許建紅, 陳元鋒, 竺 青, 劉麗麗, 劉 虹, 譙銘銘

(山東省血液中心 機(jī)采科, 山東 濟(jì)南, 250014)

原發(fā)性免疫性血小板減少癥(ITP)又稱特發(fā)性血小板減少性紫癜，是一種免疫性出血性疾病，是由于病毒感染等因素使單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)遭到破壞，使得血小板減少而引發(fā)的疾病[1]。ITP臨床癥狀主要表現(xiàn)為皮膚出現(xiàn)出血點(diǎn)，大多數(shù)表現(xiàn)為皮膚黏膜出血，嚴(yán)重者可出現(xiàn)內(nèi)臟、顱內(nèi)出血，嚴(yán)重危及患者生命健康。目前，臨床通過使用糖皮質(zhì)激素等藥物治療ITP, 但治療效果較差，故研究與ITP有關(guān)的標(biāo)志物及其在患者預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值至關(guān)重要[2-4]。長鏈非編碼RNAs(lncRNAs)在免疫性疾病中具有重要功能[5-6], 其在細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用[7], TMEVPG1作為一種lncRNA, 主要在胸腺和脾臟中表達(dá)，與干擾素-γ(IFN-γ)的調(diào)節(jié)有關(guān)。研究[8]表明, ITP患者外周血單核細(xì)胞中l(wèi)ncRNA TMEVPG1呈低表達(dá)，并參與ITP的發(fā)生與發(fā)展。近年來，關(guān)于lncRNA TMEVPG1與ITP疾病關(guān)系的研究較少，因此本研究通過檢測(cè)lncRNA TMEVPG1在ITP患者中的表達(dá)變化，分析其在患者預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年3月—2020年6月收治的126例ITP患者作為研究組，其中男66例，女60例，年齡30～35歲，平均(32.50±2.06)歲。根據(jù)《成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷與治療中國專家共識(shí)(2016版)》[9]中治療12個(gè)月后預(yù)后情況，將ITP患者分為預(yù)后不良組31例(血小板計(jì)數(shù)<100×109/L, 伴有出血)和預(yù)后良好組95例(血小板計(jì)數(shù)≥100×109/L, 未出血)。另選取同期體檢的125例健康者作為對(duì)照組，其中男64例，女61例，年齡31～36歲，平均(33.50±2.33)歲。納入標(biāo)準(zhǔn): ① 符合《成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷與治療中國專家共識(shí)(2016版)》中關(guān)于ITP的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]者; ② 血常規(guī)檢查顯示血小板計(jì)數(shù)減少(至少2次檢查)者; ③ 所有ITP患者及其家屬均知情同意，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn): ① 其他繼發(fā)性血小板減少癥者; ② 合并心臟、肝臟等重要器官功能障礙者; ③ 存在精神疾病者; ④ 合并惡性腫瘤或其他內(nèi)分泌疾病者; ⑤ 臨床資料不全者。研究經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 一般資料收集: 收集所有受試者臨床資料，包括性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、吸煙史、飲酒史、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)、IFN-γ、白細(xì)胞介素(IL)-2、IL-4、IL-10。

1.2.2 樣品采集: ITP患者入院次日清晨和體檢者體檢當(dāng)日采集外周血4 mL，將樣本置于EDTA抗凝管中，通過密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC), 低溫保存待測(cè)。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)lncRNA TMEVPG1的表達(dá)水平: 取所有樣本，加入1 mL Trizol試劑(日本TaKaRa公司)提取總RNA, 采用Smartspec plus分光光度儀(美國Bio-Rad公司)測(cè)定RNA純度和濃度，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA, 采用qRT-PCR對(duì)lncRNA TMEVPG1進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列見表1。lncRNA TMEVPG1反應(yīng)條件為: 94 ℃, 5 min; 95 ℃, 15 s; 60 ℃, 30 s; 70 ℃, 30 s; 39個(gè)循環(huán)，以GAPDH作為內(nèi)參。采用2-△△CT法分析lncRNA TMEVPG1的表達(dá)水平。lncRNA TMEVPG1、GAPDH引物序列由北京英格恩生物科技有限公司構(gòu)建; 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(型號(hào)ABI 7500)購自美國ABI公司。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 2組臨床資料比較

2組患者性別、年齡、BMI、吸煙史、飲酒史、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)等資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); 研究組血小板計(jì)數(shù)、IL-4、IL-10低于對(duì)照組, IFN-γ、IL-2高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見表2。

表2 2組臨床資料比較

2.2 2組lncRNA TMEVPG1水平比較

對(duì)照組lncRNA TMEVPG1表達(dá)水平為(1.03±0.05), 研究組lncRNA TMEVPG1表達(dá)水平為(0.57±0.07)。與對(duì)照組比較，研究組患者lncRNA TMEVPG1水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 不同預(yù)后ITP患者lncRNA TMEVPG1水平比較

預(yù)后不良組患者lncRNA TMEVPG1水平為(0.36±0.05), 低于預(yù)后良好組的(0.63±0.08), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 ITP患者lncRNA TMEVPG1與血小板計(jì)數(shù)、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10的相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示, lncRNA TMEVPG1與血小板計(jì)數(shù)、IL-10、IL-4呈正相關(guān)(r=0.729、0.382、0.227,P<0.05), 與IL-2、IFN-γ呈負(fù)相關(guān)(r=-0.252、-0.542,P<0.05), 見圖1。

2.5 COX回歸分析探討ITP預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素

將ITP患者預(yù)后作為因變量，以血小板計(jì)數(shù)、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、lncRNA TMEVPG1水平作為自變量，進(jìn)行COX回歸分析，結(jié)果顯示lncRNA TMEVPG1水平降低是ITP患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素(P<0.05), 見表3。

表3 COX回歸分析影響ITP患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素

3 討 論

ITP是一種以血小板減少為特征的血液系統(tǒng)疾病，血小板減少極易引起皮膚黏膜出血、消化道出血，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，甚至威脅患者生命健康。研究[10]報(bào)道, ITP具有較高的發(fā)生率。目前，臨床使用糖皮質(zhì)激素、丙種球蛋白等藥物治療ITP, 雖然可快速緩解癥狀，但仍有部分患者病情復(fù)發(fā)，且長時(shí)間使用激素藥物可形成激素依賴，因此研究與ITP有關(guān)的標(biāo)志物及其在患者預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值至關(guān)重要[11-12]。

隨著對(duì)lncRNAs研究的深入，發(fā)現(xiàn)其在免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[13]。IL-2、IFN-γ是Th1型細(xì)胞因子，具有促進(jìn)炎癥的作用, lncRNA TMEVPG1位于含有IFN-γ基因的細(xì)胞因子基因簇中，與IFN-γ的調(diào)節(jié)有關(guān)[14]。研究[15]表明, lncRNA TMEVPG1在ITP中表達(dá)下調(diào)，推測(cè)lncRNA TMEVPG1可能通過正向調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)抑制疾病的發(fā)生發(fā)展。lncRNA TMEVPG1異常表達(dá)與干燥綜合征患者自身抗體有關(guān)，其表達(dá)水平與Th1細(xì)胞的比例有關(guān)[16]。IL-4、IL-10是Th2型細(xì)胞因子，可抑制Th1型細(xì)胞因子引發(fā)的炎癥反應(yīng)，具有抑制炎性反應(yīng)的作用，臨床試驗(yàn)[4, 17]結(jié)果證明IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10參與ITP自身免疫疾病的發(fā)展過程。lncRNA TMEVPG1因IFN-γ感染而在機(jī)體內(nèi)表達(dá)失調(diào)，并參與抗病毒免疫反應(yīng)[18-19]。王羨等[14]研究結(jié)果表明, lncRNA TMEVPG1在Th1細(xì)胞的IFN-γ表達(dá)中起作用，進(jìn)而參與免疫性疾病的發(fā)生。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，研究組患者lncRNA TMEVPG1水平降低，經(jīng)Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示, lncRNA TMEVPG1與血小板計(jì)數(shù)、IL-4、IL-10呈正相關(guān)，與IFN-γ、IL-2呈負(fù)相關(guān)，提示lncRNA TMEVPG1異常低表達(dá)可能與ITP的發(fā)生發(fā)展有關(guān); 預(yù)后不良組患者lncRNA TMEVPG1水平明顯低于預(yù)后良好組，提示lncRNA TMEVPG1低表達(dá)患者預(yù)后不良; COX回歸分析表明, lncRNA TMEVPG1降低是ITP患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示lncRNA TMEVPG1可作為ITP患者預(yù)后評(píng)估的有效指標(biāo)。

綜上所述, ITP患者lncRNA TMEVPG1水平降低與患者不良預(yù)后有關(guān)，可作為ITP患者預(yù)后評(píng)估的輔助指標(biāo)。但本研究存在一定的不足，如樣本量少，只探討了lncRNA TMEVPG1在ITP患者中表達(dá)的變化，未闡明其在疾病中的具體作用機(jī)制，還需進(jìn)一步深入研究。