郝雨檬，王彩霞，馬景學(xué)，李雪景，尚慶麗

0 引言

新生血管生成在多種疾病致病中發(fā)揮重要作用，主要包括腫瘤血管、眼底新生血管、冠狀動(dòng)脈斑塊新生血管等[1]。眼底新生血管包括視網(wǎng)膜新生血管(retinal neovascularization，RNV)和脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)常發(fā)生于糖尿病視網(wǎng)膜病變、年齡相關(guān)性黃斑變性、病理性近視等致盲性眼病中，是視力喪失的重要原因。眼底新生血管的發(fā)生機(jī)制尚不明確，與基因異常、缺氧、氧化應(yīng)激、炎癥等因素均相關(guān)，是多種細(xì)胞和因子共同作用的結(jié)果，其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)發(fā)揮關(guān)鍵作用[2-3]。目前臨床主要采用玻璃體腔注射抗VEGF藥物治療RNV和CNV，但存在作用靶點(diǎn)單一、復(fù)發(fā)率高、反復(fù)注射引起纖維瘢痕化和視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)萎縮等問(wèn)題[4]。中藥及中藥單體安全、高效、價(jià)廉、多靶點(diǎn)，可為藥物防治眼底新生血管提供新的思路和方法。莪術(shù)醇(Curcumol)，分子式C15H24O2，倍半萜類，是中藥莪術(shù)的主要活性成分，具有抗腫瘤、抗炎、抗纖維化等多種生物活性，臨床應(yīng)用廣泛，但在新生血管生成中的作用尚不明確[5-6]。人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)是體外常用的內(nèi)皮細(xì)胞模型，也是RNV和CNV體外研究常用的細(xì)胞模型[7-9]。本研究利用HUVECs體外分析莪術(shù)醇對(duì)新生血管生成的抑制作用，為后續(xù)其應(yīng)用于眼底新生血管的治療研究提供理論和技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞HUVECs細(xì)胞購(gòu)自湖北豐輝生物科技有限公司。

1.1.2主要試劑及儀器莪術(shù)醇(HY-N0104，美國(guó)MedChemExpress公司)，VEGF(100-20，美國(guó)PeproTech公司)，DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(以色列 Biological Industries公司)，CCK-8檢測(cè)試劑盒(HY-K0301，美國(guó)MedChemExpress公司)，EdU-594細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(C0078，碧云天生物技術(shù)公司)，Transwell小室(8.0μm，24孔，3422，美國(guó)Corning公司)，Matrigel基質(zhì)膠(356234，美國(guó)Corning公司)，β-actin(20536-1-AP，武漢三鷹生物技術(shù)公司)，Akt(4691)、p-Akt(4060)、S6(2217)和p-S6(4858)抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)。細(xì)胞培養(yǎng)箱、低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)，倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)，激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)Carl Zeiss公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組HUVECs細(xì)胞用含10% FBS和1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合時(shí)，采用0.25%胰酶消化，1∶2傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。莪術(shù)醇用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)配制為400mmol/L儲(chǔ)備液，使用時(shí)用培養(yǎng)基稀釋為相應(yīng)濃度。將細(xì)胞分為對(duì)照組、VEGF組、莪術(shù)醇+VEGF組，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基中分別加入相應(yīng)濃度莪術(shù)醇和/或50ng/mL VEGF，對(duì)照組加入0.1%DMSO。

1.2.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖取1×104/mL細(xì)胞接種于96孔板中，過(guò)夜培養(yǎng)后用無(wú)FBS的培養(yǎng)基饑餓24h，分別用各濃度莪術(shù)醇和VEGF處理24h，各孔更換新鮮培養(yǎng)基，向每孔加入10μL CCK-8溶液，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1h，酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處吸光度。

1.2.3EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖取1×104/mL細(xì)胞接種于96孔板中，過(guò)夜培養(yǎng)后用無(wú)FBS的培養(yǎng)基饑餓24h，分別用各濃度莪術(shù)醇和VEGF處理24h，加入等體積的10mmol/L EdU，繼續(xù)孵育2h；然后用4%多聚甲醛固定，0.3% Triton X-100通透，加入50μL反應(yīng)液，室溫避光孵育30min，Hoechst 33342溶液進(jìn)行細(xì)胞核染色，熒光顯微鏡下觀察并拍照，增殖細(xì)胞(EdU陽(yáng)性)在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)紅色熒光。

1.2.4Transwell遷移實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞遷移用無(wú)FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24h，重懸細(xì)胞為 2×105/mL，加入不同濃度莪術(shù)醇，向Transwell小室的上室加入100μL細(xì)胞懸液，下室加入600μL含10% FBS和/或50ng/mL VEGF的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h；取出小室，加入4%多聚甲醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色細(xì)胞，棉簽擦除小室內(nèi)面未穿過(guò)的細(xì)胞，PBS洗凈，顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)算遷移細(xì)胞數(shù)。

1.2.5管腔形成實(shí)驗(yàn)分析血管生成將Matrigel膠放入4℃冰箱過(guò)夜融化，加入預(yù)冷的48孔板中，每孔100μL，置于37℃培養(yǎng)箱中凝固1h。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成2.5×105/mL的細(xì)胞懸液，各組加入不同濃度的莪術(shù)醇和VEGF處理，各取100μL加入到Matrigel膠的孔板中，培養(yǎng)24h，顯微鏡下觀察管腔形成情況，隨機(jī)選取5個(gè)視野，Image J軟件計(jì)算管腔的分支數(shù)量和長(zhǎng)度。

1.2.6Westernblot分析p-Akt和p-S6表達(dá)收集HUVECs細(xì)胞，提取總蛋白，BCA法測(cè)定樣本蛋白含量。SDS-PAGE分離蛋白，隨后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，分別加入抗p-Akt(1∶1000)、抗p-S6(1∶2000)、抗Akt(1∶2000)、抗S6(1∶2000)和抗β-actin(1∶1000)一抗，4℃孵育過(guò)夜；TBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫作用1h，TBST洗滌3次后加入ECL反應(yīng)液，BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照；Image J軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度分析，通過(guò)分析目的蛋白與內(nèi)參對(duì)照灰度比值計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1各組細(xì)胞增殖能力比較CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組細(xì)胞OD450值總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=18.346，P<0.001)；其中，VEGF組OD450值顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.80，P<0.01)；50、100、200μmol/L莪術(shù)醇+VEGF組OD450值與VEGF組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.49、-0.71、-1.10，均P>0.05)，400、800μmol/L莪術(shù)醇+VEGF組OD450值顯著低于VEGF組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3.49，P<0.01；t=-8.58，P<0.001)，見(jiàn)圖1。但800μmol/L莪術(shù)醇+VEGF組OD450值低于對(duì)照組，可能會(huì)抑制正常細(xì)胞功能，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)僅采用200、400μmol/L莪術(shù)醇處理細(xì)胞。

圖1 CCK-8實(shí)驗(yàn)中各組細(xì)胞OD450值比較 bP<0.01 vs 對(duì)照組；dP<0.01 vs VEGF組。

EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組細(xì)胞增殖率總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=27.814，P<0.001)；其中，VEGF組細(xì)胞增殖率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.11，P<0.001)；200μmol/L莪術(shù)醇+VEGF組細(xì)胞增殖率與VEGF組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-1.41，P>0.05)；400μmol/L莪術(shù)醇+VEGF組細(xì)胞增殖率顯著低于VEGF組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-7.83，P<0.001)，見(jiàn)圖2。

圖2 各組細(xì)胞EdU染色結(jié)果比較 A：各組細(xì)胞EdU染色的熒光顯微鏡像，紅色示EdU染色陽(yáng)性細(xì)胞，藍(lán)色示Hoechst 33342細(xì)胞核染色；B：定量比較各組細(xì)胞增殖率，bP<0.01 vs 對(duì)照組；dP<0.01 vs VEGF組。

2.2各組細(xì)胞遷移率比較Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組細(xì)胞遷移數(shù)總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=49.132，P<0.001)；其中，VEGF組遷移細(xì)胞數(shù)相比對(duì)照組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.65，P<0.001)；200μmol/L莪術(shù)醇+VEGF組細(xì)胞遷移數(shù)與VEGF組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.09，P>0.05)；400μmol/L莪術(shù)醇+VEGF組遷移細(xì)胞數(shù)相比VEGF組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-9.34，P<0.001)，見(jiàn)圖3。

圖3 Transwell實(shí)驗(yàn)中各組細(xì)胞遷移比較 A：各組遷移細(xì)胞的顯微鏡像；B：定量比較各組遷移細(xì)胞數(shù)，bP<0.01 vs 對(duì)照組；dP<0.01 vs VEGF組。

2.3各組細(xì)胞管腔形成能力比較管腔形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組細(xì)胞形成管腔的分支數(shù)量和分支長(zhǎng)度總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=32.585、23.179，均P<0.001)；其中，VEGF組形成管腔的分支數(shù)量和分支長(zhǎng)度高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.23、5.99，均P<0.001)；200μmol/L莪術(shù)醇+VEGF組細(xì)胞形成管腔的分支數(shù)量和分支長(zhǎng)度與VEGF組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.22、-0.57，均P>0.05)；400μmol/L莪術(shù)醇+VEGF組細(xì)胞形成管腔的分支數(shù)量和分支長(zhǎng)度明顯低于VEGF組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-6.97、-6.33，均P<0.001)，見(jiàn)圖4。

圖4 各組細(xì)胞管腔形成情況 A：各組細(xì)胞形成管腔的顯微鏡像；B：定量比較各組細(xì)胞形成管腔的分支數(shù)量；C：定量比較各組細(xì)胞形成管腔的分支長(zhǎng)度。bP<0.01 vs 對(duì)照組；dP<0.01 vs VEGF組。

2.4各組細(xì)胞p-Akt和p-S6表達(dá)水平比較為了分析莪術(shù)醇作用于血管生成的信號(hào)通路機(jī)制，本研究檢測(cè)Akt/mTORC1信號(hào)通路的關(guān)鍵效應(yīng)因子p-Akt(S473)和p-S6(S235/236)的相對(duì)表達(dá)水平。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，各組細(xì)胞Akt和S6相對(duì)表達(dá)水平總體比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.938、4.581，均P>0.05)，p-Akt和p-S6相對(duì)表達(dá)水平總體比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.113、5.407，均P<0.05)；其中，與對(duì)照組相比，VEGF組細(xì)胞p-Akt和p-S6相對(duì)表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.10、-0.78，均P>0.05)，而400μmol/L莪術(shù)醇+VEGF組細(xì)胞p-Akt和p-S6相對(duì)表達(dá)水平較VEGF組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3.45、-2.90，均P<0.05)，見(jiàn)圖5。

圖5 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞p-Akt和p-S6蛋白表達(dá)水平 A：各組細(xì)胞蛋白表達(dá)電泳圖；B：定量比較各組細(xì)胞p-Akt相對(duì)表達(dá)水平，用p-Akt/Akt灰度值比值反映p-Akt相對(duì)表達(dá)水平；C：定量比較各組細(xì)胞p-S6相對(duì)表達(dá)水平，用p-S6/S6灰度值比值反映p-S6相對(duì)表達(dá)水平。aP<0.05 vs VEGF組。

3 討論

目前抗VEGF藥物治療作為RNV和CNV的一線治療方案，雖取得一定療效，但治療的局限性也很明顯：(1)藥物作用靶點(diǎn)單一，作用時(shí)間短，停藥后易復(fù)發(fā)，需要多次注射，有高于50%的患者在持續(xù)抗VEGF治療1a后仍存在活動(dòng)性病灶；(2)反復(fù)注射引起的副作用，尤其是纖維瘢痕化和RPE萎縮，使患者術(shù)后視力恢復(fù)不良；(3)此類藥物價(jià)格昂貴[4，10]。因此，尋找新的治療藥物和方案顯得尤為迫切，安全、高效、價(jià)廉、多靶點(diǎn)的中藥及中藥單體是一個(gè)重要選擇。

莪術(shù)醇是中藥莪術(shù)(蓬莪術(shù)，廣西莪術(shù)和溫郁金等的干燥根莖)的揮發(fā)油中提取的單體，是莪術(shù)油中含量最高的有效成分[5]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，莪術(shù)醇具有較強(qiáng)的抗癌作用，且具有低毒和不引起白細(xì)胞數(shù)量減少等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)臨床多種腫瘤如肝癌、乳腺癌、胃癌和血液系統(tǒng)惡性腫瘤等均有一定的治療作用[11-12]。研究證實(shí)，莪術(shù)醇可靶向并抑制許多異常激活的細(xì)胞生長(zhǎng)或存活相關(guān)的信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡或死亡，如PI3K/Akt/mTOR、Wnt、ERK/NF-κB信號(hào)通路等[13-15]。因此莪術(shù)醇可能通過(guò)抑制多種細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)通路，從而發(fā)揮抑制新生血管形成的功效。目前關(guān)于莪術(shù)醇對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用研究還非常少，南京中醫(yī)藥大學(xué)的研究顯示莪術(shù)醇可抑制肝竇內(nèi)皮細(xì)胞毛細(xì)血管化，是肝纖維化的潛在治療藥物[16-17]。另有研究顯示，莪術(shù)油可以抑制高糖下的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和VEGF表達(dá)，具有抗視網(wǎng)膜新生血管的作用[18]。本研究重點(diǎn)分析了中藥單體莪術(shù)醇對(duì)新生血管生成的抑制作用及機(jī)制，探討其應(yīng)用于眼底新生血管治療的可能性。

內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及管腔形成是血管生成的必經(jīng)過(guò)程，VEGF在這一過(guò)程中起關(guān)鍵作用。既往關(guān)于CNV的研究中，恒河猴脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞RF/6A經(jīng)常作為細(xì)胞模型，但2018年Makin等[19]證實(shí)RF/6A細(xì)胞已不再具有關(guān)鍵的內(nèi)皮細(xì)胞性質(zhì)。目前HUVECs仍是CNV體外研究常用的細(xì)胞模型，同時(shí)在RNV的研究中，HUVECs細(xì)胞模型也應(yīng)用廣泛。本研究采用體外VEGF誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞增殖、遷移及管腔形成，觀察莪術(shù)醇對(duì)上述過(guò)程的影響和機(jī)制，為莪術(shù)醇應(yīng)用于臨床治療眼底新生血管提供體外實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究結(jié)果顯示，莪術(shù)醇可有效抑制HUVECs的增殖、遷移和管腔形成。分析不同濃度莪術(shù)醇的作用效果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)莪術(shù)醇濃度≤200μmol/L時(shí)無(wú)明顯抑制效果，而當(dāng)濃度為400、800μmol/L時(shí)，莪術(shù)醇可以有效抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，但800μmol/L莪術(shù)醇使內(nèi)皮細(xì)胞活性明顯低于未加VEGF的對(duì)照組，可能對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的正常功能造成影響，因此后面的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中未再采用此濃度，400μmol/L莪術(shù)醇可能是更安全且有效的，這為以后動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探索體內(nèi)給藥濃度提供了依據(jù)。

為了探究莪術(shù)醇抑制新生血管生成的分子機(jī)制，本研究檢測(cè)了Akt/mTORC1通路，其是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝、分化的關(guān)鍵信號(hào)通路，Akt磷酸化后可激活mTORC1，S6為mTORC1下游的主要效應(yīng)因子，磷酸化后可促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，同時(shí)p-Akt可調(diào)控細(xì)胞存活和增殖。Akt/mTORC1通路在新生血管生成中發(fā)揮重要作用，在RNV和CNV動(dòng)物模型中，通過(guò)玻璃體腔注射或口服抑制劑阻止Akt/mTORC1活化可顯著抑制新生血管形成[20-21]。此外，研究者也在嘗試將mTOR抑制劑應(yīng)用于年齡相關(guān)性黃斑變性的臨床治療，可通過(guò)其多種藥理作用，包括抗炎、抗增殖、抗遷移和誘導(dǎo)自噬，在改善CNV和保護(hù)RPE方面發(fā)揮顯著功效[22-23]。本研究結(jié)果顯示莪術(shù)醇可以有效抑制內(nèi)皮細(xì)胞中Akt和S6的磷酸化，抑制Akt/mTORC1通路活化，提示莪術(shù)醇抑制血管生成的一個(gè)可能機(jī)制是調(diào)控Akt/mTORC1通路。

本研究證實(shí)，莪術(shù)醇可在體外有效抑制VEGF誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和血管形成，并抑制Akt/mTORC1通路活化，具有抑制新生血管的潛在作用。但本研究只是對(duì)莪術(shù)醇抑制新生血管作用的初步探索，應(yīng)進(jìn)一步在動(dòng)物模型中深入分析莪術(shù)醇對(duì)RNV和CNV形成的作用與機(jī)制及其最佳給藥途徑和劑量、安全性、藥代動(dòng)力學(xué)特征等，為莪術(shù)醇在眼底新生血管疾病中的科學(xué)使用提供更多依據(jù)。