夏薇青， 宋菊香， 楊二梅， 曹義甫， 王天智， 劉翠紅

(河北省石家莊市第三醫(yī)院腎內(nèi)科, 河北 石家莊 050000)

IgA腎病以IgA或IgA為主的免疫復(fù)合物在腎小球系膜沉積為特征的炎癥性腎病，是全球最常見的原發(fā)性腎小球腎炎，也是慢性腎臟病(CKD)和腎功能衰竭的主要原因，隨著病情進(jìn)展可引起貧血、骨骼疾病、骨折以及心血管疾病等并發(fā)癥，增加患者全因死亡風(fēng)險(xiǎn)[1]。腎間質(zhì)纖維化(RIF)是慢性腎臟病向終末期腎功能衰竭發(fā)展的必經(jīng)途徑，其組織病理學(xué)特征是腎小管細(xì)胞凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分在腎間質(zhì)內(nèi)過度沉積和腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖[2]。目前臨床在抗腎間質(zhì)纖維化方面缺乏有效的治療手段，仍以預(yù)防為主，探討與腎間質(zhì)纖維化相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物對(duì)臨床早期診治有著重要的意義。大量研究表明微小核糖核酸(miRNA)參與腎臟病理生理學(xué)調(diào)控，與RIF有著密切的關(guān)系[3]。已知炎癥、氧化應(yīng)激與RIF發(fā)病有關(guān)，氧化應(yīng)激、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)可促使腎間質(zhì)肌成纖維細(xì)胞積累和纖維化，miR-191-5p可靶向氧化應(yīng)激反應(yīng)激酶1(OXSR1)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，減輕腎細(xì)胞凋亡和腎損傷[4]。miR-191-5p是否與CKD患者RIF有關(guān)尚不清楚，本研究擬檢測(cè)IgA腎病患者血漿中miR-191-5p表達(dá)，探討其與RIF及其相關(guān)指標(biāo)、腎功能之間的關(guān)系，以期為臨床診治提供參考。

1 資料與方法

1.1臨床資料:選擇2017年2月至2022年2月我院收治的80例IgA腎病患者(IgA腎病組)，男47例，女33例；年齡32～64歲，平均(47.18±11.63)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《KDIGO 2012慢性腎臟疾病評(píng)估和管理臨床實(shí)踐指南》中IgA腎病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；②年齡18周歲以上；③入組前均行腎組織活檢，病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①痛風(fēng)或尿路結(jié)石；②腎良惡性腫瘤；③合并自身免疫疾病、感染性疾病。根據(jù)2012年KDOQI臨床實(shí)踐指南中分期標(biāo)準(zhǔn)[5]分為Ⅰ～Ⅱ期組(42例)、Ⅲ期組(38例)。根據(jù)牛津分型中TIL程度[6]將其分為三組：T0組(20例)，腎小管萎縮/間質(zhì)纖維化程度<25%；T1組(39例)，腎小管萎縮/間質(zhì)纖維化程度25%～50%；T2組(21例)，腎小管萎縮/間質(zhì)纖維化程度>50%。另選擇77例健康志愿者為對(duì)照組，男41例，女36例；年齡35～66歲，平均(47.92±11.24)歲。IgA腎病組和對(duì)照組基線資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，本研究已經(jīng)獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者均簽署同意書。

1.2方 法

1.2.1實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR):所有受試者在入組次日清晨禁食期間采集3mL外周靜脈血，將血樣置于含有EDTA的抗凝管中混勻，放入ScientificTM落地式超高速離心機(jī)(美國(guó)賽默飛公司)離心(相對(duì)離心力8500×g/5400rpm)離心取上層液(即血漿)檢測(cè)。使用TRIzol?試劑(美國(guó)賽默飛Invitrogen)提取總RNA，RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis kit(美國(guó)賽默飛)將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用 SYBR RT-PCR 試劑盒(中國(guó)大連Takara生物科技有限公司)在 StepOnePlusTM實(shí)時(shí) 熒光定量PCR系統(tǒng)(美國(guó)賽默飛Applied Biosystems)上進(jìn)行三次重復(fù)qRT-PCR分析。使用比較循環(huán)閾值(2-ΔΔCt)的方法計(jì)算miR-191-5p相對(duì)表達(dá)水平。反應(yīng)條件為:預(yù)變性95℃ 5min，然后是40個(gè)循環(huán)的95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 30s。反應(yīng)體系，DNA模板2μL，上下游引物各1μL，Premix Ex Taq DNA 聚合酶25μL，RNase-Free ddH2O 21μL。引物序列，miR-191-5p，正向：5'-CGGAATCCCAAAAGCAGCTG-3'，反向：5'-TGTCGTGGAGTCGGCAATTG-3'；U6(內(nèi)參)正向，5'-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3'和反向，5'-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3'。

1.2.2腎功能和RIF指標(biāo):采用AU400全自動(dòng)生化分析儀(日本Olympus公司)檢測(cè)腎功能指標(biāo)-血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)含量；采用HBS-1096A全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀(南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)RIF指標(biāo)-轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1、TGF-α水平，試劑盒購自美國(guó)賽默飛公司。

1.2.3腎組織活檢:IgA腎病患者入組前均行穿刺活檢，取活檢腎組織，采用4%多聚甲醛溶液中室溫固定6～8h，全自動(dòng)脫水，石蠟包埋，3μm切片。取石蠟包埋切片，脫蠟水化，PASM，Masson染色，立春紅-品紅著色10min，流水沖洗搖晃至干，1%磷鉬酸鹽水溶液分色5min，去除磷鉬酸鹽，苯胺藍(lán)染色5min，水流沖洗，依次加入95%酒精、無水酒精和透明二甲苯，中性膠封片。送金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心進(jìn)行病理結(jié)果分析，每個(gè)病理切片取上、中、下、左、右等5個(gè)視野，于LV150N光學(xué)顯微鏡(日本尼康公司)觀察和計(jì)算切片著色面積。

2 結(jié) 果

2.1IgA腎病組和對(duì)照組血漿miR-191-5p表達(dá)、腎功能以及RIF指標(biāo)比較:IgA腎病組血漿miR-191-5p表達(dá)低于對(duì)照組(P<0.05)，Scr、BUN、TGF-β1、TGF-α水平高于對(duì)照組(P<0.05)，見表1。

表1 IgA腎病組和對(duì)照組血漿miR-191-5p表達(dá)腎功能以及RIF指標(biāo)差異

2.2不同CKD分期血漿miR-191-5p表達(dá)、腎功能以及RIF面積和指標(biāo)比較:Ⅲ期組血漿miR-191-5p表達(dá)低于Ⅰ～Ⅱ期組(P<0.05)，Scr、BUN、TGF-β1、TGF-α水平高于Ⅰ～Ⅱ期組(P<0.05)，RIF面積大于Ⅰ～Ⅱ期組(P<0.05)，見表2。

表2 不同CKD分期血漿miR-191-5p表達(dá)腎功能以及RIF面積和指標(biāo)差異

2.3不同RIF分期血漿miR-191-5p表達(dá)、腎功能以及RIF面積和指標(biāo)比較:T2組血漿miR-191-5p表達(dá)低于T0組和T1組(P<0.05)，Scr、BUN、TGF-β1、TGF-α水平高于T0組和T1組(P<0.05)，RIF面積大于T0組和T1組(P<0.05)；T1組血漿miR-191-5p表達(dá)低于T0組(P<0.05)，Scr、BUN、TGF-β1、TGF-α水平高于T0組(P<0.05)，RIF面積大于T0組(P<0.05)，見表3。

表3 不同RIF分期血漿miR-191-5p表達(dá)腎功能以及RIF面積和指標(biāo)差異

2.4miR-191-5p表達(dá)與腎功能、RIF面積和指標(biāo)的相關(guān)性:CKD患者血漿miR-191-5p表達(dá)與RIF面積、Scr、BUN、TGF-β1、TGF-α均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.509、-0.379、-0.311、-0.475、-0.486，P<0.05)。

3 討 論

RIF是IgA腎病的病理標(biāo)志及其進(jìn)展為終末期腎功能衰竭的預(yù)測(cè)因子，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、調(diào)控纖維化細(xì)胞因子激活、ECM轉(zhuǎn)換失衡、氧化應(yīng)激、慢性缺氧等多種因素有關(guān)。雖然早期RIF引起的腎臟損害是可逆的，但瘢痕形成期的RIF是不可逆的，積極探尋與RIF相關(guān)生物學(xué)指標(biāo)對(duì)預(yù)防和延緩纖維化進(jìn)展，抗RIF治療和預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估均具有重要意義。miRNA在基因表達(dá)調(diào)控和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路反饋回路中發(fā)揮著重要作用，參與細(xì)胞分化、增殖、凋亡、代謝、造血、身體形態(tài)發(fā)生等生理過程，越來越多證據(jù)表明miRNA失調(diào)可能與IgA腎病的發(fā)病機(jī)制和發(fā)展有關(guān)。

miR-191-5p是一種多功能的miRNA，屬于miR-191家族，在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)豐富，可靶向血管內(nèi)皮鋅指1抑制血管生成促進(jìn)缺血性腦損傷，下調(diào)miR-191表達(dá)可增加可提高腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子水平，改善異氟醚誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙，減緩神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。miR-191還可通過直接靶向Smad2，激活TGF-β信號(hào)通路，促使血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，miR-191過表達(dá)將上調(diào)金屬硫蛋白1E誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)和ECM重塑，參與主動(dòng)脈瘤形成過程[7]。同樣miR-191具有免疫調(diào)節(jié)作用，研究顯示miR-191是幼稚、記憶和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，miR-191表達(dá)下調(diào)可減弱細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子5信號(hào)通路，導(dǎo)致外周CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞以及幼稚T細(xì)胞和記憶CD8+細(xì)胞數(shù)量減少[8]。miR-191通過靶向調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子-叉頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子P1、E2A和早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子1促使B細(xì)胞發(fā)育，miR-191表達(dá)缺失和異位表達(dá)將導(dǎo)致B系細(xì)胞發(fā)育停滯[9]。

miR-191異常表達(dá)與腎臟疾病有著密切關(guān)系，已有報(bào)道表明miR-191-5p在腎細(xì)胞癌中表達(dá)下調(diào)，miR-191-5p表達(dá)缺失可促使腎癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，提示miR-191-5p在腎細(xì)胞癌中發(fā)揮腫瘤抑制基因作用[10]。而在腎缺血再灌注損傷中miR-191表達(dá)上調(diào)，通過靶向抑制胱硫醚β合酶表達(dá)，促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞凋亡和腎缺血再灌注性損傷[11]。本研究發(fā)現(xiàn)IgA腎病組血漿miR-191-5p表達(dá)低于對(duì)照組，且隨著分期增加而降低，miR-191-5p與Scr、BUN呈負(fù)相關(guān)，表明miR-191-5p表達(dá)缺失可能參與IgA腎病發(fā)病過程。Berillo等[12]報(bào)道同樣顯示高血壓所致慢性腎病患者血漿miR-191-5p表達(dá)下調(diào)，miR-191-5p低表達(dá)與eGFR降低和中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比率增加有關(guān)，提示miR-191-5p低表達(dá)可能通過促使炎癥反應(yīng)參與腎功能損害過程。目前miR-191-5p與RIF的關(guān)系尚不清楚，本研究發(fā)現(xiàn)IgA腎病患者血漿miR-191-5p表達(dá)在不同RIF分期中差異顯著，隨著RIF分期增加而下調(diào)，且與RIF面積、TGF-β1、TGF-α呈負(fù)相關(guān)，提示miR-191-5p表達(dá)缺乏可能引起RIF，進(jìn)而促使CKD發(fā)病進(jìn)程，推測(cè)可能的機(jī)制為：首先，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)是促纖維化的主要途徑，炎癥信號(hào)通路的激活可引起核因子-κB活性增強(qiáng)，促使炎癥介質(zhì)合成、TGF-β和ECM蛋白分泌，導(dǎo)致成纖維細(xì)胞增殖和ECM成分沉積，引起RIF。miR-191-5p具有抗炎作用，研究顯示miR-191-5p過表達(dá)可抑制NLRP3炎性體通路減輕炎癥反應(yīng)和炎癥損傷[13]，由此可見，miR-191-5p表達(dá)缺失可能通過加劇炎癥反應(yīng)促使RIF進(jìn)程。其次，活性氧的產(chǎn)生通過激活絲裂原活化蛋白激酶和Smad通路誘導(dǎo)TGF-β1，促使上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和RIF，miR-191-5p具有抗氧化應(yīng)激作用，通過特異性靶向OXSR1 mRNA抑制p38絲裂原活化蛋白激酶/核因子-κB信號(hào)通路激活，抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，因此miR-191-5p表達(dá)缺失可能加重氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，促使RIF發(fā)生和進(jìn)展。

綜上，IgA腎病患者血漿miR-191-5p表達(dá)降低，miR-191-5p低表達(dá)與RIF面積、Scr、BUN、TGF-β1、TGF-α增加有關(guān)，提示miR-191-5p缺乏可能與IgA腎病患者RIF以及腎功能下降有關(guān)，miR-191-5p可能通過促使RIF參與IgA腎病發(fā)病過程。本研究局限之處在于不能直接證實(shí)miR-191-5p與RIF間的關(guān)系，尚待進(jìn)一步開展基礎(chǔ)研究探討。