鐘紅蘭，竇曉鳳，熊 華，張 忠，彭海龍，史 卿，阮 霞，白春清

(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330047)

葛根，是豆科植物葛的可食性塊根［1］。新鮮葛根的淀粉含量在20%～25%［2］，葛根粉是從葛根中提取的淀粉，含有異黃酮類物質(zhì)如黃豆甙、葛根素、葛根醇等［3］。葛根異黃酮具有抗氧化、抑菌、抗癌、降血糖、降血脂等作用［4-6］。葛根淀粉在冷水中不溶，熱水中溶脹，熟淀粉糊黏度大，沖調(diào)性差，其應(yīng)用受到一定的限制［7］。α-淀粉酶，主要作用于淀粉分子中的α-1，4-葡萄糖苷鍵，將淀粉切分成糊精及少量低分子糖，能降低淀粉糊的黏度［8］。酶法處理手段溫和，能較高程度地保留葛根粉功能性成分，用α-淀粉酶對(duì)葛根粉酶解處理可以獲得很好的沖調(diào)效果，便于后續(xù)加工和食用。α-淀粉酶按作用溫度分為低溫、中溫和高溫α-淀粉酶。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，選用中溫α-淀粉酶進(jìn)行酶解，采用超聲波輔助酶解，可以達(dá)到能耗少、酶用量低的目的。本研究繼而在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面分析法優(yōu)化酶解工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葛根粉 市售;中溫α-淀粉酶 4000U/g，山東隆大生物工程有限公司;3，5-二硝基水楊酸、氯化鈣等化學(xué)試劑 均為分析純。

BS 224S型電子天平 北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;SK2210HP型超聲波清洗器 上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司;PHS-3C型精密pH計(jì) 上海雷磁新涇儀器有限公司;UV-2450型紫外分光光度計(jì)日本島津公司;BM-FG103型手持糖量折光儀 上?？德穬x器設(shè)備有限公司;FD-1型冷凍干燥機(jī) 北京德天佑科技發(fā)展有限公司;Quanta200F型環(huán)境掃描電子顯微鏡 荷蘭FEI公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葛根粉超聲輔助酶解工藝 稱取葛根粉→調(diào)漿→加氯化鈣→調(diào)節(jié)pH→水浴控溫→酶解→超聲→繼續(xù)酶解→滅酶→冷卻→得酶解液

1.2.2 超聲輔助處理?xiàng)l件的確定 在60℃下，控制pH在6.0～6.5，固形物濃度(即葛根粉質(zhì)量濃度) 20%，中溫 α-淀粉酶添加量為 0.5%，酶解時(shí)間15m in，采用單因素實(shí)驗(yàn)法研究超聲功率及超聲時(shí)間對(duì)葛根粉酶解液DE值的影響。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 根據(jù)1.2.2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇合適的超聲功率和時(shí)間，以DE值為指標(biāo)，利用單因素法依次探究固形物濃度、酶解時(shí)間、酶添加量以及溫度對(duì)DE值的影響。

1.2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)確定酶解工藝的參數(shù)范圍，設(shè)計(jì)以固形物濃度、酶解時(shí)間及酶添加量為因子的3因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，建立模型以預(yù)測(cè)結(jié)果，并做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平Table1 Factors and levels of response surface experiments

1.2.5 考察指標(biāo)的測(cè)定 DE(Dextrose Equivalent，葡萄糖當(dāng)量)值:還原糖(以葡萄糖計(jì))占總固形物的百分比［9］，反映淀粉的水解程度。還原糖含量的測(cè)定采用DNS比色法［10］。

1.2.6 葛根粉微觀形態(tài)觀察 采用掃描電鏡(SEM)法。

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲輔助處理?xiàng)l件的確定

2.1.1 超聲功率對(duì)DE值的影響 固定超聲時(shí)間為10m in，超聲結(jié)束后繼續(xù)酶解5m in(總的酶解時(shí)間為15m in)，加1mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH至4.77，并將酶解液于沸水浴中保溫5m in以達(dá)到滅酶的效果［11］?？疾斐暪β?0～100W對(duì)葛根粉酶解液DE值的影響。結(jié)果如圖1所示。

圖1 超聲功率對(duì)DE值的影響Fig.1 Influence of ultrasonic power on DE value

由圖1可見(jiàn)，在本實(shí)驗(yàn)研究范圍內(nèi)，超聲功率的增大有助于葛根粉的水解，且超聲功率為100W時(shí)，葛根粉酶解液DE值最大，從儀器的保養(yǎng)上考慮，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇在90W的超聲功率條件下進(jìn)行。

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)DE值的影響 在90W功率條件下超聲，酶解15min，考察超聲時(shí)間對(duì)葛根粉酶解液DE值的影響。結(jié)果如圖2所示。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)DE值的影響Fig.2 Influence of ultrasonic time on DE value

由圖2可知，采用了超聲處理的葛根粉水解程度明顯高于未經(jīng)超聲處理組(超聲時(shí)間為0)，超聲時(shí)間低于10m in時(shí)，葛根粉水解程度與超聲時(shí)間呈正相關(guān)，10m in時(shí)，DE值達(dá)最大，超過(guò)10m in后，DE值略微減小，原因可能是酶活性受到了抑制，這與超聲波作用于酶的復(fù)雜機(jī)制有關(guān)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)的超聲時(shí)間選擇10min。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 固形物濃度對(duì)DE值的影響 在60℃下，pH在6.0～6.5，中溫 α-淀粉酶添加量為0.5%，酶解15m in(90W超聲功率下超聲10m in)，考察固形物濃度對(duì)DE值的影響。

圖3 固形物濃度對(duì)DE值的影響Fig.3 Influence of solids concentration on DE value

從圖3可以看出，固形物濃度在15%～30%范圍內(nèi)，隨固形物濃度的增大，葛根粉酶解液DE值逐漸增大，當(dāng)固形物濃度超過(guò)30%以后，DE值有小幅度下降，可能是底物濃度過(guò)大，阻礙了酶與底物的充分接觸，導(dǎo)致DE值的減小。

2.2.2 酶解時(shí)間對(duì)DE值的影響 在60℃下，pH在6.0～6.5，固形物濃度為20%，中溫α-淀粉酶添加量為0.5%，超聲輔助時(shí)間都為10m in，分別測(cè)定不同總酶解時(shí)間(包括超聲時(shí)間)下的酶解液DE值，考察酶解總時(shí)間對(duì)DE值的影響。

由圖4可知，反應(yīng)初始階段，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，DE值迅速增大。反應(yīng)進(jìn)行30m in后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，DE值變化不顯著，表明反應(yīng)已趨于平衡狀態(tài)。

2.2.3 中溫α-淀粉酶添加量對(duì)DE值的影響 在60℃下，pH在6.0～6.5，固形物濃度為20%，酶解15m in(90W超聲功率下超聲10m in)，考察中溫α-淀粉酶添加量對(duì)DE值的影響。

圖4 酶解總時(shí)間對(duì)DE值的影響Fig.4 Influence of hydrolysis time on DE value

圖5 中溫α-淀粉酶添加量對(duì)DE值的影響Fig.5 Influence of the amount of enzyme on DE value

由圖5可知，酶添加量在0.2%～0.8%范圍內(nèi)，葛根粉酶解液的DE值隨中溫α-淀粉酶的增加而明顯增大，但酶添加量大于0.8%時(shí)，DE值變化不大。將酶添加量控制在一定水平內(nèi)，有利于節(jié)約成本。

2.2.4 酶解溫度對(duì)DE值的影響 pH在6.0～6.5，固形物濃度為20%，中溫α-淀粉酶添加量為0.5%，酶解15min(90W超聲功率下超聲10min)，考察酶解溫度對(duì)DE值的影響。

從圖6中可以看出，在45～60℃范圍內(nèi)，DE值隨反應(yīng)溫度的升高而增大，60℃時(shí)達(dá)最大(11.63%)，溫度高于60℃后，DE值呈緩慢下降的趨勢(shì)。說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所用中溫α-淀粉酶的最適作用溫度為60℃，低于或高于此溫度，將會(huì)影響酶反應(yīng)效果。

圖6 酶解溫度對(duì)DE值的影響Fig.6 Influence of hydrolysis temperature on DE value

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)原理，綜合單因素結(jié)果，選擇60℃為反應(yīng)溫度，以DE值為響應(yīng)值，固形物濃度、酶解時(shí)間及酶添加量為影響因子，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Results of response surface experiments

2.3.1 響應(yīng)面分析與模型的建立 利用軟件(SAS9.1.3)對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析，得到因子X(jué)1(固形物濃度)、X2(酶解時(shí)間)、X3(酶添加量)與響應(yīng)值Y(DE值)間的關(guān)系方程:

對(duì)上述模型進(jìn)行方差分析及顯著性評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，所建回歸模型的水平為差異極顯著(p＜0.01)，且失擬項(xiàng)不顯著(p=0.487827);模型的決定系數(shù)R2為98.62%，表明該回歸模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合性較好，能夠解釋DE值的變化，可用于預(yù)測(cè)實(shí)際情況。在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，各影響因子對(duì)Y值的響應(yīng)程度為:X3＞X2＞X1，即:酶添加量＞酶解時(shí)間＞固形物濃度。

根據(jù)回歸方程，將一個(gè)影響因子固定在其中心水平(Xn=0)，得到其它兩個(gè)因子交互作用的響應(yīng)曲面，見(jiàn)圖7～圖9。

響應(yīng)曲面圖表明，實(shí)驗(yàn)中各因子間的交互作用不明顯，尤其是酶解時(shí)間與固形物濃度間的交互作用最弱;酶添加量對(duì)DE值的影響最大，其次是酶解時(shí)間，固形物濃度對(duì)DE值的影響最小，與方差分析的結(jié)果一致。

2.3.2 最佳酶解條件的確定及驗(yàn)證 利用軟件求得回歸方程的最優(yōu)解，對(duì)應(yīng)的各編碼值為:X1=-0.07950、X2=0.39512、X3=1.30065，此時(shí) Y= 19.19%，即最佳酶解條件為固形物濃度29.6%、酶解時(shí)間32min、酶添加量1.19%，此時(shí)模型預(yù)測(cè) DE值為19.19%。

為進(jìn)一步驗(yàn)證回歸模型的有效性，以優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，測(cè)得平均DE值為19.13%，接近于預(yù)測(cè)值，表明模型可靠，預(yù)測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。

表3 回歸模型方差分析及顯著性檢驗(yàn)Table3 Variance analysis results of regressionmodel

圖7 酶添加量與酶解時(shí)間對(duì)DE值影響的響應(yīng)曲面圖Fig.7 Response surface of the amount of enzyme and hydrolysis time on DE value

圖8 酶添加量與固形物濃度對(duì)DE值影響的響應(yīng)曲面圖Fig.8 Response surface of the amount of enzyme and solids concentration on DE value

2.4 葛根粉酶解前后的微觀形態(tài)觀察

圖10、圖11分別為原料葛根粉、冷凍干燥后的葛根粉酶解物的掃描電鏡(SEM)圖。

由圖10和圖11可見(jiàn)，原葛根粉顆粒呈外表面光滑、致密的多角形結(jié)構(gòu)，而經(jīng)凍干的酶解物顆粒外表面不光滑，呈疏松的不規(guī)則片狀結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明由于α-淀粉酶的作用，葛根淀粉顆粒崩解，表面積增大，變得疏松、易于溶解。

圖9 酶解時(shí)間與固形物濃度對(duì)DE值影響的響應(yīng)曲面圖Fig.9 Response surface of hydrolysis time and solids concentration on DE value

圖10 葛根粉SEM圖(×3000)Fig.1 0 SEM image of Kudzu root starch(×3000)

3 結(jié)論

利用超聲進(jìn)行輔助酶解葛根粉，明顯的提高了酶解效率。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果及實(shí)際操作情況，確定了超聲條件，即超聲功率為90W、超聲時(shí)間為10m in。以單因素實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化葛根粉酶解工藝，對(duì)其結(jié)果進(jìn)行分析，得到了可靠的數(shù)學(xué)模型。方差分析表明，選取的3個(gè)影響因子中酶解時(shí)間和中溫α-淀粉酶添加量對(duì)DE值影響極為顯著，固形物濃度的影響不顯著。最終確定的最優(yōu)酶解條件為:固形物濃度29.6%，酶解時(shí)間32m in，酶添加量1.19%。模型預(yù)測(cè)該條件下的酶解液DE值為19.19%，實(shí)測(cè)DE值為19.13%，模型可靠性得到驗(yàn)證。對(duì)葛根粉酶解前后的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察，結(jié)果表明，未經(jīng)酶解的葛根粉顆粒為表面光滑、致密的多角形結(jié)構(gòu)，而其酶解物呈疏松的不規(guī)則片狀結(jié)構(gòu)，葛根粉顆粒酶解后變得疏松、易于溶解。

圖11 葛根粉酶解物SEM圖(×200)Fig.1 1 SEM image of Kudzu root starch after hydrolysis(×200)

［1］Keung W M，Vallee B L.Kudzu root:an ancient Chinese source ofmodern antidipsotropic agents［J］.Phytochemistry，1998，47(4):499-506.

［2］張鵬斐，吳衛(wèi)國(guó)，傅冬和，等.葛根酒的開(kāi)發(fā)［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38(2):117-121.

［3］熊漢國(guó)，張家年.葛根淀粉的酶法水解研究［J］.淀粉與淀粉糖，2000(2):16-19.

［4］崔蘇鎮(zhèn)，彭學(xué)蓮.葛根的藥理作用研究概況［J］.時(shí)珍國(guó)藥研究，1998，9(3):246-247.

［5］張東華，董強(qiáng)波，彭曙光.葛根的化學(xué)成分、藥理作用和臨床應(yīng)用研究［J］.首都醫(yī)藥，2007(12):44-45.

［6］張雁，張孝祺.葛根的營(yíng)養(yǎng)保健功能及開(kāi)發(fā)利用［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2000，21(2):37-39.

［7］張晶晶，陳敏青，金立斌，等.葛根淀粉的研究進(jìn)展［J］.廣西輕工業(yè)，2010(2):4-5.

［8］郭勝偉，蔡寶昌.淀粉酶對(duì)蘆薈葉漿粘性物質(zhì)水解條件研究［J］.食品工業(yè)科技，2000，21(5):26-27.

［9］唐書(shū)澤，李福謙，張志森.葡萄糖當(dāng)量及聚合度與麥芽糊精的性質(zhì)［J］.食品與機(jī)械，2007，23(3):175-177.

［10］楊貴明，蔣愛(ài)華，薛秋生.用DNS光度法測(cè)定還原糖條件的研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34(14):3258-3264.

［11］楊柳新，徐以撒.淀粉液化液滅酶方法的研究［J］.江蘇石油化工學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，14(3):22-24.