趙軼峰，李明霞，張 超，胡小敏，王 雄，趙鐵軍

胃癌是世界范圍內(nèi)一種可致命的癌癥，具有復發(fā)率高、轉(zhuǎn)移快的特點[1]。盡管胃癌的診斷和治療取得一定進展，但是臨床預(yù)后依然很差，5年生存率僅為21.35%[2]。因此，深入了解胃癌進展的分子機制可以為改善其預(yù)后提供有價值的生物學標志物和潛在的治療靶點。微小核糖核酸(miRNA)是一類由19～25個核苷酸組成的單鏈非編碼RNA，能夠參與細胞增殖、凋亡、遷移和分化等許多生物過程[3]。最近研究表明，位于14號染色體上的抑癌基因miR-433-3p通過靶向生長因子受體結(jié)合蛋白2抑制食管鱗狀細胞癌的增殖和侵襲[4]。然而，正如大多數(shù)文獻報道，對于miR-433-3p的研究僅局限于靶基因的鑒定及對細胞生物學功能的影響方面，而關(guān)于其自身轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制的研究卻很少。本研究通過生物信息學預(yù)測發(fā)現(xiàn)第2類POU結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子1(POU2F1)與miR-433-3p啟動子區(qū)存在結(jié)合位點，POU2F1作為POU同源域家族的一員，已有研究顯示其在肝癌組織中高表達，POU2F1過表達促進了肝癌細胞增殖、集落形成、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移和侵襲，而沉默POU2F1表達則抑制了這些惡性表型[5]。但POU2F1調(diào)控miR-433-3p對胃癌細胞增殖、遷移的影響鮮有報道。因此，本研究旨在探索POU2F1對miR-433-3p表達的調(diào)控作用及對胃癌細胞增殖、遷移的影響，以期進一步闡明胃癌的發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1胃癌組織樣本及細胞：2021年6月—2022年4月在河北北方學院附屬第一醫(yī)院共收集45例胃癌組織及與之匹配的癌旁組織(距癌組織4 cm處)。其中男22例，女23例；年齡(57.25±3.45)歲；Ⅰ～Ⅱ期24例，Ⅲ～Ⅳ期21例。將所有臨床組織標本在液氮中速凍后保存于-80 ℃冰箱中。所有臨床組織標本的組織學診斷至少由2名病理專家證實。胃癌患者在手術(shù)或活檢前均未接受任何抗腫瘤治療。所有患者在本研究開始前簽署本研究知情同意書。人胃黏膜上皮細胞株GES-1和人胃癌細胞株BGC-823、MKN-28、SGC-7901均購自上海信裕生物科技有限公司，批號分別為XY19167、XY19325、XY26331、XY23115。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.1.2主要試劑與儀器：POU2F1小干擾RNA(siRNA)、POU2F1 siRNA陰性對照、miR-433-3p siRNA、miR-433-3p siRNA陰性對照及miR-433-3p、POU2F1、U6引物均由上海基屹生物科技有限公司設(shè)計合成；RPMI-1640培養(yǎng)基(批號KE1902)、Trizol試劑(批號KE13127)、RIPA裂解液(批號KE04361)、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒(批號KE90117)、四甲基偶氮唑藍(MTT，批號KE20035)均購自上海創(chuàng)凌生物科技有限公司；胎牛血清(FBS，批號90170)、羊抗鼠二抗(批號33175)、化學發(fā)光試劑盒(批號40219)均購自北京威瑞谷生物技術(shù)有限公司；鼠源POU2F1(批號1076R)、GAPDH單克隆抗體(批號1013R)、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(批號4159K)均購自常州福生生物技術(shù)有限公司；CO2培養(yǎng)箱(型號Galaxy 48)、酶標儀(型號Sunrise)、凝膠成像儀(型號ChampChemi 580)均購自北京博勱行儀器有限公司；qRT-PCR儀(型號CG-05)、Transwell小室(型號PIEP12R48)均購自北京明陽科華科技有限責任公司。

1.2研究方法

1.2.1細胞培養(yǎng)：將人胃黏膜上皮細胞株GES-1及人胃癌細胞株BGC-823、MKN-28、SGC-7901在RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基含有10%FBS、鏈霉素100 U/ml和青霉素100 U/ml，置于含有5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中。取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2qRT-PCR檢測胃癌組織、癌旁組織和GES-1、BGC-823、MKN-28、SGC-7901細胞中miR-433-3p、POU2F1 mRNA表達：將胃癌組織和癌旁組織勻漿，使用Trizol試劑從胃癌組織、癌旁組織和GES-1、BGC-823、MKN-28、SGC-7901細胞中提取總RNA。使用NanoDrop 2000分光光度計測定RNA濃度后，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。在PCR系統(tǒng)上使用TransStart? Green qPCR SuperMix進行PCR擴增。引物序列：miR-433-3p上游引物：5′-AGAAGTACGGTGAGCCTGTC-3′，miR-433-3p下游引物：5′-GCTCTCACTCTGTCACCCAG-3′；POU2F1上游引物：5′-ATCTGGACTACGCTAGCTGAC-3′，POU2F1下游引物：5′-CGTAGTCCGATCAAGCTAGCA-3′；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCACACA-3′，U6下游引物：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′。以U6作為內(nèi)參，通過2-ΔΔCt法分析miR-433-3p、POU2F1 mRNA的相對表達。每種細胞設(shè)置6個重復組。

1.2.3蛋白印跡法檢測胃癌組織、癌旁組織和GES-1、BGC-823、MKN-28、SGC-7901細胞中POU2F1蛋白表達：將胃癌組織和癌旁組織勻漿，利用RIPA裂解液提取胃癌組織、癌旁組織和GES-1、BGC-823、MKN-28、SGC-7901細胞中蛋白質(zhì)，定量蛋白濃度后，通過電泳分離等量蛋白質(zhì)。電泳結(jié)束后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上，然后用5%脫脂牛奶封閉膜2 h，用TBST洗膜3次，再將膜分別與鼠源POU2F1(1︰2000)、GAPDH(1︰3000)一抗在4 ℃下孵育過夜。第2日用TBST洗膜3次后，將膜與羊抗鼠二抗(1︰2000)于室溫下孵育3 h，化學發(fā)光試劑盒可視化蛋白，采用Image軟件對灰度值進行量化分析(內(nèi)參為GAPDH)。每種細胞設(shè)置6個重復組。

1.2.4BGC-823細胞轉(zhuǎn)染與分組：取對數(shù)生長期BGC-823細胞，利用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒進行轉(zhuǎn)染，分為空白組(細胞未轉(zhuǎn)染)、POU2F1 siRNA組(POU2F1 siRNA轉(zhuǎn)染細胞)、POU2F1 siRNA-NC組(POU2F1 siRNA陰性對照轉(zhuǎn)染細胞)、miR-433-3p siRNA組(miR-433-3p siRNA轉(zhuǎn)染細胞)、miR-433-3p siRNA-NC組(miR-433-3p siRNA陰性對照轉(zhuǎn)染細胞)、miR-433-3p siRNA+POU2F1 siRNA-NC組(miR-433-3p siRNA和POU2F1 siRNA陰性對照共轉(zhuǎn)染細胞)、miR-433-3p siRNA+POU2F1 siRNA組(miR-433-3p siRNA和POU2F1 siRNA共轉(zhuǎn)染細胞)。每組設(shè)置6個復孔。

1.2.5MTT法檢測BGC-823細胞增殖能力：將“1.2.4”中轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的各組BGC-823細胞以1×103個/孔的密度接種在96孔板上，向每孔中加入MTT 10 μl，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)3 h，然后向每孔中加入二甲基亞砜150 μl，使用酶標儀測定490 nm波長處的光密度(OD)值，計算BGC-823細胞增殖率，增殖率=各轉(zhuǎn)染組OD值/空白組OD值×100%。

1.2.6Transwell實驗檢測BGC-823細胞遷移能力：將“1.2.4”中轉(zhuǎn)染后的各組BGC-823細胞加入到無FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸后，調(diào)整細胞濃度為2×105個/ml，取100 μl轉(zhuǎn)移至Transwell上室中，并使用600 μl含有10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基填充于Transwell下室中。48 h后，細胞用4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，顯微鏡下隨機選取6個視野計數(shù)遷移細胞數(shù)目。

1.2.7qRT-PCR和蛋白印跡法檢測BGC-823細胞中miR-433-3p、POU2F1 mRNA和蛋白表達：將“1.2.4”中轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的各組BGC-823細胞，按照“1.2.2”和“1.2.3”中的方法檢測BGC-823細胞中miR-433-3p、POU2F1 mRNA和蛋白表達。

1.2.8雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灒菏褂肨ransmiR v2.0 database在線軟件預(yù)測POU2F1與miR-433-3p啟動子區(qū)的結(jié)合位點，分別構(gòu)建miR-433-3p啟動子區(qū)野生型(WT)和突變型(MUT)報告質(zhì)粒，標記為miR-433-3p-WT、miR-433-3p-MUT。按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書將miR-433-3p-WT和miR-433-3p-MUT分別與POU2F1 siRNA陰性對照或POU2F1 siRNA共轉(zhuǎn)染于BGC-823細胞，分別記為：POU2F1 siRNA-NC+miR-433-3p-WT組(POU2F1 siRNA陰性對照和miR-433-3p-WT共轉(zhuǎn)染)、POU2F1 siRNA+miR-433-3p-WT組(POU2F1 siRNA和miR-433-3p-WT共轉(zhuǎn)染)、POU2F1 siRNA-NC+miR-433-3p-MUT組(POU2F1 siRNA陰性對照和miR-433-3p-MUT共轉(zhuǎn)染)、POU2F1 siRNA+miR-433-3p-MUT組(POU2F1 siRNA和miR-433-3p-MUT共轉(zhuǎn)染)。每組設(shè)置6個復孔，轉(zhuǎn)染48 h后，使用雙熒光素酶報告基因分析系統(tǒng)評估熒光素酶相對活性。

2 結(jié)果

2.1胃癌組織、癌旁組織中miR-433-3p及POU2F1 mRNA、蛋白表達比較 與癌旁組織比較，胃癌組織miR-433-3p表達水平顯著降低，POU2F1 mRNA和蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，見表1。

表1 胃癌組織、癌旁組織中miR-433-3p及POU2F1 mRNA、蛋白表達比較

2.2GES-1、BGC-823、MKN-28、SGC-7901細胞中miR-433-3p及POU2F1 mRNA、蛋白表達比較 與GES-1細胞比較，BGC-823、MKN-28、SGC-7901細胞miR-433-3p表達水平均降低，POU2F1 mRNA和蛋白表達水平均升高(P<0.05)，其中BGC-823細胞miR-433-3p表達水平最低，POU2F1 mRNA和蛋白表達水平最高。見表2。因此選用BGC-823細胞為研究對象進行后續(xù)研究。

表2 GES-1、BGC-823、MKN-28、SGC-7901細胞中miR-433-3p及POU2F1 mRNA、蛋白表達比較

2.3沉默POU2F1對BGC-823細胞增殖、遷移及miR-433-3p、POU2F1 mRNA和POU2F1蛋白表達的影響 與空白組和POU2F1 siRNA-NC組比較，POU2F1 siRNA組BGC-823細胞增殖率、遷移細胞數(shù)目、POU2F1 mRNA和POU2F1蛋白表達水平顯著降低，miR-433-3p表達水平顯著升高(P<0.05)；空白組和POU2F1 siRNA-NC組上述指標比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 沉默POU2F1對BGC-823細胞增殖、遷移及miR-433-3p、POU2F1 mRNA和POU2F1蛋白表達的影響

2.4沉默POU2F1逆轉(zhuǎn)下調(diào)miR-433-3p表達對BGC-823細胞增殖、遷移及miR-433-3p、POU2F1 mRNA和POU2F1蛋白表達的影響 與空白組和miR-433-3p siRNA-NC組比較，miR-433-3p siRNA組和miR-433-3p siRNA+POU2F1 siRNA-NC組BGC-823細胞增殖率、遷移細胞數(shù)目顯著升高(P<0.05)，miR-433-3p表達水平顯著降低(P<0.05)，POU2F1 mRNA和蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與miR-433-3p siRNA組和miR-433-3p siRNA+POU2F1 siRNA-NC組比較，miR-433-3p siRNA+POU2F1 siRNA組BGC-823細胞增殖率、遷移細胞數(shù)目、POU2F1 mRNA和POU2F1蛋白表達水平顯著降低，miR-433-3p表達水平顯著升高(P<0.05)。見表4。

表4 沉默POU2F1逆轉(zhuǎn)下調(diào)miR-433-3p表達對BGC-823細胞增殖、遷移及miR-433-3p、POU2F1 mRNA和POU2F1蛋白表達的影響

2.5生物信息學預(yù)測miR-433-3p上游轉(zhuǎn)錄因子 使用TransmiR v2.0 database預(yù)測發(fā)現(xiàn)POU2F1與miR-433-3p啟動子區(qū)存在結(jié)合位點，結(jié)合位點位于14號染色體上的100881247～100881262區(qū)域，結(jié)合序列為GGGAGTGCAGAGCAT。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果表明，POU2F1 siRNA-NC+miR-433-3p-WT組、POU2F1 siRNA+miR-433-3p-WT組、POU2F1 siRNA-NC+miR-433-3p-MUT組及POU2F1 siRNA+miR-433-3p-MUT組熒光素酶相對活性分別為1.09±0.13、2.06±0.19、1.06±0.12、1.04±0.11，與POU2F1 siRNA-NC+miR-433-3p-WT組比較，POU2F1 siRNA+miR-433-3p-WT組熒光素酶相對活性顯著升高(P<0.05)；POU2F1 siRNA-NC+miR-433-3p-MUT組和POU2F1 siRNA+miR-433-3p-MUT組熒光素酶相對活性比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3 討論

胃癌是癌癥相關(guān)死亡的第三大原因，也是全球第五大癌癥[6]。相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計，東亞地區(qū)胃癌發(fā)病率急劇升高，該地區(qū)男女發(fā)病率在全球范圍內(nèi)最高[7-8]。由于缺乏特異性生物學標志物，大多數(shù)新診斷的胃癌患者在確診時已處于晚期[9-10]。因此，迫切需要進一步研究胃癌的發(fā)病機制并確定與胃癌相關(guān)的特異性標志物。

miRNA在腫瘤細胞增殖、分化、凋亡、遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用[11-12]。李燕等[13]發(fā)現(xiàn)miR-433-3p在宮頸癌細胞中低表達，miR-433-3p過表達可抑制宮頸癌細胞的增殖、遷移及侵襲。萬智雙等[14]表明miR-433-3p可通過下調(diào)絲裂原活化蛋白激酶8表達抑制肝癌細胞MHCC97H的遷移和侵襲。楊艷等[15]闡明下調(diào)miR-433-3p可促進結(jié)直腸癌HT-29細胞增殖、遷移、侵襲。SUN等[16]報道m(xù)iR-433-3p通過靶向環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白來抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的生長、侵襲及遷移。本研究結(jié)果顯示，miR-433-3p在胃癌組織和胃癌細胞BGC-823、MKN-28、SGC-7901中呈低表達狀態(tài)，且miR-433-3p在BGC-823細胞中的表達水平最低，因此本研究選擇BGC-823細胞進行轉(zhuǎn)染實驗。本研究還發(fā)現(xiàn)，抑制miR-433-3p表達可明顯促進BGC-823細胞的增殖和遷移，提示miR-433-3p在胃癌中發(fā)揮著抑癌基因的作用。但關(guān)于miR-433-3p上游的調(diào)控機制尚不清楚，據(jù)報道轉(zhuǎn)錄因子可正向或負向調(diào)節(jié)miRNA的表達[17]，因此本研究通過使用TransmiR v2.0 database預(yù)測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子POU2F1與miR-433-3p啟動子區(qū)存在結(jié)合位點。

POU2F1也稱為八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1，由染色體1q24.1上的基因位點編碼。它是一種普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)與細胞周期相關(guān)靶基因的表達[18]。相關(guān)文獻報道，POU2F1通過脂肪非典型鈣黏蛋白1信號通路促進肝細胞癌的生長和轉(zhuǎn)移，可作為肝癌治療的靶點[19]。敲低POU2F1表達可導致頭頸部鱗狀細胞癌細胞的增殖和侵襲數(shù)目顯著減少[20]。POU2F1在肺癌細胞中高表達，且具有促進肺癌細胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移侵襲、增殖及克隆形成等生物學功能[21]。POU2F1在胃癌患者中上調(diào)并且與較差的存活率顯著相關(guān)[22]。有研究報道POU2F1可與miR-4490的啟動子序列互補結(jié)合調(diào)節(jié)miR-4490在胃癌中的表達[23]。但POU2F1與miR-433-3p在胃癌中的調(diào)控關(guān)系尚不十分清楚。本研究結(jié)果顯示，POU2F1 mRNA和蛋白在胃癌組織和細胞中高表達，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實POU2F1作為轉(zhuǎn)錄因子，通過與miR-433-3p啟動子區(qū)結(jié)合，發(fā)揮調(diào)控miR-433-3p表達的作用；沉默POU2F1可抑制BGC-823細胞的增殖與遷移能力，促進miR-433-3p表達，下調(diào)miR-433-3p表達對BGC-823細胞增殖、遷移的影響。提示沉默POU2F1后，低表達的POU2F1可促進miR-433-3p表達進而發(fā)揮抑癌效應(yīng)。

綜上，POU2F1可與miR-433-3p啟動子區(qū)結(jié)合，低表達的POU2F1可促進miR-433-3p表達，使miR-433-3p表達升高，進而抑制胃癌細胞的增殖與遷移。