陳艷欣，林韋康*

（1.王叔和（鄭州）生物制藥工程有限公司，河南 鄭州; 2.王叔和生物醫(yī)藥（武漢）有限公司，湖北 武漢）

蜂蜜藥用自古就有記載，例如古希臘的醫(yī)師希波克拉底和中國古代的藥圣李時(shí)珍，都曾記錄過蜂蜜作為藥物使用，是人類已知的最古老的傷口敷料。在第一次世界大戰(zhàn)期間，蜂蜜被俄羅斯和中國士兵用于傷口護(hù)理。傷口無論是手術(shù)中的手術(shù)切口，或者是由于意外和創(chuàng)傷造成的傷口，都面臨著外界細(xì)菌定植、感染的威脅。細(xì)菌存在于人體皮膚的各個(gè)角落，在正常情況下不會(huì)引起感染。當(dāng)皮膚和粘膜屏障受損時(shí)，它們會(huì)侵入、生長、繁殖和分泌毒素，隨著愈合時(shí)間的推移，這會(huì)逐漸導(dǎo)致急性/慢性感染性傷口的形成。然而，數(shù)十年來抗生素的過度使用和誤用改變了細(xì)菌的基因，導(dǎo)致耐藥菌株的出現(xiàn)，甚至產(chǎn)生了多藥耐藥性[1]。因此，迫切需要開發(fā)新的抗菌劑來解決創(chuàng)面細(xì)菌感染問題。

隨著現(xiàn)代抗菌藥物耐藥性的出現(xiàn)，天然的抗菌活性和促進(jìn)傷口愈合的特性使蜂蜜的相關(guān)研究逐漸成為焦點(diǎn)。本文就西澳菲斯特農(nóng)場赤桉蜂蜜研究了其抗菌活性和促進(jìn)感染創(chuàng)面愈合的效果。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品及試劑

西澳菲斯特農(nóng)場赤桉蜂蜜，由洋妝源（上海）網(wǎng)絡(luò)科技有限公司提供；市售蜂蜜，采購于國內(nèi)一線城市；胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、0.25% Trypsin-EDTA、磷酸鹽緩沖液（PBS），Gbico 公司；營養(yǎng)瓊脂，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；LB 肉湯、水合氯醛，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

XPR 電子分析天平，梅特勒托利多科技（中國）有限公司；HOPE-MED 8140 紫外輻照燈，天津開發(fā)區(qū)合浦工貿(mào)有限公司；BX63-CellSens 型全電動(dòng)智能顯微鏡，日本Olympus 公司；BOCL 101 液相色譜儀，日本島津公司；BIO-RAD680 型酶標(biāo)儀，美國BIO-RAD 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、細(xì)菌和動(dòng)物

HDF 細(xì)胞，美國組織細(xì)胞庫；金黃色葡萄球菌（ATCC6538）；大腸桿菌（ATCC9739）。SD 大鼠，雄性，SPF 級(jí)，個(gè)體質(zhì)量（350±2）g，6～8 周齡，購買于北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0008。動(dòng)物在（23±1）℃的環(huán)境中，在相對(duì)濕度（55±15）%的條件下，12 h 的循環(huán)光照條件下，可以自由地取食和喝水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

以5×104個(gè)/孔的密度，將HDF 細(xì)胞接種在96孔板中，培養(yǎng)24 小時(shí)。PBS 洗滌3 次，加入含不同濃度西澳菲斯特農(nóng)場赤桉蜂蜜（40% 、60%、80%、100%）、市售蜂蜜（40%、60% 、80%、100%）的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h 后，采用CCK-8 法測定細(xì)胞活力，來確定西澳菲斯特農(nóng)場赤桉蜂蜜和市售蜂蜜對(duì)HDF 細(xì)胞無毒性作用的安全劑量的范圍。

2.2 細(xì)胞活力的測定

移除待測96 孔板中的含有藥物的完培，加入PBS 洗滌細(xì)胞。吸取PBS，加入100 μL 含有10%CCK-8 的新鮮培養(yǎng)基，移入培養(yǎng)箱孵育合適的時(shí)間后，使用酶標(biāo)儀測定450 nm 波長處的吸光度。計(jì)算細(xì)胞存活率的公式如下：

細(xì)胞存活率（%）=（樣品組OD 值- 空白組OD值）/（對(duì)照組OD 值- 空白組OD 值）*100%

2.3 抑菌實(shí)驗(yàn)

供試菌懸液的準(zhǔn)備:取各菌(細(xì)菌)的12 h 的肉湯培養(yǎng)物，按10 倍稀釋法，用0.9%無菌生理鹽水溶液稀釋一定的倍數(shù)，制備濃度相當(dāng)于0.5 麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁管的供試菌懸液(含菌1.0×108～1.5×108CFU/mL)，生理鹽水稀釋，使之含菌量為1×107CFU/mL，備用。

PBS 和各蜂蜜稀釋液準(zhǔn)備：PBS 組、西澳菲斯特農(nóng)場赤桉蜂蜜組和市售蜂蜜組的稀釋方法相同，用PBS稀釋到80%（v/v），備用。

取450 μL 菌懸液（1×107CFU/mL）分別加入50 μ 稀釋后的PBS 后的蜂蜜。37 ℃共培養(yǎng)4 h。取培養(yǎng)后的試驗(yàn)菌懸液，根據(jù)菌落數(shù)量的多少，稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)后，用移液器吸取20 μL，均勻涂布在瓊脂板上，37 ℃培養(yǎng)12 h 后，取出進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

抑菌率=（空白組菌落數(shù)- 試驗(yàn)組組菌落數(shù)）/空白組菌落數(shù)*100%

2.4 體內(nèi)感染創(chuàng)面修復(fù)實(shí)驗(yàn)

將6 只SD 大鼠用5%水合氯醛麻醉，剃除毛發(fā)，消毒后用打孔器制造出6 個(gè)等大的全層切除創(chuàng)面（直徑10 mm）。在創(chuàng)面處接種20μL 金黃色葡萄球菌懸液（1×107CFU/mL），每天接種2 次，連續(xù)接種2 天，制造創(chuàng)面感染模型。將每只小鼠背部的6 個(gè)隨機(jī)分為3組：陰性對(duì)照（PBS 組），陽性對(duì)照（市售蜂蜜組），實(shí)驗(yàn)組（FFJH 組），每組12 個(gè)創(chuàng)面。每天每組各自給藥100 μL，連續(xù)14 天。于給藥治療第1、3、7 天取各組創(chuàng)面菌落，稀釋涂板，計(jì)算各組相應(yīng)天數(shù)的菌落數(shù)。于給藥治療第1、3、7、14 天測量創(chuàng)面面積，并統(tǒng)計(jì)。

創(chuàng)面愈合率=（初始創(chuàng)面面積- 現(xiàn)有創(chuàng)面面積）/初始創(chuàng)面面積*100%

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)至少重復(fù)3 次，結(jié)果以Means±SEM 表示。利用Graphpad prism 8.0 進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果P＜0.01 認(rèn)為有顯著性差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 FFJH 對(duì)HDF 細(xì)胞增殖的影響

皮膚成纖維細(xì)胞是組成皮膚真皮的主要結(jié)構(gòu)成分，可合成和分泌膠原蛋白、纖連蛋白、透明質(zhì)酸等細(xì)胞外基質(zhì)，在確保皮膚正常功能和創(chuàng)面修復(fù)的方面起著重要作用[2]。由圖1 可知，在作用24 h 后，80%（v/v）的FFJH 可以顯著促進(jìn)HDF 的增殖（P＜0.01）。因此，選用80%（v/v）的FFJH 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)評(píng)估。

圖1 FFJH 對(duì)HDF 細(xì)胞增殖的影響

3.2 FFJH 對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用

FFJH 對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制效果，見圖2，與PBS 組相比，F(xiàn)FJH 在體外可以有效抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生長（P＜0.01）。

圖2 體外抑菌率(a: 金黃色葡萄球菌; b: 大腸桿菌)

3.3 FFJH 加速感染創(chuàng)面愈合

FFJH 對(duì)SD 大鼠感染金黃色葡萄球菌創(chuàng)面愈合的影響見圖3，與PBS 組愈合緩慢相比，F(xiàn)FJH 組的感染創(chuàng)面愈合速度顯著加快（P＜0.01），表明FFJH 可以加速SD 大鼠感染創(chuàng)面愈合。

圖3 感染創(chuàng)面愈合率

3.4 FFJH 抑制感染創(chuàng)面金黃色葡萄球菌的生長

為了評(píng)價(jià)FFJH 在體內(nèi)的抑菌能力，第1、3、7 天從感染創(chuàng)面取樣獲得的金黃色葡萄球菌被涂板培養(yǎng)24 小時(shí)、計(jì)數(shù)。菌落數(shù)見圖4，在干預(yù)后第7 天時(shí)，PBS組菌落數(shù)較高，說明感染創(chuàng)面中金黃色葡萄球菌數(shù)目依舊較多，生長旺盛。與PBS 組相比，F(xiàn)FJH 組的菌落數(shù)顯著降低（P＜0.01），感染的皮膚顯示出少量細(xì)菌生長，這表明FFJH 在體內(nèi)對(duì)金黃色葡萄球菌依舊具有明顯的抑菌活性。

圖4 感染創(chuàng)面樣本菌落數(shù)

4 結(jié)論

4.1 FFJH 可以促進(jìn)HDF 細(xì)胞增殖

在創(chuàng)面修復(fù)過程中，機(jī)體需要?jiǎng)?chuàng)面邊緣的成纖維細(xì)胞快速增殖、并向創(chuàng)面中心遷移，并分泌膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)，為傷口床中央肉芽組織的生長與恢復(fù)創(chuàng)造有利條件。現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，蜂蜜可以通過刺激成纖維細(xì)胞的增殖，進(jìn)而加速組織再生[3]。在本研究結(jié)果中，可以明顯看出80%（v/v）的FFJH 可以促進(jìn)HDF 增殖，對(duì)創(chuàng)面修復(fù)有重要意義。

4.2 FFJH 抑制體外大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的增殖

創(chuàng)面修復(fù)過程中最常遇到的問題是細(xì)菌感染，外部細(xì)菌一旦在創(chuàng)面處生長達(dá)到臨界閾值就會(huì)極大程度上阻礙創(chuàng)面修復(fù)的過程，其中最常見的是金黃色葡萄球菌[4-5]。FFJH 在體外有很好的抗金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的能力，且天然無公害，不會(huì)產(chǎn)生耐藥性。

4.3 FFJH 可以抑制創(chuàng)面區(qū)域金黃色葡萄球菌的增殖并加速感染創(chuàng)面修復(fù)

蜂蜜在淺表燒傷和無感染的全層傷口以及實(shí)驗(yàn)性感染金黃色葡萄球菌的傷口中使用能減少炎癥，使傷口更快地愈合[6]。在本研究中，80%（v/v）的FFJH 覆蓋在皮膚缺損部位，能有效殺死創(chuàng)面的細(xì)菌，不產(chǎn)生耐藥性，有效減少創(chuàng)面區(qū)域金黃色葡萄球菌的增殖，加速大鼠感染性創(chuàng)面的愈合。雖然具體的作用機(jī)制可能需要進(jìn)一步探究，但此研究充實(shí)了天然物質(zhì)用作創(chuàng)傷修復(fù)的敷料成分，擴(kuò)大了抗生素替代品種類，為探詢FDA 級(jí)醫(yī)療蜂蜜申報(bào)提供先驅(qū)性的研究指導(dǎo)價(jià)值。

西澳菲斯特農(nóng)場赤桉蜂蜜與傳統(tǒng)抗菌藥物和敷料相比更天然，對(duì)人體無毒副作用，不會(huì)產(chǎn)生耐藥性。作為感染性創(chuàng)面治療的優(yōu)良藥物，有廣闊的應(yīng)用前景。