高祥舉高冬梅陳憲梅宋婷婷高 占高 杰*王杰瓊*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,濟(jì)南 250355;2.山東中醫(yī)藥大學(xué)情志病證研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì),濟(jì)南 250355;3.山東中醫(yī)藥大學(xué)情志病證肝藏象藥理青年科研創(chuàng)新團(tuán)隊(duì),濟(jì)南 250355;4.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,濟(jì)南 250355)

甲狀腺腫是一種常見的內(nèi)分泌疾病,存在單純性甲狀腺腫,也可伴有結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、橋本甲狀腺炎、Graves病等甲狀腺疾病[1-2]。2015年～2017年對(duì)國(guó)內(nèi)31個(gè)省、直轄市、自治區(qū)的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,成年人甲狀腺腫大的患病率為1.17%[3],且與少年代謝綜合征、糖尿病、肝炎等有關(guān),其本身病變率達(dá)5%[4]。結(jié)節(jié)性甲狀腺腫(nodular goiter)是甲狀腺腫中的一類,多由甲狀腺激素分泌不足,刺激甲狀腺體積增大,隨時(shí)間發(fā)展,甲狀腺在增大過程中形成一個(gè)或多個(gè)結(jié)節(jié)[5]。

雖然近些年來,對(duì)甲狀腺相關(guān)疾病基礎(chǔ)研究日益增多,但其發(fā)病機(jī)制及病理過程尚不完全清楚,因此建立可重復(fù)、簡(jiǎn)單易行且穩(wěn)定的動(dòng)物模型顯得尤為重要,國(guó)內(nèi)多以制作大鼠模型為主。目前臨床上公認(rèn)的結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的診斷金標(biāo)準(zhǔn)是超聲影像及細(xì)針穿刺病理結(jié)果[6-7],但缺乏動(dòng)物模型超聲檢測(cè)操作步驟、方法及相關(guān)參數(shù)。目前也未見應(yīng)用超聲檢測(cè)大鼠結(jié)節(jié)性甲狀腺腫細(xì)節(jié)報(bào)道,這對(duì)于基礎(chǔ)研究人員使用超聲檢測(cè)大鼠甲狀腺來說有不小的困難。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠結(jié)節(jié)性甲狀腺腫模型,確定其超聲下甲狀腺位置,再利用超聲技術(shù)來進(jìn)行模型評(píng)價(jià),造模后取甲狀腺組織進(jìn)行病理學(xué)模型鑒定,旨在建立一種簡(jiǎn)單易行、穩(wěn)定可靠的大鼠甲狀腺結(jié)節(jié)模型評(píng)價(jià)方法。同時(shí)為今后大鼠甲狀腺超聲檢測(cè)的操作提供技術(shù)參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)Wistar大鼠40只,體重150～180 g,6～8周,雌雄各半,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2021-0011],飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心大樓[SYXK(魯)2017-0022]。飼養(yǎng)大鼠運(yùn)抵實(shí)驗(yàn)室后先行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,自由飲水進(jìn)食。保持12 h/12 h明暗周期,實(shí)驗(yàn)室溫度控制(23±1)℃,濕度控制50%～60%,噪聲≤60 dB,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)(SDUTCM2022030001),并按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

生理鹽水(辰欣藥業(yè)股份有限公司);丙基硫氧嘧啶(PTU,上海朝暉藥業(yè)有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H31021082);異氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司);薇婷絲滑沁香脫毛膏(利潔時(shí)家化中國(guó)有限公司);耦合劑(天津津亞科技發(fā)展有限公司);40%多聚甲醛;HE染色試劑盒(上海源葉生物科技有限公司)。粘附載玻片(中國(guó)世泰);游標(biāo)卡尺(上海美耐特實(shí)業(yè)有限公司);Ultra 超優(yōu)刀片(賽默飛);P60-VET 動(dòng)物超聲(大為寵物醫(yī)療(江蘇)有限公司);高頻曲棍球探頭10.0 MHz(大為寵物醫(yī)療(江蘇)有限公司);R580 呼吸麻醉機(jī)(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組

取Wistar大鼠雌雄各20只,隨機(jī)分2組,每組20只,即對(duì)照組(control)、模型組(model),雌雄分籠飼養(yǎng)。

1.3.2 PTU法制備結(jié)節(jié)性甲狀腺腫大鼠模型

采用Tamura的方法造模[8],模型組用生理鹽水配成0.1%的PTU溶液,每只大鼠每天按100 mg/kg連續(xù)灌服8周。對(duì)照組給與同體積的生理鹽水連續(xù)灌服8周。

1.3.3 超聲檢測(cè)分組大鼠結(jié)節(jié)性甲狀腺腫方法

(1)大鼠甲狀腺超聲定位及檢測(cè)

選用大為P60型彩色多普勒超聲儀,高頻曲棍球探頭。將老鼠頸部脫毛,充分暴露檢查部位,采用異氟烷進(jìn)行呼吸麻醉,探頭從下頜骨開始,沿頸部長(zhǎng)軸向下進(jìn)行連續(xù)橫切掃查,同時(shí)大鼠身體一側(cè)放置病理標(biāo)尺記錄位置,上線與大鼠下頜骨下緣對(duì)齊,探頭探查到舌骨時(shí)記錄距離,并繼續(xù)向下探查,待圖像中甲狀腺整體消失再記錄位置。同時(shí)記錄甲狀腺的狀況,包括甲狀腺兩葉和頸部相鄰結(jié)構(gòu)的橫向和縱向圖像。對(duì)左右側(cè)葉分別測(cè)量?jī)?nèi)外側(cè)、前后和頭尾直徑(圖1A、圖1B),并根據(jù)超聲影像結(jié)果進(jìn)行診斷分析。

圖1 超聲下大鼠甲狀腺圖像及側(cè)葉測(cè)量Figure 1 Ultrasound images of the rat thyroid gland and lateral lobe measurements

(2)HE染色法檢測(cè)大鼠甲狀腺病理形態(tài)學(xué)改變

大鼠仰臥解剖位,麻醉后從頸部正中線剪開大鼠頸部的皮膚,由胸骨剪至下頜,暴露甲狀軟骨和氣管,用眼科剪小心剪開軟骨腹面的肌肉和筋膜組織,將甲狀軟骨完全暴露(圖2A),從軟骨下插入眼科彎鑷,將軟骨和氣管撐開完全暴露甲狀腺(圖2B),放置一病理尺與老鼠身體平行,使用另一病理尺進(jìn)行測(cè)量在體甲狀腺的上下緣距下頜骨的距離(圖2C、圖2D),并記錄數(shù)值。用手術(shù)剪從喉剪開,為減少誤差,向下計(jì)數(shù)至第六氣管軟骨剪掉(圖2E、圖2F),取下后使用游標(biāo)卡尺測(cè)量甲狀腺側(cè)葉的內(nèi)外側(cè)、前后和頭尾直徑。之后浸入40%多聚甲醛固定48 h,包埋,從甲狀腺向氣管方向連續(xù)切片,每張切片厚度3 μm,進(jìn)行常規(guī)HE染色。

圖2 大鼠甲狀腺在體測(cè)量及離體圖像Figure 2 In vivo measurements and ex vivo images of the rat thyroid gland

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad prism 9.0.0進(jìn)行分析處理,大鼠甲狀腺超聲測(cè)量與體外游標(biāo)卡尺測(cè)量采用配對(duì)t檢驗(yàn),對(duì)照組與模型組的甲狀腺側(cè)葉前后、內(nèi)外、頭尾徑長(zhǎng)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P＜0.05表示差異具有顯著意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠甲狀腺的超聲定位

通過記錄超聲頸部橫切掃描甲狀腺位置參數(shù),結(jié)果顯示:對(duì)照組中,甲狀腺位于大鼠下頜骨下(2.4±0.4)～(3.3±0.5)cm的位置(圖3A),模型組中,甲狀腺位于大鼠下頜骨下(2.1±0.3)～(3.3±0.3)cm的位置(圖3B)。由此可見,在使用超聲對(duì)大鼠甲狀腺進(jìn)行掃描時(shí),位于距離大鼠下頜骨(2.3±0.5)～(3.3±0.5)cm處可探查到甲狀腺(圖3C、圖3D)。

圖3 多普勒超聲檢測(cè)大鼠甲狀腺的起、止位置Figure 3 Ultrasound detection of the starting and ending position of the thyroid gland in rats

2.2 大鼠甲狀腺的超聲測(cè)量結(jié)果及體外驗(yàn)證

取大鼠處死前最后一次超聲掃描數(shù)據(jù)與處死后體外甲狀腺游標(biāo)卡尺測(cè)量結(jié)果進(jìn)行分析,分別對(duì)甲狀腺的左葉、右葉的內(nèi)外側(cè)、前后和頭尾直徑進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn),活體超聲掃描測(cè)量與甲狀腺體外測(cè)量結(jié)果沒有顯著性差異(P＞0.05)。結(jié)果如圖4。

圖4 兩側(cè)甲狀腺超聲掃描與游標(biāo)卡尺測(cè)量各數(shù)值配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果Figure 4 Paired t-test results for each value of ultrasound scan and vernier caliper measurement of the thyroid gland on both sides

2.3 甲狀腺超聲檢查結(jié)果分析

甲狀腺由左、右兩葉和峽部組成。超聲頸前正中橫切面甲狀腺呈馬蹄型或者蝶形,頸側(cè)區(qū)縱切面呈上窄下寬的三角形,甲狀腺被膜顯示為光滑整齊的高回聲帶。對(duì)照組大鼠甲狀腺實(shí)質(zhì)回聲呈均勻偏高回聲,內(nèi)部可見血管呈管狀無回聲(圖5A)。超聲檢測(cè)模型組大鼠甲狀腺,出現(xiàn)兩側(cè)腺體不對(duì)稱性增大,其內(nèi)存在異常組織,而且甲狀腺側(cè)葉有結(jié)節(jié)無包膜,邊界較為模糊,不規(guī)整,散在有點(diǎn)狀或條狀纖維增生的強(qiáng)回聲(圖5B)。運(yùn)用t檢驗(yàn)對(duì)對(duì)照組與模型甲狀腺的前后、內(nèi)外、頭尾直徑進(jìn)行對(duì)比,得到模型組的前后、內(nèi)外直徑與對(duì)照組存在顯著性差異(P＜0.0001),頭尾直徑?jīng)]有顯著性差異(P＞0.05)。結(jié)果如圖5C～5H。

圖5 多普勒超聲影像檢測(cè)各組大鼠甲狀腺形態(tài)學(xué)特點(diǎn)分析Figure 5 Analysis of thyroid examination results analysis of morphological characteristics of thyroid gland in various groups of rats by ultrasonic imaging

2.4 甲狀腺病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果分析

對(duì)甲狀腺切片進(jìn)行HE染色后,在×400顯微鏡下觀察到對(duì)照組大鼠甲狀腺組織濾泡大小均勻,濾泡腔內(nèi)膠質(zhì)均勻,上皮細(xì)胞排列規(guī)整,可見少量毛細(xì)血管(圖6A);與對(duì)照組相比,模型組大鼠甲狀腺濾泡大小不規(guī)則,且上皮細(xì)胞增生明顯,排列紊亂,膠質(zhì)壓縮分布不均(圖6B)。模型組大鼠甲狀腺組織改變符合結(jié)節(jié)性甲狀腺腫病理檢查診斷[9],與超聲診斷一致。

圖6 HE染色檢測(cè)各組大鼠甲狀腺病理學(xué)特點(diǎn)分析Figure 6 HE staining was used to detect the pathological characteristics of thyroid in various groups

3 討論

近些年來,甲狀腺基礎(chǔ)研究較早些年投入巨大,且不斷開發(fā)出新的甲狀腺動(dòng)物模型[10],發(fā)表的相關(guān)文章數(shù)量不斷增加(圖7A、圖7B)。目前國(guó)內(nèi)結(jié)節(jié)性甲狀腺腫動(dòng)物模型多以大鼠為主,制作方法多樣,其原理都是通過不同方式誘使大鼠攝入碘降低,導(dǎo)致甲狀腺腫,Sun等[11]通過藥物誘導(dǎo)雌性SD大鼠含PTU的飲用水6周;Alayoubi等[12]通過喂食低碘鼠糧;Li等[13]喂養(yǎng)雄性Wistar大鼠甲減組含MMI的飲用水12周等來制作甲狀腺腫動(dòng)物模型。

圖7 發(fā)表文章年度趨勢(shì)及類型Figure 7 Annual trends and types of published articles

結(jié)節(jié)性甲狀腺腫動(dòng)物模型目前缺乏經(jīng)濟(jì)、高效的評(píng)價(jià)方法。實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)大鼠模型使用超聲診斷的極少,多以處死大鼠后、取甲狀腺進(jìn)行HE染色,因其不可逆轉(zhuǎn)性使這種方法存在明顯不足。而超聲診斷結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的靈敏度、特異性和安全性較高,該方法具有方便、經(jīng)濟(jì)、快速、無創(chuàng)等優(yōu)勢(shì),且是臨床人群診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。

本實(shí)驗(yàn)探討超聲影像技術(shù)在大鼠結(jié)節(jié)性甲狀腺腫評(píng)價(jià)方面的應(yīng)用。通過PTU連續(xù)灌胃8周,建立動(dòng)物模型,再結(jié)合超聲和體外檢測(cè)對(duì)甲狀腺的大小、病理情況進(jìn)行對(duì)照,結(jié)果一致。證明了超聲準(zhǔn)確診斷大鼠結(jié)節(jié)性甲狀腺腫。同時(shí)通過此實(shí)驗(yàn)明確了超聲下大鼠甲狀腺定位參數(shù),為后續(xù)研究者的工作提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)參考。

本實(shí)驗(yàn)利用超聲技術(shù)來評(píng)價(jià)結(jié)節(jié)性甲狀腺腫大鼠動(dòng)物模型的建立,并利用病理學(xué)方法驗(yàn)證了其檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性,從而證實(shí)了超聲技術(shù)能夠較好的反映出結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的形態(tài),避免了在造模過程中對(duì)活體動(dòng)物采樣所造成的損傷以及處死動(dòng)物進(jìn)行病理學(xué)檢測(cè)等缺點(diǎn),影響模型的進(jìn)一步研究。該技術(shù)的應(yīng)用為今后甲狀腺疾病動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)建立提供了一種更方便的鑒定方法,同時(shí)也方便了缺乏超聲經(jīng)驗(yàn)的研究人員更快的操作超聲檢測(cè)大鼠甲狀腺疾病,為進(jìn)一步研究甲狀腺疾病動(dòng)物模型的發(fā)病機(jī)制和藥物篩選提供了保障。