樓金成苗鐔允蘇嘉琪胡 情翟春濤*呂玉娥

(1.山西中醫(yī)藥大學(xué),山西 晉中 030600;2.山西省針灸醫(yī)院,太原 030006)

過(guò)敏性哮喘(allergic asthma,AS)是一種由2型炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的超敏反應(yīng)所引起的氣道慢性損傷性炎癥疾病[1]。一系列潛在機(jī)制導(dǎo)致氣道炎癥,導(dǎo)致可變氣流受限和呼吸道癥狀如喘息、氣短、胸悶和咳嗽等是過(guò)敏性哮喘最典型的特征[2]。在過(guò)去幾十年中,其流行率大幅上升,全世界有大約3.5億人受其影響,尤其是在兒童中,患病率顯著增加[3]。目前尚無(wú)完全治愈方法,但可以通過(guò)醫(yī)生和患者教育、避免環(huán)境過(guò)敏原暴露、規(guī)范化藥物治療和變應(yīng)原特異性免疫治療(allergen specific immunotherapy,AIT)等方式來(lái)幫助控制癥狀[4]。

目前過(guò)敏性哮喘動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬的選擇主要集中在豚鼠、小鼠和大鼠三大類(lèi)[5]。其中豚鼠作為最經(jīng)典的過(guò)敏性哮喘動(dòng)物選擇,可以誘導(dǎo)與人類(lèi)最相似的炎癥反應(yīng)和氣道高反應(yīng)性。但通常誘導(dǎo)的過(guò)敏性哮喘豚鼠模型是由IgG介導(dǎo)的是Ⅰ型變態(tài)反應(yīng),同時(shí)個(gè)體反應(yīng)差異較大,同一批豚鼠同一致敏濃度會(huì)出現(xiàn)不致敏或過(guò)度致敏導(dǎo)致死亡共存的現(xiàn)象[6]。此外,較少的相關(guān)生物學(xué)抗體和昂貴的價(jià)格使豚鼠不再是構(gòu)建過(guò)敏性哮喘的理想動(dòng)物模型。大鼠和小鼠的過(guò)敏性哮喘動(dòng)物模型同樣具有許多人類(lèi)過(guò)敏性哮喘的特征。然而,過(guò)敏性哮喘的主要癥狀,如氣道高反應(yīng)性和炎癥,在大鼠中比在小鼠中更容易再現(xiàn)[7]。此外,與小鼠相比,大鼠體型更大更加容易處理,且能收集到更多的樣本。因此,過(guò)敏性哮喘大鼠模型的重要性日益增加[8]。本文就近5年國(guó)內(nèi)外通過(guò)大鼠構(gòu)建過(guò)敏性哮喘模型的文獻(xiàn)進(jìn)行匯總,從大鼠的品系、造模方法、模型評(píng)價(jià)等方面對(duì)過(guò)敏性哮喘大鼠模型的構(gòu)建進(jìn)行比較分析。

1 文獻(xiàn)來(lái)源

以(“過(guò)敏性哮喘”或“變應(yīng)性哮喘”)和“大鼠”為主題,時(shí)間設(shè)定為2017年1月～2022年4月在中國(guó)知網(wǎng)(CNKI)、萬(wàn)方醫(yī)學(xué)網(wǎng)、維普期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù),并在PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)(2017～2022)上以“Allergic Asthma”和“Rat”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索,其中CNKI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到文獻(xiàn)105篇,萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)38篇,維普數(shù)據(jù)庫(kù)17篇,PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)159篇,選擇通過(guò)過(guò)敏性哮喘大鼠模型進(jìn)行研究的實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)、碩博論文,排除綜述、科技成果、會(huì)議類(lèi)文獻(xiàn)和重復(fù)類(lèi)文獻(xiàn),共有18篇文獻(xiàn)符合要求。以下就文獻(xiàn)從大鼠的品系、造模方法、模型評(píng)價(jià)指標(biāo)等方面進(jìn)行整理,詳細(xì)見(jiàn)表1。

表1 過(guò)敏性哮喘大鼠模型構(gòu)建方法Table 1 Construction method of allergic asthma rat model

續(xù)表1

續(xù)表1

2 大鼠品系

雄性SD大鼠和雄性Wistar大鼠是過(guò)敏性哮喘大鼠模型中最常用的品系,兩種大鼠致敏后產(chǎn)生的遲發(fā)性過(guò)敏反應(yīng)的時(shí)間與臨床患者時(shí)間接近[27]。其中雄性SD大鼠應(yīng)用較多,可能與其可長(zhǎng)時(shí)間耐受高濃度激發(fā),從而出現(xiàn)典型的過(guò)敏性炎癥反應(yīng)有關(guān)[28]。其中,也有文獻(xiàn)[26]提到的用雌性BN大鼠造模,并提出與前兩種大鼠相比,過(guò)敏原致敏后的BN大鼠能更加容易的產(chǎn)生IgE反應(yīng),是研究過(guò)敏性哮喘最合適的大鼠品系,在國(guó)際上使用率越來(lái)越高。但較低的繁殖率和高昂的價(jià)格,在國(guó)內(nèi)的使用率較少(表2)。

表2 過(guò)敏性哮喘模型所用大鼠品系的頻數(shù)及占比Table 2 Frequency and proportion of rat strains used in allergic asthma models

3 造模方式

過(guò)敏性哮喘是一種環(huán)境與機(jī)體相互影響的疾病,其發(fā)病機(jī)制主要分為致敏即免疫記憶階段和效應(yīng)階段兩方面[4]。免疫記憶階段:當(dāng)過(guò)敏原首次進(jìn)入氣道時(shí),會(huì)被抗原提成細(xì)胞(如樹(shù)突狀細(xì)胞)識(shí)別并把他們加工成小肽后與細(xì)胞膜表面的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)II類(lèi)分子結(jié)合形成復(fù)合物,并通淋巴管向幼稚的CD4+Th細(xì)胞提供過(guò)敏原成分,在存在2型細(xì)胞因子的情況下,產(chǎn)生過(guò)敏原特異性Th2。由Th2細(xì)胞產(chǎn)生的IL-4可以促進(jìn)B細(xì)胞成熟并分化為漿細(xì)胞,生成抗原sIgE,sIgE與肥大細(xì)胞表面的高親和力IgE受體FcεRI結(jié)合,生成IgE抗體,使機(jī)體致敏,其中部分增殖的效應(yīng)Th2成為過(guò)敏原特異性記憶T淋巴細(xì)胞[4]。效應(yīng)階段:當(dāng)過(guò)敏原再次進(jìn)入機(jī)體時(shí),被血液內(nèi)的IgE識(shí)別并結(jié)合,促使肥大細(xì)胞(Mast Cell,MC)脫顆粒,釋放炎性介質(zhì)產(chǎn)生早期過(guò)敏性反應(yīng)[6,29],表現(xiàn)為血管擴(kuò)張和支氣管收縮等,導(dǎo)致支氣管結(jié)構(gòu)功能改變,形成急性哮喘癥狀[30]。氣道慢性炎癥反應(yīng)是效應(yīng)階段的延續(xù),Th2細(xì)胞向氣道炎癥部位遷移,在炎癥部位受到過(guò)敏原攻擊時(shí),氣道局部釋放的趨化因子使Th2細(xì)胞釋放2型細(xì)胞因子如IL-4、IL-5、IL-13等。IL-5對(duì)促進(jìn)組織嗜酸性粒細(xì)胞增多和肥大細(xì)胞增生至關(guān)重要,而IL-13可以刺激杯狀細(xì)胞產(chǎn)生粘液并誘發(fā)氣道高反應(yīng)(Airway Hyper Reactivity,AHR)[31]。故在過(guò)敏性哮喘動(dòng)物模型的造模時(shí),主要也分為兩個(gè)階段,分別是致敏期和激發(fā)期。

3.1 致敏期

卵清蛋白(OVA)是使用最多的致敏原[32],主要分為單純OVA和復(fù)合OVA(含佐劑,主要包括Al(OH)3等)兩大類(lèi),具有較強(qiáng)的抗原性和免疫原性。

3.1.1 致敏濃度

分析前文篩選的文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),所選文獻(xiàn)中共出現(xiàn)了7種不同的OVA致敏濃度。在7種致敏濃度中,最常用的是將1mg OVA溶于含有一定量佐劑(Al(OH)3)中(7篇,38.9%)。致敏濃度及頻數(shù)見(jiàn)表3。隨后將所有文獻(xiàn)中所提的OVA的產(chǎn)品目錄號(hào)及所對(duì)應(yīng)純度進(jìn)行檢索并整理,發(fā)現(xiàn)在一定程度上,致敏濃度的選擇與所選OVA的純度有關(guān),所以過(guò)敏性哮喘大鼠模型致敏期間所用的具體造模濃度的選擇應(yīng)根據(jù)自身所擁有OVA的純度來(lái)決定。

表3 過(guò)敏性哮喘大鼠模型各致敏濃度的頻數(shù)和占比Table 3 Frequency and proportion of each sensitizing concentration in allergic asthma rat model

3.1.2 致敏方法

致敏操作方法主要分為3種,分別是腹腔注射、皮下注射和皮下注射聯(lián)合腹腔注射。見(jiàn)表1。同時(shí)發(fā)現(xiàn)致敏時(shí)適當(dāng)?shù)厥褂锰厥庾魟┤缰嗵?LPS)[25]或百日咳毒素[17,26]可以有效的加強(qiáng)致敏效果。

3.2 激發(fā)期

最常用來(lái)激發(fā)哮喘的方式是通過(guò)OVA霧化激發(fā),OVA的濃度范圍通常在1%～5%之間,霧化次數(shù)在7～14次不等。也有文獻(xiàn)[26]提示可以通過(guò)鼻內(nèi)滴注的方式來(lái)激發(fā)哮喘。有研究將相同致敏方式和致敏濃度的大鼠分別用同一濃度的OVA分別霧化激發(fā)4周和8周,發(fā)現(xiàn)兩組大鼠氣道損傷情況雖然有些許差異,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[33]。

4 模型的評(píng)價(jià)指標(biāo)

分析前文篩選的文獻(xiàn),總結(jié)文獻(xiàn)中關(guān)于造模后模型的評(píng)價(jià)指標(biāo)主要包括:(1)發(fā)作時(shí)一般行為學(xué)觀察;(2)肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察;(3)肺功能檢測(cè);(4)Th2型細(xì)胞因子;(5)血清免疫球蛋白IgE;(6)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況(表4)。

表4 過(guò)敏性哮喘大鼠模型評(píng)價(jià)指標(biāo)Table 4 Evaluation index of allergic asthma rat model

4.1 發(fā)作時(shí)一般行為學(xué)觀察

過(guò)敏性哮喘大鼠模型哮喘發(fā)作期的典型癥狀表現(xiàn)為造模期間頻繁并持續(xù)的出現(xiàn)呼吸加快并伴有喘息、口唇黏膜發(fā)紺、腹肌痙攣、毛色暗淡并伴有豎起、抓耳撓腮等,并隨著激發(fā)次數(shù)的增多,癥狀會(huì)加重且出現(xiàn)的頻率逐漸增加。金禹彤等[14]通過(guò)記錄各組大鼠引喘潛伏期與發(fā)作總持續(xù)時(shí)間比較;李潘營(yíng)等[13]通過(guò)霧化磷酸組胺和2%的氯化乙酰膽堿等量的混合液后,從第1次喘息開(kāi)始記錄大鼠2 min內(nèi)的喘息次數(shù)來(lái)對(duì)過(guò)敏性哮喘大鼠模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。

4.2 肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察(HE染色)

肺組織的病理形態(tài)學(xué)觀察可以直觀的反映在過(guò)敏性哮喘發(fā)病及持續(xù)過(guò)程中,肺組織在炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)下,不斷的損傷和修復(fù)后產(chǎn)生的病理結(jié)構(gòu)性改變。在過(guò)敏性哮喘大鼠模型的肺組織HE染色中,可以看到大鼠支氣管周?chē)鷷?huì)出現(xiàn)大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn),部分細(xì)支氣管上皮壞死,杯狀細(xì)胞增生、肥大,支氣管壁增厚和肺泡嚴(yán)重變形等一系列表現(xiàn)。

4.3 Th2型細(xì)胞因子

過(guò)敏性哮喘是一種由2型炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的慢性肺損傷性炎癥,Th2細(xì)胞在2型炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)、維持和增殖中發(fā)揮重要作用。當(dāng)過(guò)敏原暴露并進(jìn)入呼吸道時(shí),樹(shù)突狀細(xì)胞攝取這些過(guò)敏原并引導(dǎo)Th2細(xì)胞的增殖分化,從而導(dǎo)致Th2型細(xì)胞因子如IL-4、IL-5、IL-13等的分泌增加。Th2反應(yīng)是IgE介導(dǎo)的致敏、氣道高反應(yīng)性 (AHR) 和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的基礎(chǔ),這些都是過(guò)敏性氣道疾病的標(biāo)志。

4.4 血清免疫球蛋白IgE

IgE在過(guò)敏性哮喘的發(fā)病過(guò)程其起著非常重要的作用。Th2細(xì)胞通過(guò)分泌IL-4和IL-13來(lái)激活B細(xì)胞的發(fā)育并分化成分泌IgE的漿細(xì)胞。分泌的IgE與肥大細(xì)胞(MC)表面的FcεRI受體結(jié)合。再次暴露于該抗原會(huì)導(dǎo)致IgE結(jié)合的FcεRI受體的交聯(lián)化,繼而導(dǎo)致MC脫顆粒,再次釋放先前合成的細(xì)胞因子(IL-4和IL-13)導(dǎo)致氣道炎癥的進(jìn)行性加重,以及合成新的炎癥介質(zhì)(如組胺、趨化因子和白三烯等)[6,29]。MC釋放的炎癥介質(zhì)刺激其他炎癥細(xì)胞以及結(jié)構(gòu)內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞,導(dǎo)致支氣管痙攣和氣道黏液分泌增加,誘發(fā)氣道高反應(yīng)(AHR),加重過(guò)敏性哮喘的進(jìn)程[34]。

4.5 嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)情況

Th2細(xì)胞分泌的IL-5主要負(fù)責(zé)骨髓和組織中嗜酸粒細(xì)胞的生成和激活。在過(guò)敏性哮喘患者的支氣管肺組織中存在大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)[35],嗜酸性粒細(xì)胞是其關(guān)鍵的炎癥細(xì)胞,在過(guò)敏性哮喘的氣道高反應(yīng)性、粘液產(chǎn)生和氣道重塑中都發(fā)揮重要作用。有研究表明通過(guò)促進(jìn)EOS的調(diào)亡,可以有效減輕氣道炎癥,從而達(dá)到緩解過(guò)敏性哮喘的目的[36]。

4.6 肺功能檢測(cè)

肺功能檢測(cè)是診斷哮喘和評(píng)估哮喘控制程度的重要檢查方法[37]。最常用來(lái)進(jìn)行哮喘模型肺功能檢測(cè)的方式是肺功能氣道反應(yīng)性測(cè)試,用梯度濃度的乙酰膽堿對(duì)哮喘模型進(jìn)行激發(fā)并觀察呼吸阻力情況。過(guò)敏性哮喘模型大鼠檢測(cè)時(shí)可以發(fā)現(xiàn),各梯度乙酰膽堿激發(fā)模型組大鼠呼吸阻力較空白組升高明顯(P＜0.01)。同時(shí),李潘營(yíng)等[13]提出,也可以通過(guò)氧合指數(shù)檢測(cè)、肺通透指數(shù)等方面來(lái)對(duì)過(guò)敏性哮喘大鼠的肺功能進(jìn)行評(píng)價(jià)。

5 總結(jié)

隨著過(guò)敏性哮喘動(dòng)物模型的出現(xiàn),大大加快了過(guò)敏性哮喘的研究進(jìn)程,但現(xiàn)有的哮喘模型僅能表現(xiàn)過(guò)敏性哮喘某特定階段的部分病理表現(xiàn)。雖然至今還沒(méi)有任何一種哮喘動(dòng)物模型能完全概括人類(lèi)過(guò)敏性哮喘的發(fā)生發(fā)展過(guò)程,但是通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程中構(gòu)建過(guò)敏性哮喘動(dòng)物模型,能使我們更好的研究藥物及其他治療方法對(duì)過(guò)敏性哮喘機(jī)制的影響,為實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用于臨床提供可靠幫助。本文對(duì)近5年來(lái)制作過(guò)敏性哮喘大鼠模型時(shí)所選用的常用大鼠品系、不同的致敏方式和致敏濃度,以及部分評(píng)價(jià)造模成功時(shí)的指標(biāo)進(jìn)行了綜合闡述,為后續(xù)研究人員在制作過(guò)敏性哮喘大鼠模型時(shí),能更準(zhǔn)確地選擇大鼠品系以及試劑種類(lèi),并以此選擇合適的造模方式及造模成功的評(píng)價(jià)方式,提供了有力支持,并推進(jìn)實(shí)驗(yàn)順利開(kāi)展。