP、炎性因子及肺功能指標比較水平比較/±s

表3 不同進展期COPD病人血鎖鏈素、Dp-ucMGP、炎性因子及肺功能指標比較水平比較/±s

注：COPD為慢性阻塞性肺疾病, Dp-ucMGP為非活性基質(zhì)Gla蛋白, IL-6為白細胞介素-6, TNF-α為腫瘤壞死因子-α, FEV1%為第1秒用力呼氣容積占預計值百分比, DLCO為一氧化氮彌散量, AECOPD為慢性阻塞性肺疾病急性加重期。

組別AECOPD組COPD穩(wěn)定期組t值P值例數(shù)30 30鎖鏈素/（μg/L）2.97±0.99 3.08±0.94 0.44 0.664 Dp-ucMGP/（μg/L）11.35±1.50 11.14±1.42 0.55 0.583 IL-6/（ng/L）4.45±2.13 3.48±1.56 2.01 0.049 TNF-α/（ng/L）8.01±2.65 4.38±2.56 5.39＜0.001 FEV1%/%49.17±13.99 57.72±17.77 2.07 0.043 DLCO/mmol·min-1·kPa-1 3.80±0.97 4.82±1.37 3.31 0.002

2.3 不同風險組COPD病人鎖鏈素、Dp-ucMGP、炎性因子、肺功能指標比較與COPD低風險組相比, COPD高風險組血漿鎖鏈素、Dp-ucMGP、IL-6水平均明顯升高（P＜0.05）, 肺功能指標FEV1%、DLCO均明顯降低（P＜0.05）, 見表4。

表4 不同風險組COPD病人血鎖鏈素、Dp-ucMGP、炎性因子及肺功能指標比較水平比較

2.4 COPD病人血漿鎖鏈素、Dp-ucMGP水平與炎性因子及肺功能指標的相關(guān)性COPD病人血漿鎖鏈素、Dp-ucMGP水平與炎性因子血清IL-6、TNF-α均呈明顯正相關(guān)（均P＜0.05）；與肺功能指標FEV1%、DLCO均 呈 顯 著 負 相 關(guān)（均P＜0.05）, 見表5。

表5 COPD病人血漿鎖鏈素、Dp-ucMGP水平與炎性因子及肺功能指標的相關(guān)性（r,P值）

2.5 COPD病人血漿鎖鏈素、Dp-ucMGP水平之間的相關(guān)性COPD病人血漿鎖鏈素水平與Dp-uc-MGP水平呈顯著正相關(guān)（r=0.76,P＜0.001）。

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn), 彈性蛋白與COPD發(fā)病密切相關(guān), 在COPD的發(fā)病過程中常伴隨異常的彈性蛋白降解和修復[9］。正常情況下, 分解人肺組織的彈性蛋白酶和抗彈性蛋白酶抑制劑之間處于動態(tài)平衡狀態(tài), 從而維持肺組織的正常結(jié)構(gòu)不被破壞[10］。當慢性炎癥、吸煙、空氣污染等刺激使蛋白酶-抗蛋白酶失衡時, 蛋白酶水解肺彈性蛋白增加, 導致彈性蛋白降解加速及肺氣腫。

鎖鏈素是纖維狀彈性蛋白的水解產(chǎn)物, 由4個賴氨酸的側(cè)鏈交聯(lián)而成, 是交聯(lián)彈性蛋白纖維特有的氨基酸, 只存在于哺乳動物的彈性蛋白中。鎖鏈素作為成熟彈性蛋白的主要成分, 在肺組織中分布極為豐富。當肺內(nèi)蛋白酶-抗蛋白酶失衡導致肺組織結(jié)構(gòu)破壞時, 彈性蛋白降解增加, 釋放鎖鏈素也會增加。釋放出的游離鎖鏈素結(jié)構(gòu)穩(wěn)定, 不參與機體的分解代謝, 因此可作為肺損傷破壞的生化指標。既往研究表明, COPD病人體液中鎖鏈素水平由高到低依次是：急性加重期、穩(wěn)定期、健康對照組[11］。Huang等[12］發(fā)現(xiàn)部分穩(wěn)定期和急性加重期COPD病人血液中的鎖鏈素水平高于健康對照組, 但穩(wěn)定期和急性加重期病人血液中的鎖鏈素水平無顯著差別。柳威等[13］則發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定期COPD組誘導痰鎖鏈素水平明顯高于健康對照組, 并與FEV1、FVC呈負相關(guān)。Kim等[14］進一步研究證實尿中鎖鏈素水平升高是COPD病人肺氣腫的獨立預測因子, 并與COPD的頻繁加重顯著相關(guān)。Piscaer等[7］也發(fā)現(xiàn)COPD組血漿鎖鏈素水平顯著高于健康對照組, 并與肺功能指標DLCO呈負相關(guān), 但與FEV1、FEV1%等無明顯相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示, COPD組病人血漿鎖鏈素水平明顯高于對照組；而且, COPD高風險組病人血漿鎖鏈素水平明顯高于COPD低風險組病人, 提示血漿鎖鏈素水平可以反映COPD的急性加重風險。但不同進展期COPD病人之間血漿鎖鏈素水平無顯著差別, 這與Huang等[12］研究結(jié)果一致。究原因可能是在AECOPD期間, 彈性蛋白降解速度相對較慢, 短期內(nèi)升高不明顯所致。同時, COPD高風險組IL-6、TNF-α、FEV1%、DLCO較COPD低風險組均顯著下降, 反映該組病人慢性炎癥更重, 肺功能低下。進一步相關(guān)性分析, COPD病人血漿鎖鏈素與炎性因子IL-6、TNF-α均呈顯著正相關(guān), 提示COPD存在的慢性炎癥可促進肺彈性蛋白降解。另外, COPD病人血漿鎖鏈素還與肺功能指標FEV1%、DLCO呈顯著負相關(guān), 提示鎖鏈素與COPD病人肺損傷嚴重程度有關(guān), 可作為評估COPD病情嚴重程度的指標。但是, 血漿鎖鏈素水平與FEV1%、DLCO之間相關(guān)性的研究結(jié)果并非總是一致的, 考慮其原因可能與入組COPD病人嚴重程度不一、研究樣本量偏小有關(guān)。

維生素K又稱凝血維生素, 是一種常見的脂溶性維生素, 具有止血、控制細胞生長及凋亡、抗炎、抗氧化應激等廣泛作用[15］。已有證據(jù)表明維生素K可通過降低IL-6、TNF-α、C反應蛋白等多種促炎細胞因子的表達來發(fā)揮抗炎作用[16-17］。此外, 維生素K還是γ-谷氨酰羧化酶的輔酶, 可協(xié)助催化蛋白質(zhì)中的谷氨酸殘基生成γ-羧化谷氨酸[3］。MGP是一種14 kDa的分泌型小分子蛋白, 可表達于心、肺、腎、皮膚和動脈血管壁等多種組織中。研究發(fā)現(xiàn), MGP是維生素K依賴的軟組織鈣化抑制劑[18］。維生素K可促使MGP的5個谷氨酸殘基轉(zhuǎn)化為帶負電荷的Gla, 產(chǎn)生鈣結(jié)合位點, 進而發(fā)揮抑制組織彈性蛋白鈣化、降解的作用[4,19］。Piscaer等[7］研究發(fā)現(xiàn)與對照組相比, COPD病人血漿維生素K水平顯著降低, 且其與彈性蛋白降解指標鎖鏈素呈負相關(guān), 提示維生素K在COPD的發(fā)病中可能起一定作用。在另一項關(guān)于深綠色蔬菜和肺氣腫風險之間聯(lián)系的研究中, Shen等[8］發(fā)現(xiàn)維生素K攝入量與肺氣腫的發(fā)生呈負相關(guān)；與攝入低于推薦劑量維生素K的人群相比, 攝入推薦劑量維生素K可使患肺氣腫的概率降低39%。最近, Dofferhoff等[20］也發(fā)現(xiàn)新冠肺炎病人預后不良與其血漿維生素K缺乏相關(guān)。他們認為肺炎引起的血漿維生素K耗竭可導致MGP的激活受損, 這是重癥肺炎彈性纖維損傷加速的主要機制。

本研究結(jié)果顯示, COPD組病人血漿Dp-ucMGP水平明顯高于對照組, 即COPD病人血漿維生素K水平明顯低于對照組。推測其原因可能與COPD病人維生素K攝入不足、慢性炎癥消耗和維生素K循環(huán)個體差異相關(guān)[19］。而且, COPD高風險組病人血漿Dp-ucMGP水平明顯高于COPD低風險組病人, 提示血漿Dp-ucMGP水平可以反映COPD的急性加重風險。相關(guān)性分析顯示COPD病人血漿Dp-ucMGP水平與炎性因子IL-6、TNF-α正相關(guān), 這可能與維生素K抗炎作用的發(fā)揮相關(guān)。此外, COPD病人血漿Dp-ucMGP水平與肺功能指標FEV1%、DLCO呈顯著負相關(guān), 提示Dp-ucMGP也與COPD病人肺損傷嚴重程度有關(guān)。COPD病人血漿Dp-ucMGP水平還與鎖鏈素呈顯著正相關(guān), 即血漿維生素K與鎖鏈素呈顯著負相關(guān), 表明維生素K缺乏在COPD發(fā)病中的起一定作用, 其機制可能與促進肺彈性蛋白降解相關(guān), 這與Piscaer等[7］研究結(jié)果相一致。

綜上所述, COPD病人血漿鎖鏈素和Dp-ucMGP水平明顯升高, 且與炎性因子、肺功能指標呈明顯相關(guān), 可作為評估COPD病情嚴重程度的血漿標志物。由于COPD病人血漿維生素K水平下降, 且與鎖鏈素呈顯著負相關(guān), 推測維生素K可能參與了肺彈性蛋白降解過程, 這或可成為緩解COPD病人病情進展的新思路, 但仍須進一步地補充試驗提供更多證據(jù)。但是, 鎖鏈素在COPD病人中的研究結(jié)果并不統(tǒng)一, 而且目前維生素K和Dp-ucMGP在COPD中的相關(guān)研究較少, 仍有待于大規(guī)模、長期隨訪臨床研究來進一步探索。