黎凱愷張遠威張念杰尹 碩何 念萬 磊陳 旭楊雪峰

(遵義醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院,貴州 遵義 563006)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一,也是導(dǎo)致癌癥死亡的重要原因,結(jié)直腸癌確診時已經(jīng)處于中晚期,轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)是導(dǎo)致其死亡的重要原因[1-3]。深入研究結(jié)直腸癌的發(fā)生及進展的分子機制,篩選結(jié)直腸癌早期診斷的候選靶點,是結(jié)直腸癌防治的關(guān)鍵。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),血清壬基酚(nonylphenol, NP)濃度在結(jié)直腸癌組顯著高于正常組[4];體內(nèi)、體外研究均發(fā)現(xiàn)NP可激活ERK通路,促進結(jié)直腸癌細胞增殖[5-7]。NP是環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(endocrine disrupting compounds, EDCs)典型代表,主要是由烷基酚聚氧乙醚(alkylphenol ethoxylates,APE)分解產(chǎn)生,APE廣泛應(yīng)用于塑料制品、紡織品、農(nóng)藥以及洗滌劑、油漆等家庭用品,生活中隨處可見。由于NP具有親脂性,導(dǎo)致其極易在組織和器官中聚集,造成內(nèi)分泌紊亂、免疫異常、生殖功能障礙和腫瘤的發(fā)生[8-9]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是腫瘤侵襲和遷移的重要原因[10]。NP促進vimentin及抑制E-cadherin的表達而促進卵巢癌的侵襲及遷移[11]。NP是否影響結(jié)直腸癌的侵襲及遷移,目前還未見報道。課題組通過轉(zhuǎn)錄組測序分析發(fā)現(xiàn),SRXN1(sulfiredoxin-1)在NP干預(yù)后的人結(jié)直腸癌細胞COLO205中被顯著上調(diào)。SRXN1屬于保守的內(nèi)源性sulfiredoxin抗氧化家族的成員之一,具有調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)、發(fā)揮神經(jīng)保護作用[12]。最近研究發(fā)現(xiàn),SRXN1的異常表達可促進卵巢癌及肝癌細胞的增殖、侵襲和遷移[13-14]。本文通過臨床及細胞水平,觀察NP與結(jié)直腸癌增殖、侵襲及遷移的關(guān)系及與SRXN1相關(guān)性,初步闡明NP通過SRXN1促進結(jié)直腸癌增殖、侵襲和遷移作用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞

結(jié)直腸癌COLO205細胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫,由本實驗室保存。

1.1.2 結(jié)直腸癌臨床樣本

30對結(jié)直腸癌患者腫瘤及配對的癌旁組織均為2020年1月～2020年12月在我院胃腸外科住院,經(jīng)腸鏡病理檢查明確診斷為結(jié)直腸癌患者?；颊吣挲g54～77歲,平均年齡60.00歲,其中男、女各15例。腫瘤及其配對的癌旁樣本,取材后,等分成兩份,一份置于4%多聚甲醛固定,經(jīng)梯度乙醇脫水后,石蠟包埋;一份置于液氮保存。每位患者均簽署知情同意書,協(xié)議由遵義醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會審查批準(遵醫(yī)倫審[2019]H-008號)。

1.2 主要試劑與儀器

壬基酚購自中國Aladdin公司(貨號:84852-15-3);CCK-8(貨號:CA1210)及免疫組化(貨號:SP0041)檢測試劑盒購自于北京索萊寶科技有限公司;qRT-PCR檢測試劑盒購自于美國Thermofisher公司(貨號:4472903);Anti-ERK1+ERK2 antibody(貨號:ab109282)、Anti-ERK1+ERK2 (phospho T202 + Y204) antibody(貨 號:ab201015)、Anti-PI 3 Kinase p85αantibody(貨號:ab191606)、Anti-PI 3 Kinase p85α (phospho Y607) antibody(貨 號:ab182651)購自于英國 abcam 公司;Anti-Akt antibody(貨號:60203-2-Ig)、Anti-SRXN1 antibody(貨號:14273-1-AP)、Anti-Phospho-AKT (Ser473) antibody(貨號:80455-1-RR)、Anti-Wnt3a antibody(貨號:26744-1-AP)、Anti-β-catenin antibody(貨號:51067-2-AP)及Anti-GAPDH antibody(貨號:60004-1-Ig)購自于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。si-SRXN1(si-SRXN1-1: 5’-GCCGGCUCCAAAUUCCC AATT-3’;si-SRXN1-2:5’-GGACUACAUUCAGCUG CAATT-3’)及 si-NC(negative control)(5’-TAATTGAUUGGGTTAAAGGCC-3’)購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。qRT-PCR引物SRXN1(Forward:5’-CAGGGAGGTGACTACTTCTACTC-3’;Reverse:5’-CAGGTACACCCTTAGGTCTGA-3’)及GAPDH引物(Forward:5’-GGAGCGAGATCCC TCCAAAAT-3’;Reverse:5’-GGCTGTTGTCATAC TTCTCATGG-3’)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

HERAcell 150i1型CO2培養(yǎng)箱購自于美國Thermo公司;Lightcycler480型qRT-PCR儀購自于美國Roche公司;NIKON DS-U3正置熒光顯微鏡購自于日本尼康;Multiskan Sky全波長酶標儀購自于美國Thermo公司;FACS Calibur 流式細胞儀購自于美國BD公司;PowerPace Basic型電泳儀購自美國Bio-rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

COLO205細胞復(fù)蘇后,分別置于RPMI-1640+10%胎牛血清的培養(yǎng)基中,37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細胞聯(lián)合度達到80%～90%時,按照1∶2～1∶3的比例傳代,備用。

1.3.2 RNA-seq分析

將COLO205細胞隨機分成空白對照組(Control)、壬基酚(10-6mol/L)組(NP),處理24 h(NP濃度及作用時間參考[5-7])。收集細胞,樣品經(jīng)過RNA抽提、純化、建庫之后,采用第二代測序技術(shù)(next-generation sequencing,NGS),基于Illumina測序平臺,對這些文庫進行雙末端(Paired-end,PE)測序;篩選差異表達基因(篩選標準:|log2FoldChange|＞1,P＜0.05)。測序及初步分析委托上海派森諾生物科技股份有限公司協(xié)助完成。

1.3.3 TCGA分析腸癌中SRXN1表達

UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)是基于癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas, TCGA)數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的在線分析平臺。通過UALCAN數(shù)據(jù)庫分析SRXN1在腸癌中的表達情況,其中包括腫瘤樣本241個,正常樣本41個。

1.3.4 qRT-PCR檢測SRXN1表達

將COLO205細胞隨機分成空白對照組(Control)、壬基酚(10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L)組(NP),干預(yù)24 h后,收集細胞,提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,qRT-PCR檢測SRXN1的表達。同時提取結(jié)直腸癌患者腫瘤及其配對的癌旁組織RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后,qRT-PCR檢測SRXN1的表達變化。數(shù)據(jù)以2-△△CT表示;△CT=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值,△△CT=實驗組(Ct(目的基因)- Ct(GAPDH))-對照組(Ct(目的基因)- Ct(GAPDH))。

1.3.5 免疫組化檢測結(jié)直腸癌組織SRXN1表達

結(jié)直腸癌患者腫瘤及其配對的癌旁組織利用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋切片,脫蠟、水化及抗原修復(fù)后,5%BSA抗原阻斷,滴加SRXN1抗體(1∶200),4℃孵育過夜;PBS清洗3次,每次5 min,滴加HRP標記的二抗,37℃孵育30 min,PBS清洗3次,每次5 min;DAB顯色,蘇木素復(fù)染3 min,1%鹽酸乙醇分化。利用徠卡顯微鏡(DM1000)采集照片。利用Image-pro plus 6.0分析軟件計算每個樣本中SRXN1表達的平均光密度值(IOD)。

1.3.6 細胞分組及轉(zhuǎn)染

取對數(shù)生長期的COLO205細胞,1×104cells/mL的細胞量傳于6孔板,將COLO205細胞隨機分成:空白對照組(Control)、SRXN1干擾對照組(si-NC)、壬基酚(10-6mol/L)組(NP)、SRXN1干擾組(si-SRXN1)、壬基酚+SRXN1干擾組(NP+si-SRXN1)。si-NC及si-SRXN1按照Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說明書轉(zhuǎn)染入COLO205細胞12 h后,再利用NP干預(yù)24 h。

1.3.7 CCK-8檢測

按照CCK-8試劑盒操作說明,每孔加入10 μL CCK-8溶液,在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h,用酶標儀(450 nm)檢測各組細胞的吸光值(OD值)。

1.3.8 克隆形成實驗檢測

以每皿200個COLO205細胞分別接種于37℃預(yù)溫10 mL培養(yǎng)液的皿中,并輕輕轉(zhuǎn)動,使細胞分散均勻,置37℃,5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d。棄去上清液,用PBS小心清洗2次。4%多聚甲醛固定15 min,棄去固定液,加適量吉姆薩染色液(GIMSA)染色30 min,然后洗去染色液。Nikon顯微鏡(TS100-F)拍照后,計算克隆形成數(shù)量。

1.3.9 Transwell檢測

COLO205細胞血清饑餓24 h后,將細胞按照5×104接種到Transwell小室上層內(nèi),下層的24孔板中加入含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后;每孔加入1 mL 4%多聚甲醛溶液,室溫固定10 min;吸去固定液,用1×PBS清洗,加入1 mL 0.5%結(jié)晶紫溶液染色30 min,1×PBS洗3次,每次3～5 min;用棉簽小心擦去Transwell小室內(nèi)沒有遷移的細胞,置于200×顯微鏡下觀察,計數(shù)每個視野中的細胞數(shù)。

1.3.10 Western blot檢測

收集細胞,利用RIPA裂解,冰上孵育20 mim后,4℃,10 000～14 000 r/min離心3～5 min,取上清,BCA定量,每孔按照20 μg蛋白量上樣,SDSPAGE電泳后,轉(zhuǎn)膜,分別以兔抗SRXN1(1∶800)、ERK1/2(1∶800)、p-EKR1/2(1∶800)、PI3K(1∶1000)、p-PI3K(1∶800)、Akt(1∶1000)、p-Akt(1∶800)、Wnt3a(1∶1000)、β-catenin(1∶1000)及GAPDH(1∶10000),4℃、孵育過夜后,TBST漂洗3次,加入HRP酶標抗兔二抗。加入ECL發(fā)光液膜置于全自動化學(xué)發(fā)光分析儀中掃描,通過TANON GIS軟件讀取相關(guān)條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

所有實驗均重復(fù)3次,數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差(±s)表示。實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 6.0分析及繪圖。多組間數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析,組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗,組織標本中SRXN1表達采用配對t檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NP對結(jié)直腸癌COLO205細胞中SRXN1表達的影響

RNA-seq分析發(fā)現(xiàn),NP引起COLO205細胞中154個基因表達異常,上調(diào)基因107個,下調(diào)基因57個,其中SRXN1的log2FoldChange為2.17倍(圖1A)。與空白對照組(Control)比較,不同濃度NP(10-7、10-6、10-5mol/L)分別作用COLO205細胞后,SRXN1 mRNA及SRXN1蛋白表達均顯著升高(均P＜0.05)(圖1B、圖1C)。與Control組比較,SRXN1特異性si-SRXN1-1、si-SRXN1-2均顯著抑制SRXN1表達(t=7.23、5.14,均P＜0.01),si-SRXN1-1的抑制效果最明顯,后續(xù)實驗均使用si-SRXN1-1特異性抑制SRXN1(圖1D～圖1F)。與si-SRXN1-1組比較,不同濃度的NP(10-7、10-6、10-5mol/L)分別作用COLO205細胞后,SRXN1 mRNA及SRXN1蛋白表達均顯著升高(P＜0.01)(圖1G～圖1I)。以上結(jié)果說明NP能夠促進結(jié)直腸癌COLO205細胞中SRXN1的表達。

圖1 SRXN1在COLO205細胞中的表達Figure 1 Expression of SRXN1 in COLO205 cells

2.2 SRXN1在結(jié)直腸癌中的表達分析

TCGA分析發(fā)現(xiàn),在腫瘤樣本中,SRXN1的表達顯著高于正常腸組織(P＜0.01)(圖2A)。qRT-PCR檢測收集的結(jié)直腸癌腫瘤組織樣本中SRXN1 mRNA表達量顯著高于癌旁組織(t=10.23,P＜0.01)(圖2B);IHC檢測分析發(fā)現(xiàn),結(jié)直腸癌腫瘤組織樣本中SRXN1的表達顯著高于癌旁組織(t=6.64,P＜0.01)(圖2C、圖2D)。以上結(jié)果說明,在結(jié)直腸癌中,SRXN1的表達顯著升高。

圖2 SRXN1在結(jié)直腸癌中的表達Figure 2 Expression of SRXN1 in colorectal cancer

2.3 SRXN1抑制后,NP對結(jié)直腸癌細胞增殖影響

CCK-8檢測發(fā)現(xiàn),與Control組比較,NP組細胞活力顯著高于Control組(t=4.64,P＜0.01),而si-SRXN1組細胞活力顯著低于Control組;與si-SRXN1組比較,NP+si-SRXN1組細胞活力顯著增加(t=5.72,P＜0.01)(圖3A)。與Control組比較,NP組克隆數(shù)顯著高于Control組(t=5.64,P＜0.01),si-SRXN1組顯著低于Control組(t=10.76,P＜0.01);與si-SRXN1組比較,NP+si-SRXN1克隆數(shù)顯著增多(t=4.24,P＜0.05)(圖3B、圖3C)。

圖3 COLO205 細胞增殖能力檢測Figure 3 COLO205 cell proliferation capacity assay

2.4 SRXN1抑制后,NP對結(jié)直腸癌細胞侵襲及遷移能力的影響

NP組細胞侵襲數(shù)著高于Control組(t=2.31,P＜0.01);si-SRXN1組COLO205細胞侵襲數(shù)顯著低于Control組(t=4.99,P＜0.01)。與si-SRXN1組比較,NP+si-SRXN1能夠促進細胞的侵襲(t=2.97,P＜0.01)(圖4A～圖4C)。NP組COLO205細胞遷移數(shù)顯著高于Control組(t=2.45,P＜0.01);si-SRXN1組COLO205細胞遷移數(shù)顯著低于Control組(t=4.19,P＜0.01)。與si-SRXN1組比較,NP+si-SRXN1能夠促進細胞的遷移(t=2.07,P＜0.01)(圖4A～圖4C)。

圖4 COLO205細胞侵襲及遷移能力變化Figure 4 Changes in invasion and migration ability of COLO205 cells

2.5 SRXN1抑制后,NP對增殖、侵襲相關(guān)通路激活的影響

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)NP可通過激活ERK1/2促進結(jié)直腸癌細胞增殖[5-7]。PI3K/Akt、Wnt/βcatenin在多種腫瘤中異常激活,調(diào)節(jié)腫瘤的增殖及EMT。Western blot檢測發(fā)現(xiàn):與Control組比較,NP顯 著 促 進p-ERK1/2、p-PI3K、p-Akt、Wnt3a、βcatenin的表達(t=3.34、3.04、4.80、6.81、5.71,均P＜0.01),而si-SRXN1組抑制p-ERK1/2、p-PI3K、p-Akt、Wnt3a、β-catenin的 表 達(t=13.34、8.75、11.74、8.65、12.47,均P＜0.01);與si-SRXN1組比較,NP+si-SRXN1組中p-ERK1/2(t=4.80,P＜0.01)、p-PI3K(t=3.82,P＜0.01)、p-Akt(t=3.78,P＜0.05)、Wnt3a(t=4.48,P＜0.05)、β-catenin(t=6.90,P＜0.05)的表達顯著升高。以上結(jié)果說明NP能夠促進ERK1/2、PI3K/Akt、Wnt/β-catenin通路的激活,而SRXN1顯著抑制上述通路的激活影響COLO205細胞的增殖及侵襲能力(圖5)。

圖5 Western blot檢測PI3K/Akt、ERK、Wnt3a/β-catenin通路表達Figure 5 Expression of PI3K/Akt, ERK1/2 and Wnt3a/β-catenin pathways detected by Western blot

3 討論

隨著現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展,大量化學(xué)物質(zhì)釋放到自然環(huán)境中,造成極大的環(huán)境污染,其中一類外源性化學(xué)物質(zhì)可模仿或部分模仿性激素,并通過與性激素受體結(jié)合或影響細胞信號途徑等方式發(fā)揮毒性作用,這類物質(zhì)被稱為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(EDCs)亦稱環(huán)境雌激素[15]。研究發(fā)現(xiàn)EDCs能夠引起人類生育能力降低和誘發(fā)多種疾病,如肥胖癥、糖尿病和癌癥[16]。NP是EDCs的典型代表,由于NP具有親脂性,導(dǎo)致其極易在組織和器官中聚集,與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[8-9]。深入闡明NP與腫瘤的發(fā)生、進展的關(guān)系,對腫瘤的防治具有重要的意義。

腫瘤的發(fā)生及進展受氧化應(yīng)激水平調(diào)節(jié),活性氧通過調(diào)節(jié)炎癥、線粒體功能、激活MAPK及AMPK等通路促進腫瘤的發(fā)生及進展[17-18]。NP能夠引起機體氧化應(yīng)激水平的失衡,促進ROS及炎癥因子的釋放促進心臟毒性、胃粘膜炎癥、卵巢顆粒細胞的凋亡和自噬[19-20]。RNA-seq及qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),NP引起SRXN1表達顯著上調(diào)。SRXN1屬于保守的內(nèi)源性Sulfiredoxin 抗氧化家族的成員之一,可通過調(diào)節(jié)活性氧的釋放,發(fā)揮神經(jīng)保護作用[12]。最近研究發(fā)現(xiàn),SRXN1 在多種惡性腫瘤中具有促進增殖及轉(zhuǎn)移的能力[21-22],SRXN1通過影響過氧化物酶活性,調(diào)節(jié)ROS水平,以使組織免受氧化應(yīng)激損傷,進而促進腫瘤細胞增殖及EMT的發(fā)生[23-24]。本文研究發(fā)現(xiàn),抑制SRXN1 的表達后,結(jié)直腸癌COLO205細胞的增殖、侵襲及遷移能力顯著降低,而NP則得到相反的結(jié)果。暗示NP促進結(jié)直腸癌細胞增殖、侵襲及遷移可能與SRXN1表達相關(guān),但NP如何影響SRXN1表達以及與氧化應(yīng)激的關(guān)系,還需通過實驗進一步研究。

調(diào)節(jié)細胞增殖及轉(zhuǎn)移的主要通路為ERK1/2、PI3K/Akt及Wnt/β-catenin等,ERK1/2、PI3K/Akt在多種腫瘤中異常激活,調(diào)節(jié)腫瘤的增殖、分化及EMT[25]。ERK1/2的異常激活,促進增殖相關(guān)蛋白(CyclinD1、C-myC、PCNA)的表達,促進結(jié)直腸癌細胞增殖[7],抑制PI3K/Akt通路后,顯著抑制卵巢癌細胞EMT及增殖[26]。SRXN1可通過激活Wnt/βcatenin[27]、ERK1/2[28]及PI3K/Akt[29]通路。通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn),NP顯著促進p-ERK1/2、p-Akt及Wnt3a、β-catenin的表達,暗示NP能夠顯著激活ERK1/2、PI3K/Akt及Wnt/β-catenin通路;SRXN1抑制后,NP對ERK1/2、PI3K/Akt及Wnt/βcatenin通路的激活作用被減弱,暗示NP激活ERK1/2、PI3K/Akt及Wnt/β-catenin通路與SRXN1表達相關(guān)。

綜上所述,NP可促進SRXN1的表達,調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移,其分子機制與ERK1/2、PI3K/Akt及Wnt/β-catenin等通路激活有關(guān);但NP與SRXN1具體調(diào)控機制,還有待進一步研究。