王國棟，趙劍峰，徐星煜，向祥林，沈一葦，何子涵，劉 康，耿 宇

0 引言

視神經(jīng)損傷是臨床上嚴重的致盲因素之一。雖然屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的視神經(jīng)再生困難，但晶狀體損傷后能誘導(dǎo)受損視神經(jīng)軸突出現(xiàn)長時程再生[1]，軸突纖維可以達下丘腦形成有效突觸連接并改善實驗動物視覺電信號傳導(dǎo)[2]。有研究認為，其機制可能為晶狀體蛋白誘導(dǎo)視神經(jīng)節(jié)細胞存活并再生，也有研究認為晶狀體損傷后誘發(fā)眼部局部炎癥在視神經(jīng)再生過程中起到了重要的作用[3-4]，但既往研究均不能完全解釋這種長時程視神經(jīng)再生的機制[1,5]。我們采用視神經(jīng)鉗夾伴晶狀體損傷誘導(dǎo)視神經(jīng)長時程再生的動物模型，對視神經(jīng)損傷區(qū)域進行轉(zhuǎn)錄組測序，篩選出差異性高表達基因，并對篩選的高表達因子進行后期分子生物學(xué)驗證。

1 材料和方法

1.1材料本課題所用的24 只實驗動物均在昆明醫(yī)科大學(xué)動物部購買[許可證號：SCXK(滇)K2019-0002]，均為SPF級SD雄性大鼠，體質(zhì)量為180～200g。所有實驗動物經(jīng)昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會審核通過。

1.2方法將實驗動物24只分為對照組、晶狀體損傷組、視神經(jīng)損傷組、晶狀體損傷聯(lián)合視神經(jīng)損傷組，每組各6只大鼠。

1.2.1建立SD大鼠視神經(jīng)損傷模型6只SD大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(50mg/kg)全身麻醉，麻醉起效后左眼眼部涂0.5%硫酸阿托品凝膠充分散瞳，在眼球外眥部剪開外眥角，暴露部分眼眶脂肪，鈍性分離組織，盡可能暴露眼球后部的視神經(jīng)，在距眼球約0.2～0.5mm處鉗夾視神經(jīng)約10s，5min后檢眼鏡觀察 SD大鼠視網(wǎng)膜，觀察到大鼠視網(wǎng)膜中央動脈恢復(fù)血供[6]。外眥角手術(shù)切口涂紅霉素眼膏每日1次，預(yù)防感染，大鼠在SPF級環(huán)境下飼養(yǎng)。術(shù)后1wk大鼠眼部傷口愈合，無明顯眼部感染跡象。術(shù)后用檢眼鏡檢查眼底，排除視網(wǎng)膜血管損傷的SD大鼠。6只大鼠均建模成功，適用于后續(xù)實驗研究。

1.2.2建立大鼠外傷性白內(nèi)障模型6只SD大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(50mg/kg)全身麻醉，麻醉起效后左眼眼部涂0.5%硫酸阿托品凝膠充分散瞳，暴露晶狀體，在大鼠角鞏膜緣用30G胰島素針頭水平刺入眼內(nèi)，將晶狀體囊膜徹底破壞，術(shù)中可見部分晶狀體皮質(zhì)外溢。術(shù)后SD大鼠眼部連續(xù)涂紅霉素眼膏3d，每日1次，預(yù)防感染。術(shù)后1wk大鼠眼部傷口愈合，無明顯感染跡象，在裂隙燈顯微鏡下可見明顯的晶狀體白色混濁，晶狀體損傷模型建模成功。6只大鼠均建模成功，適用于后續(xù)實驗研究。

1.2.3建立晶狀體損傷聯(lián)合視神經(jīng)損傷模型6只SD大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(50mg/kg)全身麻醉，麻醉起效后左眼眼部涂0.5%硫酸阿托品凝膠充分散瞳，按照1.2.1和1.2.2方法建立晶狀體損傷和視神經(jīng)損傷模型，建模成功標準同上，6只大鼠均建模成功，適用于后續(xù)實驗研究。

1.2.4對照組6只SD大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(50mg/kg)全身麻醉，麻醉起效后右眼眼部涂0.5%硫酸阿托品凝膠充分散瞳，僅開放眼眶暴露視神經(jīng)，術(shù)后處理同前。術(shù)后術(shù)眼無感染的大鼠適用于后續(xù)實驗研究。6只大鼠均納入后續(xù)實驗研究。

1.2.5轉(zhuǎn)錄組測序

1.2.5.1RNA提取鑒定和文庫制備建模成功后14d，視神經(jīng)損傷組取視神經(jīng)損傷區(qū)的組織為標本，對照組和晶狀體損傷組取距眼球約0.2～0.5mm的視神經(jīng)組織，提取總RNA后，在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測RNA降解和污染情況。使用Qubit?2.0熒光光度計中的Qubit?RNA分析試劑盒、NanoPhotometer?分光光度計和生物分析儀2100系統(tǒng)的RNA Nano 6000 Assay Kit評估濃度、純度、完整性。

每個測序樣本的RNA總量為3μg，使用NEB Next UltraTM RNA Library Prep Kit for Illumina?生成基因文庫測序，并將索引代碼添加到每個組別不同樣本的屬性行列中，即用聚T寡聚糖連接的磁珠從總RNA中提取mRNA。在NEBNext(5×)第一鏈合成反應(yīng)緩沖液中，用二價陽離子在升溫條件下對mRNA進行裂解。使用MMuLV逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機六聚體引物合成第一鏈cDNA。使用RNA酶H和DNA聚合酶I進行第二鏈cDNA的合成，剩余的突出物通過核酸外切酶/聚合酶的活性轉(zhuǎn)化為鈍端。DNA片段3'端腺基化后，連接具有發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的NEBNext接頭，從而為下一步雜交鋪墊。應(yīng)用AMPure XP系統(tǒng)對基因文庫片段進行過濾篩選，選出長度為250～300bp的cDNA片段。然后，使用3μL的USER酶與大小選擇、接頭連接的cDNA在37℃下反應(yīng)15min，然后在95℃下反應(yīng)5min，最后行PCR。使用Phusion High Fidelity DNA聚合酶、Index引物和通用PCR引物進行PCR擴增，再用AMPure XP系統(tǒng)對PCR產(chǎn)物進行提純。

基因文庫建成后，用Qubit2熒光光度計對其初次定量，并將文庫濃度調(diào)整為1.5ng/μL，用Agilent 2100生物分析儀檢測文庫的插入規(guī)格。待插入片段大小與符合預(yù)期時，采用qRT-PCR準確定量文庫的有效濃度。為確?；蛭膸熨|(zhì)量其有效濃度須大于2nmol/L。

應(yīng)用TruSeq PE Cluster Kit v3-CBOT-HS在CBOT群集生成系統(tǒng)上對編碼樣本的群集進行索引。最后，生成簇后，在Illumina NovaSeqTM平臺上對文庫制備進行測序，并產(chǎn)生125bp/150bp的成對末端閱讀。

1.2.5.2有參轉(zhuǎn)錄組差異基因表達分析采用有參轉(zhuǎn)錄組無生物學(xué)重復(fù)模式，使用Edger程序包對于每個測序文庫，通過一個標度歸一化因子來調(diào)整讀取計數(shù)，再進行差異表達分析。使用Edger軟件包對兩種條件進行差異表達分析。用Benjamini&Hochberg法調(diào)整P值。以校正P值為0.05，折疊式變化絕對值[log2(FoldChange)]為2作為差異表達的閾值。分析將所有差異表達的基因映射到GO數(shù)據(jù)庫中的每一項，計算每一項中的基因數(shù)量，篩選差異表達明顯富集的基因。

1.2.6qRT-PCR實驗

1.2.6.1總RNA提取建模成功后7、14、21、28d，過量麻醉處死SD大鼠，視神經(jīng)損傷組取損傷區(qū)視神經(jīng)組織稱重，晶狀體損傷組和對照組取距眼球約0.2～0.5mm的視神經(jīng)組織，每取0.1g加入1500μL Trizol溶液，放入去酶EP管中。采用Trizol法提取視神經(jīng)總RNA。采用U-3010微量分光光度計(日本)進行總RNA定量。

1.2.6.2引物合成采用premier5.0進行特異性引物設(shè)計，經(jīng)NCBIBlast基因庫驗證引物特異性，由北京擎科生物科技有限公司合成。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.6.3mRNA擴增逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照PrimeScriptRTEnzymeMixI(TAKARA)試劑盒說明書進行操作，構(gòu)建20μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件如下：(1)37℃，15min；(2)85℃，5s；(3)4℃保存。qRT-PCR按照TBGreenPremixExTaqII(TAKARA)試劑盒說明書進行操作，構(gòu)建20μL擴增體系，反應(yīng)條件如下：95℃(30s)→[95℃(5s)→60℃(34s)→95℃(15s)]×40→60℃(1min)→95℃(15s)。

1.2.7ELISA 視神經(jīng)損傷組取損傷區(qū)視神經(jīng)組織稱重，晶狀體損傷組和對照組取距眼球約0.2～0.5mm的視神經(jīng)組織稱重，加入9倍重量的PBS溶液，勻漿后，用5000r/min離心10min，取上清液。用稀釋液1∶4稀釋上清液(均用復(fù)孔檢測)后加入50μL至微孔內(nèi)，同時設(shè)置MMP-12梯度濃度標準品作為對照；將辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體(100μL)加入微孔內(nèi)，37℃溫箱進行孵育60min。孵育完成后反復(fù)沖洗96孔板5次，加入底物A及底物B各50μL，然后37℃避光孵育15min。最后，每孔加終止液50μL，15min內(nèi)在450nm波長下讀取吸光度值，通過用標準品吸光度值繪制標準曲線，從而計算出各樣本濃度。

統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS 11.0軟件進行分析，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間比較方差齊時采用LSD-t檢驗，方差不齊時采用Tamhane’sT2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1有參轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果

2.1.1不同組別的主成因分析對照組和視神經(jīng)損傷組數(shù)據(jù)聚集(綠色線框)，其第一主成因(PC1)和第二主成因(PC2)基本重合。晶狀體損傷聯(lián)合視神經(jīng)損傷組的PC1為 94.83%(藍色線框)，在成因分析中所占比例最大，是基因表達變化中的主要因素；晶狀體損傷組的PC2方差為 3.83%(藍色線框)，為次要因素(圖1)。

圖1 不同組別的主成因分析 綠色線框：對照組和視神經(jīng)損傷組數(shù)據(jù)聚集；藍色線框：晶狀體損傷聯(lián)合視神經(jīng)損傷組的PC1方差為 94.83%；晶狀體損傷組的PC2方差為 3.83%。

2.1.2不同組間基因表達差異分析視神經(jīng)損傷組和對照組比較，差異基因數(shù)最少，為164個基因。晶狀體損傷聯(lián)合視神經(jīng)損傷組和視神經(jīng)損傷組比較，差異基因數(shù)最多，為3396個(表2)。晶狀體損傷聯(lián)合視神經(jīng)損傷組和對照組比較時，MMP-12(基因ID：ENSRNOG00000030187)在晶狀體損傷聯(lián)合視神經(jīng)損傷組清理數(shù)據(jù)為1680.95，對照組的清理數(shù)據(jù)為1.00。定量分析比較兩組間差異的倍數(shù)變化為10.55。晶狀體損傷聯(lián)合視神經(jīng)損傷組的MMP-12的log2(FoldChange)值較高，基因表達上調(diào)10倍以上，對照組無明顯上調(diào)。伴有晶狀體損傷的各組中，均存在MMP-12基因表達上調(diào)。

表2 不同組間差異基因的數(shù)量

2.2不同時間各組間MMP-12的mRNA表達量比較建模成功后7d，四組大鼠MMP-12 mRNA表達量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.453，P>0.05)。建模成功后14d，四組大鼠MMP-12 mRNA表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=41.476，P<0.01)；晶狀體損傷聯(lián)合視神經(jīng)損傷組與對照組、視神經(jīng)損傷組和晶狀體損傷組比較，MMP-12 mRNA顯著上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；其余各組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。建模成功后21d，四組大鼠MMP-12 mRNA表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=103.843，P<0.01)；與對照組、視神經(jīng)損傷組和晶狀體損傷組比較，晶狀體聯(lián)合視神經(jīng)損傷組MMP-12 mRNA顯著上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；晶狀體損傷組與視神經(jīng)損傷組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其余各組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。建模成功后28d，四組大鼠MMP-12 mRNA表達量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.266，P>0.05)，見圖2。

圖2 不同時間各組間MMP-12 的mRNA表達量比較 A：建模成功后7d；B：建模成功后14d；C：建模成功后21d；D：建模成功后28d；bP<0.01 vs 晶狀體損傷聯(lián)合視神經(jīng)損傷組;cP<0.05 vs晶狀體損傷組。

2.3不同時間各組間MMP-12蛋白表達量比較建模成功后7d，四組大鼠MMP-12蛋白表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=4.199，P<0.05)。晶狀體損傷聯(lián)合視神經(jīng)損傷組與對照組和視神經(jīng)損傷組比較，MMP-12蛋白顯著上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，與晶狀體損傷組比較上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其余各組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。建模成功后14d，四組大鼠MMP-12蛋白表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8.143，P<0.01)；晶狀體損傷聯(lián)合視神經(jīng)損傷組與對照組和視神經(jīng)損傷組比較，MMP-12蛋白表達顯著上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；其余各組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。建模成功后21d，四組大鼠MMP-12蛋白表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.124，P<0.05)。晶狀體損傷聯(lián)合視神經(jīng)損傷組MMP-12 蛋白表達與對照組比較顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，與視神經(jīng)損傷組比較上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其余各組間兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。建模成功后28d，四組大鼠MMP-12蛋白表達量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.244，P>0.05)，見圖3。

圖3 不同時間各組間MMP-12蛋白表達量比較 A：建模成功后7d；B：建模成功后14d；C：建模成功后21d；D：建模成功后28d；aP<0.05,bP<0.01 vs晶狀體損傷聯(lián)合視神經(jīng)損傷組。

3 討論

成年期哺乳動物視神經(jīng)受損后再生困難[7-8]，是長期以來亟待解決的臨床難題[9-10]。既往研究提示，視神經(jīng)損傷后軸突能夠在移植的外周神經(jīng)中再生[11]，提示視神經(jīng)有內(nèi)在的生長活性。一般情況下，鉗壓受損的視神經(jīng)再生不超過2wk[12]，再生的軸突短，甚至不到幾毫米，不能恢復(fù)視功能[13]。在視神經(jīng)受到擠壓性損傷同時伴有晶狀體損傷時，則會誘導(dǎo)受損的視神經(jīng)軸突發(fā)生長時程再生，這種再生現(xiàn)象可以持續(xù)達1mo，且再生纖維可以達下丘腦(下級神經(jīng)元所在區(qū)域)形成有效的突觸連接，實驗動物的視覺電生理有明顯改善[1-2]。在研究這種長時程再生的機制時，視神經(jīng)損傷區(qū)域和損傷的晶狀體中均未發(fā)現(xiàn)有腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子-4(neurotrophin-4，NT-4)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)、神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)及堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)等神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達；使用這些細胞因子相應(yīng)的受體阻制劑也不能影響視神經(jīng)節(jié)細胞的再生過程[2]，提示神經(jīng)營養(yǎng)因子不是促進長時程再生的關(guān)鍵因子。

本實驗轉(zhuǎn)錄組測序中，主成因分析顯示：對照組和視神經(jīng)損傷組數(shù)據(jù)聚集，而晶狀體損傷聯(lián)合視神經(jīng)損傷組數(shù)據(jù)與它們離散，說明晶狀體損傷聯(lián)合視神經(jīng)損傷大鼠模型具有不同于其它各組的基因差異表達模式，且晶狀體損傷聯(lián)合視神經(jīng)損傷組的PC1為 94.83%，在成因分析中所占比例最大，是基因表達變化中的主要因素。晶狀體損傷聯(lián)合視神經(jīng)損傷組，高表達的差異基因主要富集在細胞因子反應(yīng)、白細胞淋巴細胞和正向免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)過程，這說明炎癥反應(yīng)可能參與了晶狀體損傷誘導(dǎo)視神經(jīng)損傷長時程再生過程。既往研究也發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)有促進視神經(jīng)再生的作用[14]，與我們的結(jié)論一致。

MMP-12在生理狀態(tài)下參與胚胎形成、新生血管的形成及傷口的愈合[15]，在病理狀態(tài)下參與組織重構(gòu)、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、惡性腫瘤轉(zhuǎn)移、動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)和急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)的病理進程[16-17]；MMP-12能降解細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)及血管壁成分，從而促進腫瘤細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移，而且MMP-12還能激活其它MMPs從而促進水解過程[18]；MMP-12具有促髓鞘再生作用，它能誘導(dǎo)胰島素樣生長因子1/胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白6復(fù)合體中釋放具有活性的胰島素樣生長因子從而促進髓鞘形成并成熟[19]，MMP-12基因敲除小鼠表現(xiàn)出少突膠質(zhì)細胞成熟和髓鞘形成延遲，降低小膠質(zhì)細胞遷移活性并促進它的成熟，可以減緩星形膠質(zhì)細胞病，有利于軸突再生[20]。有研究也發(fā)現(xiàn)在NgR基因敲除的大鼠若同時存在眼內(nèi)炎癥，視神經(jīng)軸突再生會增強[21-22]；而炎癥浸潤細胞，如：巨噬細胞和中性粒細胞，是在炎癥促進視神經(jīng)再生過程中起到調(diào)控作用的主體[23-24]。

我們結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，對晶狀體損傷聯(lián)合視神經(jīng)損傷的SD大鼠視神經(jīng)損傷區(qū)域組織進行qRT-PCR實驗，檢測MMP-12 mRNA的表達變化。晶狀體損傷聯(lián)合視神經(jīng)損傷組的MMP-12 mRNA，在14、21d時表達顯著上調(diào)，而在7、28d時，無升高。ELISA結(jié)果提示晶狀體損傷聯(lián)合視神經(jīng)損傷組在第7、14、21d時，MMP-12的蛋白質(zhì)表達顯著升高，但在28d時，各組間表達無差異。提示晶狀體損傷聯(lián)合視神經(jīng)損傷后的視神經(jīng)長時程再生伴隨有MMP-12的表達上調(diào)。既往研究提示MMP-12和MMP-9表達有促進視神經(jīng)損傷的再生作用[25]，未有文獻報道MMP-12在視神經(jīng)長時程再生過程中的表達規(guī)律。

因此，我們認為MMP-12的表達上調(diào)可能參與晶狀體損傷誘導(dǎo)視神經(jīng)鉗夾損傷后軸突長時程再生過程，但MMP-12發(fā)揮促軸突再生可能是綜合作用的結(jié)果，其機制需要進一步研究探討。