王加眾，杜福民，王海洲，潘秋霞

（1.山東省日照市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，山東 日照 276826；2.山東省日照市畜牧獸醫(yī)管理服務(wù)中心，山東 日照 276826）

1 前言

蜂蜜是蜜蜂采集花蜜釀造而成的一種甜味且高營(yíng)養(yǎng)的物質(zhì)。蜂蜜一般分為兩大類，即花蜜和蜜露蜜[1]?；鄣膩?lái)源是花的花蜜，而蜜露蜜是昆蟲吸食植物液汁后排出的甜物質(zhì)，后經(jīng)蜜蜂采集釀制而成的蜂蜜。蜂蜜的主要成分是碳水化合物，大部分為單糖（果糖和葡萄糖），少量為多糖（蔗糖）和低聚糖。除了糖，蜂蜜中還含有微量的有機(jī)酸、蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)。另外，由于蜂蜜中有機(jī)酸（0.5%左右）和游離氨基酸（0.05%～0.1%）的含量過多，致使蜂蜜呈微酸性，對(duì)蜂蜜的口感及理化性質(zhì)起到重要影響[2]。

2 蜂蜜中主要摻假物

蜂蜜是一種天然生產(chǎn)的有機(jī)甜味劑，無(wú)需任何加工就可以直接食用。一些不法商人為了提高蜂蜜的產(chǎn)量，通過在天然蜂蜜中添加便宜的甜味劑，從中牟取暴利。蜂蜜中最常見的摻假物有高果糖玉米糖漿（HFCS）、玉米糖漿（COSS）、倒置糖漿（ISS）和蔗糖糖漿（CASS）[3]。在不同的地域中，摻假物的隱蔽性是選擇它們與否的決定因素。歐洲國(guó)家的蜂蜜通常摻入果糖和菊粉，因?yàn)榧冋涿壑幸埠泄呛途辗鄣闹饕浅煞?，不容易鑒別。大米糖漿和麥芽糖糖漿是我國(guó)蜂蜜中最常見的摻假物，也是因?yàn)樗鼈冸y以用普通的分析方法檢測(cè)。值得注意的是，蜂蜜摻假不僅限于在天然蜂蜜中直接添加糖，還可以在主要花蜜流動(dòng)季節(jié)用濃縮糖液間接喂養(yǎng)蜂群。由于蜜蜂在食用糖漿后所進(jìn)行的加工過程以及糖轉(zhuǎn)化后所生產(chǎn)產(chǎn)品的性質(zhì)具有不明確性，這種不負(fù)責(zé)任的行為不僅危害到消費(fèi)者的福利，還可能導(dǎo)致健康問題，尤其對(duì)兒童和老年人的影響尤為嚴(yán)重。另外，喂食玉米糖漿的蜜蜂死亡率特別高，這可能是因?yàn)橛衩滋菨{中含有大量的羥甲基糠醛，對(duì)蜜蜂來(lái)說是有毒的。將昂貴的蜂蜜與便宜的蜂蜜混合是蜂蜜摻假的另一種形式，一般發(fā)生在昂貴的金合歡蜂蜜上，這種蜂蜜通常與便宜的油菜蜂蜜混合在一起，以獲得更高的利潤(rùn)。

3 蜂蜜中摻假物檢測(cè)方法

3.1 穩(wěn)定碳同位素比值分析

穩(wěn)定碳同位素比值分析（Stable Carbon Isotope Ratio Analysis，SCIRA）是公認(rèn)的蜂蜜摻假檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法之一，可用于區(qū)分不同植物來(lái)源的蜂蜜。SCIRA 對(duì)蜂蜜檢測(cè)的原理是基于單子葉植物（甘蔗和玉米）和雙子葉植物（蜜蜂采集花蜜的開花植物）具有不同的13C/12C 同位素比值，這是由于植物進(jìn)行光合作用循環(huán)的結(jié)果，通常以δ13C 表示，以‰表示與VPDB（Vienna Pee Dee Belemnite）內(nèi)標(biāo)的偏差。C3 植物通過還原型戊糖磷酸循環(huán)進(jìn)行光合作用的δ13C 值在-21‰到-32‰之間，而C4 植物通過二羧酸循環(huán)進(jìn)行光合作用的δ13C 值在-12‰到-19‰之間。根據(jù)White and Winters 制定的標(biāo)準(zhǔn)，δ13C 值超過-23.5‰的蜂蜜可能摻假[4]，因?yàn)槊鄯淦脧腃3 植物中獲取花蜜，極少數(shù)從C4 植物中獲取花蜜，但若蜜蜂從C4 植物采集花蜜時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性。為了避免這種情況，通常在估算δ13C 值之前使用高效液相色譜分離蜂蜜中存在的單糖，但高效液相色譜分離成本高、樣品制備繁瑣耗時(shí)、蛋白質(zhì)提取過程長(zhǎng)，不適合對(duì)大量蜂蜜樣品進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

3.2 色譜技術(shù)

3.2.1 薄層色譜法

薄層色譜法（Thin Layer Chromatography，TLC）是一種鑒別天然蜂蜜中未知化學(xué)成分存在的簡(jiǎn)單方法。例如，便宜的高果糖玉米糖漿的單糖組成與天然蜂蜜相當(dāng)，但純蜂蜜的薄層色譜顯示1 或2 個(gè)Rf 值大于0.35 的藍(lán)/ 灰點(diǎn)，而摻假的高果糖玉米糖漿蜂蜜顯示額外的斑點(diǎn)或明顯的藍(lán)色條紋[5]。盡管TLC可以簡(jiǎn)單快速地檢測(cè)蜂蜜中是否添加工業(yè)糖漿，但是其可靠性需要進(jìn)一步評(píng)估。此外，隨著摻假物種類增多，如甜菜糖、倒置糖和大米糖漿等，TLC 檢測(cè)摻假蜂蜜的可靠性有待進(jìn)一步加強(qiáng)。

3.2.2 氣相色譜分析

氣相色譜（Gas Chromatography，GC）是一種直接對(duì)揮發(fā)性和半揮發(fā)性化合物分析的技術(shù)，廣泛應(yīng)用于準(zhǔn)確檢測(cè)蜂蜜中單糖、雙糖、三糖和摻假物（如HFCS、HFIS 和ISS），現(xiàn)已成為第一個(gè)以菊糖為標(biāo)記物成功檢測(cè)高果糖玉米糖漿的技術(shù)[6]。

3.2.3 液相色譜分析

液相色譜（Liquid Chromatography，LC）檢測(cè)蜂蜜摻假的原理是基于對(duì)C3 和C4 糖的鑒別。通常，配有脈沖安培檢測(cè)的LC 主要用于分析果糖，并與多元統(tǒng)計(jì)主成分分析相結(jié)合，可對(duì)蜂蜜中的摻假成分進(jìn)行量化。然而，由于繁瑣的樣品制備過程和需要專業(yè)人員進(jìn)行高效液相色譜分析，使得LC 檢測(cè)蜂蜜摻假的實(shí)用性受到限制。

3.2.4 高效陰離子交換色譜-脈沖電流檢測(cè)

高效陰離子交換色譜結(jié)合脈沖電流檢測(cè)（HPAEC-PAD）系統(tǒng)可以準(zhǔn)確地檢測(cè)碳水化合物的組成，包括單糖、二糖、寡糖和多糖。其原理是pKa 值（酸解常數(shù)的對(duì)數(shù)）在12～14 之間的微酸性糖或碳水化合物可以很容易地轉(zhuǎn)化為氧陰離子，并在高pH 值下被高效陰離子交換柱分離。目前，反相固相萃?。╮eversed-solid phase extraction，SPE）與HPAEC-PAD 聯(lián)合用于多糖分析和檢測(cè)摻假蜂蜜[7]。SPF 在濃縮蜂蜜多糖的同時(shí)，可以有效消除干擾性單糖和少量低聚糖?？梢?，HPAEC-PAD 是檢測(cè)極低濃度蜂蜜摻假的靈敏技術(shù)。

3.2.5 超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

四級(jí)桿高分辨質(zhì)譜（Q-TOF-MS）通過質(zhì)量分離和測(cè)量全產(chǎn)物離子來(lái)識(shí)別化合物，該技術(shù)具有高靈敏度和高準(zhǔn)確性[8]。Q-TOF-MS 在全掃描或產(chǎn)品離子掃描模式下操作，可以同時(shí)對(duì)未知污染物、代謝物和降解產(chǎn)物進(jìn)行敏感的識(shí)別和定量。近年來(lái)，超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜（UHPLC-Q-TOF-MS）被廣泛應(yīng)用于蜂蜜中不同類型碳水化合物摻假的檢測(cè)，如二果糖酐、2-乙酰呋喃-3 吡喃葡萄糖苷等。

3.3 光譜技術(shù)

3.3.1 核磁共振

利用質(zhì)子核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）結(jié)合統(tǒng)計(jì)模型可以對(duì)來(lái)自不同地理來(lái)源的單花和多花蜂蜜進(jìn)行鑒別。通常，先采用獨(dú)立成分分析檢測(cè)所有蜂蜜（純蜂蜜和摻假蜂蜜），進(jìn)而采用聯(lián)合近似特征矩陣對(duì)角化算法從核磁共振信號(hào)中提取相關(guān)信息?？偟膩?lái)說，核磁共振波譜可以快速檢測(cè)蜂蜜中的摻假物，以及從一個(gè)光譜中同時(shí)定量各種化學(xué)化合物。然而，與其他許多高端分析技術(shù)一樣，核磁共振的高運(yùn)行成本以及對(duì)現(xiàn)場(chǎng)專家人員的要求限制了其廣泛的應(yīng)用。

3.3.2 紅外光譜

紅外光譜技術(shù)現(xiàn)已成為常用的蜂蜜摻假檢測(cè)技術(shù)之一。由于該技術(shù)檢測(cè)速度快、樣品制備方法簡(jiǎn)單、成本低、無(wú)損、用戶友好以及適用于真實(shí)現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)等優(yōu)勢(shì)，備受廣大用戶青睞[9]。紅外光譜存在兩個(gè)區(qū)域測(cè)量：近N-IR（10000 -4000 cm-1）和 中M-IR（4000 -450 cm-1），M-IR 用于監(jiān)測(cè)基本振動(dòng)，N-IR 提供信息的高頻復(fù)泛音和重疊的振動(dòng)峰，M-IR 的光譜峰比N-IR 更窄，分辨率更高。通常，紅外光譜用于準(zhǔn)確識(shí)別C3 和C4 植物中廣泛存在的摻雜物。

3.3.3 拉曼光譜

拉曼光譜是基于單色光（激光）與分子電子云相互作用時(shí)發(fā)生能量交換（極化率變化）的原理。拉曼效應(yīng)發(fā)生在入射光非彈性散射時(shí)，導(dǎo)致由分子鍵振動(dòng)態(tài)模式控制的波長(zhǎng)偏移，呈現(xiàn)出分子結(jié)構(gòu)的獨(dú)特表達(dá)[10]。拉曼光譜實(shí)際上是紅外光譜數(shù)據(jù)的補(bǔ)充信息，當(dāng)與化學(xué)計(jì)量學(xué)結(jié)合使用時(shí)，可以提供蜂蜜中不同摻假糖的高精度定量檢測(cè)。

3.3.4 化學(xué)計(jì)量學(xué)集成紅外光譜技術(shù)

紅外光譜已經(jīng)成為與化學(xué)計(jì)量分析相結(jié)合的最常見的光譜方法，并已成為檢測(cè)蜂蜜摻假的有力工具，該技術(shù)已經(jīng)成功用于對(duì)不同植物來(lái)源采集的蜂蜜進(jìn)行準(zhǔn)確的定性和定量區(qū)分，并量化蜂蜜中各種糖的濃度，對(duì)C3 和C4 型蜂蜜中的摻假糖進(jìn)行分類時(shí)具有高度準(zhǔn)確性。目前普遍認(rèn)為，化學(xué)計(jì)量集成紅外光譜技術(shù)的使用有利于開發(fā)準(zhǔn)確可行的系統(tǒng)，適用于大量蜂蜜樣品的高通量篩選和定期監(jiān)測(cè)。

3.4 生物傳感器

一般來(lái)說，各種分析技術(shù)不能檢測(cè)分析蜂蜜的物理特性（如嗅覺、味覺、溫暖、涼爽、不透明度、透明度、色彩等）。與人類嗅覺相比，GC-MS 可以檢測(cè)到揮發(fā)性化合物，但卻無(wú)法鑒別揮發(fā)性化合物。隨著生物傳感器的發(fā)展，在一定程度上克服了這一缺點(diǎn)。電子鼻（e-nose）通過差異選擇性聚合物電位傳感器來(lái)檢測(cè)不同化合物散發(fā)的氣味。結(jié)合模式識(shí)別模型的電子鼻技術(shù)現(xiàn)已被廣泛用于各行業(yè)，包括食品、生物醫(yī)學(xué)、植物疾病檢測(cè)等。同樣地，電子舌（e-tongue）作為一種分析味覺的裝置已被用于味覺篩選，該設(shè)備中的傳感器被設(shè)計(jì)用來(lái)模擬人類舌頭上的味蕾，與食物、飲料分子相互作用，來(lái)評(píng)估食物的真實(shí)性。目前，電子鼻和電子舌分析已被廣泛用于區(qū)分不同植物和地理來(lái)源的蜂蜜。

4 不同技術(shù)的比較分析

與光譜技術(shù)相比，傳統(tǒng)的色譜技術(shù)耗時(shí)長(zhǎng)，高度依賴于熟練的操作人員，價(jià)格昂貴，但其準(zhǔn)確性和可靠性是無(wú)可爭(zhēng)議的，目前最先進(jìn)的SPE-HPAEC-PAD 技術(shù)識(shí)別蜂蜜摻假水平的最低檢測(cè)限（LOD）已達(dá)1%。由于光譜技術(shù)操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)迅速，通常在檢測(cè)蜂蜜中的雜質(zhì)時(shí)更加實(shí)用，但除NMR 外，單獨(dú)的光譜技術(shù)如拉曼光譜、紅外光譜等無(wú)法識(shí)別摻假標(biāo)記物，所以往往與化學(xué)計(jì)量學(xué)數(shù)據(jù)分析相結(jié)合，以提取相關(guān)信息。核磁共振在檢測(cè)蜂蜜摻假方面是非常優(yōu)秀和可靠的，但其高昂的價(jià)格和對(duì)熟練操作人員的要求限制了它的適用性?？傊庾V和色譜技術(shù)都不適合蜂蜜中摻假物的快速、高通量檢測(cè)和定量。目前，生物傳感器（電子鼻、電子舌等）是簡(jiǎn)單、快速和準(zhǔn)確地檢測(cè)蜂蜜中不同類型摻假物的最有前景的技術(shù)之一，通過將化學(xué)計(jì)量學(xué)數(shù)據(jù)分析與生物傳感器輸出特性相結(jié)合，可以對(duì)蜂蜜樣品進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)準(zhǔn)確和大規(guī)模的質(zhì)量檢測(cè)篩選。

5 展望

本文綜述了蜂蜜中摻假檢測(cè)和定量的幾種方法的過去的發(fā)展、趨勢(shì)、未來(lái)的潛力和優(yōu)缺點(diǎn)，蜂蜜行業(yè)可以利用檢測(cè)手段的快速發(fā)展來(lái)確保蜂蜜的安全和質(zhì)量。雖然檢測(cè)假蜂蜜的技術(shù)不斷取得進(jìn)展，但必須加緊開發(fā)新的和先進(jìn)的分析方法，以便適應(yīng)快速發(fā)展的蜂蜜產(chǎn)業(yè)。目前來(lái)看，可以通過化學(xué)計(jì)量集成光譜技術(shù)，如拉曼光譜和紅外光譜，以及生物傳感器技術(shù)來(lái)精確地確定和量化蜂蜜的純度。事實(shí)上，通過生物傳感器監(jiān)測(cè)蜂蜜質(zhì)量應(yīng)該是著重發(fā)展的方向，這是因?yàn)樵摷夹g(shù)無(wú)污染、樣品制備簡(jiǎn)單，并且檢測(cè)結(jié)果精準(zhǔn)。