●田 芳 金 麗 李 賓（鄭州市農(nóng)林科學(xué)研究所 河南 鄭州 450007）

羊肚菌是一種珍稀的食用菌，隸屬于子囊菌亞門，因形似羊肚而得名。羊肚菌具有高蛋白、低熱量的特征，兼具保健功能，深受大眾的喜愛。自從2012年羊肚菌在我國開始規(guī)模化的人工栽培，種植面積和規(guī)模逐年增加。菌種質(zhì)量的好壞直接決定著羊肚菌最終的產(chǎn)量和品質(zhì)，菌種的退化會直接造成羊肚菌的減產(chǎn)甚至絕收，因此研究菌絲老化現(xiàn)象對羊肚菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展至關(guān)重要。目前，關(guān)于羊肚菌繼代培養(yǎng)與菌絲老化關(guān)系的研究較少，結(jié)果也不相同。劉偉等[1]研究表明，10個高羊肚菌菌株在繼代培養(yǎng)中，菌絲老化啟動階段，生長速度無明顯變化，只是形態(tài)上主菌絲會變的稀疏；老化死亡階段，生長速度急劇下降，菌絲邊緣變的不整齊。錢可晴等[2]研究發(fā)現(xiàn)，梯棱羊肚菌在繼代培養(yǎng)中生長速度呈逐漸下降趨勢，第15代菌絲停止發(fā)育。劉璐[3]發(fā)現(xiàn)“六妹”羊肚菌的生長速度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在第8代時達(dá)到峰值。由此推測，不同品種、同一品種不同菌株的羊肚菌，其衰老特性不同，因此進(jìn)一步研究不同菌株的衰老特性很有必要。

老化是一種自然現(xiàn)象，在生物界普遍存在，目前對真菌的老化，并沒有統(tǒng)一明確的理論解釋，支持較多的是與自由基的積累、線粒體DNA受損相關(guān)，其過程受到細(xì)胞質(zhì)遺傳因子的調(diào)控[3-4]。但羊肚菌作為微生物界更為低等的子囊菌，菌絲更容易老化，其老化現(xiàn)象也更為普遍，老化會造成菌絲活力下降甚至停止發(fā)育。然而，在生產(chǎn)中，通過繼代培養(yǎng)擴繁菌種的現(xiàn)象較為普遍。另外，在菌種的低溫保藏過程中，試管也需要定期進(jìn)行一次繼代，以保持菌種的活力。何培新[4]認(rèn)為，連續(xù)繼代培養(yǎng)20代以上仍未出現(xiàn)明顯老化的菌株，才能作為潛在的優(yōu)良菌種，菌種老化程度與羊肚菌的最終產(chǎn)量呈負(fù)相關(guān)，“六妹”羊肚菌在繼代培養(yǎng)的第2代，梯棱羊肚在第6代，栽培產(chǎn)量下降50%[3，5-6]。因此，播種前最好對菌種的活力進(jìn)行測定，確保菌種質(zhì)量較佳。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株所有菌株均為鄭州市農(nóng)林科學(xué)研究所在河南和新疆試驗基地經(jīng)過3～5年馴化后篩選所得的優(yōu)良菌株。代號中的“7”代表“七妹”羊肚菌，“6”代表“六妹”羊肚菌，2018LM代表2018年四川引種后連續(xù)種植4年后篩選的優(yōu)良菌株。融合種是由引自榆林的“七妹”和引自四川的“六妹”通過原生質(zhì)體制備、再生后篩選得到的改良菌株。701M1和701M4為分離同一菌株子實體得到的不同組織塊，其他均來自不同羊肚菌菌株的子實體（表1）。

表1 供試菌株的代號及引種地統(tǒng)計

1.1.2 供試培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，瓊脂22 g，葡萄糖20 g，加水至1000 mL，pH自然。121℃高壓滅菌20 min，冷卻至50℃下，在超凈臺中倒入9 cm平板即可。

1.2 方法

1.2.1 母種的獲得采用干菇組織分離的方法獲得。待子實體生長至七八成熟，菌蓋上的褶還未完全展開即可采集所需菌株，選取形態(tài)好、肉厚、菌柄白、無病害的羊肚菌子實體帶回實驗室陰干，做好菌株標(biāo)記。在紫外消殺后的超凈工作臺中，先用手術(shù)刀從子實體的菌蓋和菌柄交接處切下1 cm×1 cm大小的組織塊，放置于10 mL無菌離心管中，加入無菌水浸泡5 min左右，組織塊膨大變軟即可，倒掉廢液，無菌水沖洗一次，將組織塊取出置于裝有75%乙醇的10 mL無菌離心管中，準(zhǔn)確計時消毒15 s，迅速用鑷子將組織塊取出置于新的無菌水中浸泡，反復(fù)沖洗3次，隨后取出組織塊置于無菌濾紙上，吸干水分。最后在無菌濾紙上用無菌解剖刀切掉組織塊邊緣，分成0.5 cm×0.5 cm大小的塊，放置在PDA平板上22℃黑暗培養(yǎng)2～3 d，至菌絲萌發(fā)至直徑3～5 cm即可進(jìn)行純化獲得母種。

1.2.2 繼代培養(yǎng)用直徑5 mm的打孔器在萌發(fā)的菌絲邊緣進(jìn)行打孔，然后用接種鉤轉(zhuǎn)接到新的PDA平板中，待菌絲長滿后將平板4℃保存，即為母種，這里稱作第一代菌株，標(biāo)記為D1。取其中的一個D1平板，在菌絲長滿平板之前，沿著菌絲生長方向的最前端，用直徑5 mm的打孔器取打孔，然后挑取組織塊放置于新的平板一端，組織塊要按照菌絲生長的方向放置，最后將平板置于22℃黑暗條件下培養(yǎng)，得到的菌株即為D2。按照以上方法，進(jìn)行后續(xù)的繼代培養(yǎng)，直至菌絲死亡，每一次轉(zhuǎn)接即為新的一代，轉(zhuǎn)接要在菌絲長滿平板前進(jìn)行。

1.2.3 不同代數(shù)生長速度的測定每隔24 h，以接種的組織塊生長邊緣為起點，用刻度尺選取3個不同方向，測量菌落的半徑，3次的平均值即為菌落半徑，并做好數(shù)據(jù)統(tǒng)記。生長速度（mm/h）=菌落半徑（mm）/時間（h）。同時要注意，每次測量都要在菌絲長滿平板之前進(jìn)行。

1.2.4 菌落的形態(tài)觀察組織塊轉(zhuǎn)接到新的PDA平板后，每天做好菌絲濃密度、粗壯度及整齊度的記錄，并對10個不同菌株的繼代培養(yǎng)菌絲長勢進(jìn)行打分。最后將每個菌株所有代數(shù)的長勢得分相加，除以代數(shù)得到平均值，數(shù)值越高，說明菌絲長勢越濃密、越粗壯、邊緣越整齊。菌絲濃密度分為4個等級：稀疏記0分，較稀疏記1分，較濃密記2分，濃密記3分；菌絲粗壯度分為4個等級：纖細(xì)記0分，較纖細(xì)記1分，較粗壯記2分，粗壯記3分；整齊度分為4個等級：不整齊記0分，較不整齊記1分，較整齊記2分，整齊記3分。同時，菌株的色素產(chǎn)生情況也要及時做好記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株的繼代培養(yǎng)生長速度測定

從圖1可以看出，10個菌株繼代培養(yǎng)的生長速度均不相同。其中701M1、601M1、601M6、2018LM菌株的生長速度最快，701M4、701M5、72M11菌株的生長速度次之，701M6、73M1、XZ菌株的生長速度最慢。隨著連續(xù)培養(yǎng)代數(shù)的增加，菌絲生長速度呈緩緩下降的趨勢，出現(xiàn)小范圍升降波動屬于正?，F(xiàn)象。在培養(yǎng)30代之前，10個菌株均能在4 d內(nèi)長滿平板。30代以后，10個菌株的菌絲生長速度均出現(xiàn)急劇下降，菌絲迅速老化死亡。這與劉偉等[1]報道的高羊肚菌在老化啟動階段其菌絲生長速度與旺盛期無明顯變化一致。另外，從生長速度急劇下降的時間來看，2018LM在31代菌絲停止生長，73M1的老化死亡發(fā)生最晚，在43代出現(xiàn)。比較而言，“六妹”羊肚菌的老化死亡時間要早于“七妹”羊肚菌和“六妹”與“七妹”融合種，融合種的老化性狀更接近于“七妹”羊肚菌，“七妹”羊肚菌最不容易老化。

圖1 10個菌株的繼代培養(yǎng)生長曲線

2.2 菌落的形態(tài)觀察

從表2可以看出，根據(jù)統(tǒng)計的長勢得分值，72M11的菌絲整齊度、菌絲濃密度和粗壯度均為最佳，其次是73M1菌株，701M1、701M5和701M6的菌絲也都較整齊、濃密和粗壯，XZ、2018LM1的菌絲整齊度、濃密度和粗壯度最差。同時，連續(xù)培養(yǎng)10代以后，所有菌株均出現(xiàn)菌絲邊緣的整齊度下降，主菌絲變纖細(xì)且稀疏，次生菌絲減少，逐漸呈現(xiàn)出老化的現(xiàn)象，推測可能菌絲生長已經(jīng)進(jìn)入老化啟動階段。另外，分離自同一個菌株子實體的菌絲長勢701M1要優(yōu)于701M4菌株，說明菌絲長勢具有個體差異性。

表2 10個菌株在繼代培養(yǎng)中的菌絲長勢統(tǒng)計 單位：分

另外，本試驗發(fā)現(xiàn)在繼代培養(yǎng)過程中，第2代的701M4、701M6、72M11、73M1、701M5在培養(yǎng)后7 d產(chǎn)生黃褐色的色素，2018LM在培養(yǎng)后10 d產(chǎn)生黃褐色的色素，601M6在培養(yǎng)后14 d產(chǎn)生色素，601M1、XZ、701M1這3個菌株一直未形成色素。培養(yǎng)至第10代時，701M4、701M6、72M11、73M1、701M5于5 d左 右 產(chǎn) 生 色 素，2018LM于7 d左右產(chǎn)生色素，601M6于10 d左右產(chǎn)生色素，601M1、XZ、701M1這3個菌株依然未形成色素，701M5和72M11產(chǎn)生氣生菌絲較多。從這里看，隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加，色素產(chǎn)生提前，“六妹”產(chǎn)生色素的時間要晚于“七妹”，但是從生長速度來看，“六妹”的老化卻早于“七妹”，推測色素產(chǎn)生和菌株的老化存在一定的關(guān)系，但是否有必然的關(guān)系，還需要更進(jìn)一步的數(shù)據(jù)支持。

3 結(jié)論與討論

菌種的老化會直接影響羊肚菌的產(chǎn)量和品質(zhì)。在羊肚菌生產(chǎn)中，通過繼代培養(yǎng)擴繁母種的現(xiàn)象較為普遍，實驗室也經(jīng)常采用繼代培養(yǎng)的方式進(jìn)行菌種保藏，因此研究繼代培養(yǎng)對菌絲老化的影響意義重大。本試驗中，10個菌株的羊肚菌在繼代培養(yǎng)過程中，均在不同時間出現(xiàn)老化現(xiàn)象，生長速度急劇下降，菌絲變得稀疏、纖細(xì)、邊緣出現(xiàn)參差不齊，色素產(chǎn)生時間提前。其中，“六妹”羊肚菌2018LM、601M1、601M6的生長速度相對更快，產(chǎn)生色素的時間也晚于“七妹”羊肚菌和融合種，但是菌絲整齊度不如“七妹”羊肚菌，老化時間也比“七妹”羊肚菌和融合種提前，“七妹”羊肚菌的老化死亡時間最晚。從這里看，色素產(chǎn)生提前是菌株進(jìn)入老化階段的一個指標(biāo)，但產(chǎn)生時間的早晚不能直接決定哪個菌株先老化，它們之間不存在正相關(guān)關(guān)系。相較于錢可晴等[2]報道的15代即老化死亡，本研究中的10個試驗菌株均能在30代前保持較快的生長速度，作為優(yōu)良菌種，都是有潛力的。考量菌種質(zhì)量好壞的最主要指標(biāo)是老化時間和菌絲長勢，綜合所有試驗數(shù)據(jù)，確定“七妹”羊肚菌品種當(dāng)中72M11和73M1為最佳菌株。下一步將對繼代培養(yǎng)的所有菌株進(jìn)行出菇試驗，并結(jié)合生產(chǎn)試驗，進(jìn)一步驗證最適合推廣的優(yōu)良菌種。