萬林生， 孫紅芹， 倪正斌， 韓配配， 陳志愛

(江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所， 江蘇 鹽城 224012)

遠(yuǎn)緣雜交是創(chuàng)造作物新品種的重要途徑，也是改良物種的有力工具。利用遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)，可打破種、屬間的隔離，拓寬遺傳基礎(chǔ)并為育種計劃創(chuàng)造新的種質(zhì)，從而有效地進(jìn)行種間、屬間目標(biāo)遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移。目前，遠(yuǎn)緣雜交在油菜育種上已得到廣泛應(yīng)用，并取得顯著成效。如用白菜型油菜與甘藍(lán)型油菜雜交，改良甘藍(lán)型油菜的熟性；甘藍(lán)型油菜與白菜型油菜、芥菜型油菜、羽衣甘藍(lán)等黃籽材料雜交，在雜交后代中選育出黃色種皮的甘藍(lán)油菜等[1-4]。

目前，國內(nèi)外在甘藍(lán)型油菜與蘿卜遠(yuǎn)緣雜交及雜種鑒定方面的研究雖有報道，卻為數(shù)不多。甘藍(lán)型油菜是經(jīng)過白菜與甘藍(lán)種間雜交，加倍形成的異源雙二倍體，而蘿卜是十字花科一種非常重要的蔬菜。甘藍(lán)型油菜與蘿卜的雜交屬于蕓薹屬與蘿卜屬之間的遠(yuǎn)緣雜交[5-6]。蘿卜屬作為蕓薹屬的近緣屬，具有許多優(yōu)秀并有價值的基因，例如優(yōu)良的抗逆、抗蟲性和抗病性。遠(yuǎn)緣雜交可以將蘿卜中的優(yōu)良基因轉(zhuǎn)移到甘藍(lán)型油菜中，從而拓寬甘藍(lán)型油菜的遺傳基礎(chǔ)，改良甘藍(lán)型油菜。

本試驗通過人工雜交獲得甘藍(lán)型油菜與蘿卜的遠(yuǎn)緣雜種，并對雜種進(jìn)行了分子標(biāo)記鑒定，旨在拓寬甘藍(lán)型油菜的遺傳基礎(chǔ)，為相關(guān)性狀的轉(zhuǎn)移和創(chuàng)造新的生物材料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為油菜和蘿卜。油菜品種(母本)為甘藍(lán)型油菜Y5A、Y4-2A，均為江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所自育油菜核不育品種;蘿卜品種(父本)為吉美紅皮、牛埔杙、春露、短葉十三，均為引進(jìn)中國油料作物研究所蘿卜高抗根腫病品種。

1.2 試驗方法

1.2.1 遠(yuǎn)緣雜交

在江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所南洋試驗場內(nèi)根據(jù)蘿卜和油菜的生育期長短播種，以保證其花期相遇。以甘藍(lán)型油菜Y5A、Y4-2A為母本，以4種蘿卜品種為父本，共8組雜交組合。2021年4月開展油菜蘿卜雜交工作。將母本不育系套袋，當(dāng)袋子中的母本開花十幾朵后，取父本蘿卜當(dāng)天開放的新鮮花粉，涂抹在母本花朵柱頭上，套上雜交紙袋，掛好吊牌。授粉后1周去除紙袋。成熟時按組合和母本單株收獲，計數(shù)每一花序的結(jié)角數(shù)、每角的飽滿粒數(shù)、半飽滿粒數(shù)和癟粒數(shù)，并計算結(jié)角率與親和指數(shù)。

結(jié)角率=100%×獲得的角果數(shù)/授粉花朵數(shù)；親和指數(shù)=飽滿種子數(shù)/授粉花朵數(shù)。

1.2.2 分子標(biāo)記鑒定F1真假雜交種

通過對甘藍(lán)型油菜、蘿卜及兩者的雜交F1代種子進(jìn)行萌發(fā)和試驗培養(yǎng)，利用杭州博日的Biospin植物基因組DNA提取試劑盒提取親本及其F1雜交種葉片的DNA。對親本基因組DNA進(jìn)行高通量測序，組裝基因組信息并搜索全基因組中的SSR位點，并設(shè)計合成這些特異性位點相對應(yīng)的引物，利用親本和雜交種的基因組DNA進(jìn)行PCR擴增，確定引物的特異性、有效性，挑選出最合適引物用于雜交種的真實性鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 遠(yuǎn)緣雜交

由表1可以看出，甘藍(lán)型油菜Y5A為母本，以4種蘿卜品種為父本，得到23個角果，平均結(jié)角率0.07%。收獲后考種，得到雜交種子44顆，平均親和指數(shù)0.12。4個雜交組合中，Y5A/吉美紅皮沒有獲得雜交種子，Y5A/春露的雜交種子數(shù)最多，為 31顆，結(jié)角率0.15%，親和指數(shù)0.32。

表1 8個雜交組合田間結(jié)實情況

由表1可以看出，甘藍(lán)型油菜Y4-2A為母本，以4種蘿卜品種為父本，得到11個角果，平均結(jié)角率0.04%。收獲后考種，得到雜交種子21顆，平均親和指數(shù)0.08。4個雜交組合中，Y4-2A/吉美紅皮沒有獲得雜交種子，Y4-2A/春露的雜交種子數(shù)最多，為 12顆，結(jié)角率0.06%，親和指數(shù)0.14。

2.2 F1雜交種驗證

對甘藍(lán)型油菜和蘿卜進(jìn)行基因組測序，從全基因組中的SSR位點及其設(shè)計的相對應(yīng)引物里篩選了150對引物，利用這150對引物與甘藍(lán)型油菜(母本)、蘿卜(父本)及8株雜交F1代基因組DNA進(jìn)行PCR擴增。初步篩選出在父母本間能擴增出清晰的特異性條帶的引物。再用篩選出的引物同時與親本和雜交F1代DNA進(jìn)行PCR擴增，挑選出能在雜交F1代表現(xiàn)出同時具有父母本特異性條帶的合適引物，進(jìn)行雜交種的真實性鑒定。

2.2.1 SSR引物篩選

2.2.1.1 親本和F1DNA提取

利用改良CTAB法提取親本和F1代幼嫩葉片的DNA。首先在磨樣機中加入一定量的幼嫩葉片及兩顆鋼珠，700 μL預(yù)熱的CTAB，磨樣機50 Hz磨樣3 min。隨后65 ℃水浴30 min。水浴后加入氯仿700 μL，劇烈振蕩，離心機12 000 r·min-1離心10 min，取500 μL上清液，加入等體積預(yù)冷的異丙醇，上下顛倒幾次，離心機12 000 r·min-1離心15 min。棄上清，加入適量的70%乙醇，振蕩，靜置。5 min后輕輕倒掉乙醇，放在衛(wèi)生紙上倒置過夜。第二天加TE緩沖液200 μL，測定DNA含量。

2.2.1.2 分子標(biāo)記開發(fā)

通過NCBI數(shù)據(jù)庫分別查找下載油菜(Radish_ v2.20)與蘿卜(Bra_napus_v2.0)的基因組序列，利用軟件BioEdit v.7.7.3.0 版本建立各自的基因組序列庫。使用蘿卜的某條染色體與其整個基因組序列對比，截取匹配程度低的部分。再使用所截取序列與甘藍(lán)型油菜基因組比對，在序列差異位置開發(fā)顯性標(biāo)記。通過對比篩選，使該標(biāo)記特異于油菜基因型序列和蘿卜的其他染色體。

PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，電壓150 V，時間35 min，上樣量5 μL。

最后篩選出5對引物，5對引物序列如下：

Primer17-F：5′-CCAATCCGACGATACAGGTT-3′；SEQ ID NO.1；

Primer17-R：5′-TTAGGGGGAGTTTCTTGCCT-3′；SEQ ID NO.2；

Primer51-F：5′-TCCAAAAGGTCTCGTCTCTCA-3′；SEQ ID NO.3；

Primer51-R：5′-CACATTGGTTTGTTGGTTGC-3′；SEQ ID NO.4；

Primer125-F：5′-CTTGTTTCCACCCTTTTCCA-3′；SEQ ID NO.5；

Primer125-R：5′-TTTCAACCACCATTAACAAC CA-3′；SEQ ID NO.6；

Primer128-F：5′-TTAGGGCTTTGGTCTTTGGA-3′；SEQ ID NO.7；

Primer128-R：5′-CACATCATGGCTTTCTCCAC-3′；SEQ ID NO.8；

Primer140-F：5′-CGCAAATTTTTGCAATAGAG C-3′；SEQ ID NO.9；

Primer140-R：5′-TTTTTAGATTTGGGATAATTC TTACT-3′；SEQ ID NO.10。

2.2.2 PCR擴增以及雜交種檢測

利用能在雜交F1代表現(xiàn)出同時具有父母本特異性條帶的引物，對獲得雜交種F1進(jìn)行雜交種的真實性鑒定。利用引物128對結(jié)角率與親和指數(shù)均較高的Y5A/春露雜交8株F1代PCR擴增。圖1顯示，有5株單株擴增到兩親本特異條帶，鑒定為真雜種；其余3株單株只擴增到母本或父本特異性條帶，可能為假雜種。

圖1 引物128對部分遠(yuǎn)緣雜交F1鑒定結(jié)果

3 討論

油菜遠(yuǎn)緣雜交親和性的大小不僅受環(huán)境的影響，也受親本基因型親和力的影響。本試驗中以不同的不育系為母本和不同材料為父本遠(yuǎn)緣雜交所得結(jié)果不同。以Y5A為母本時，春露為父本的雜交種子數(shù)最多，Y5A/春露的雜交種子數(shù)有31顆，結(jié)角率0.15%，親和指數(shù)0.32。以Y4-2A為母本時，春露為父本的雜交種子數(shù)最多，Y4-2A/春露的雜交種子數(shù)有12顆，結(jié)角率0.06%，親和指數(shù)0.14。油菜遠(yuǎn)緣雜交過程中父母本的選擇和組配至關(guān)重要，這和前人研究結(jié)果一致[7-10]。

油菜和蘿卜的遠(yuǎn)緣雜交較為困難，要確定雜交配組后獲得F1的真實性。本研究通過對甘藍(lán)型油菜、蘿卜基因組測序，挑選出能在雜交F1代表現(xiàn)出同時具有父母本特異性條帶的合適引物，鑒定F1的真實性。Y5A/春露雜交8株F1中顯示有5株單株擴增到兩親本特異條帶，鑒定為真雜種。

根腫病近年來已成為十字花科作物上重要的病害之一。我國油菜主產(chǎn)區(qū)內(nèi)根腫病發(fā)病嚴(yán)重，對油菜產(chǎn)量造成巨大損失，打擊了農(nóng)民種植積極性，威脅我國油料安全，加強對油菜根腫病的防治研究意義重大。蘿卜作為油菜的近緣種，有研究證明其對根腫病的抗性要高于甘藍(lán)和白菜，通過抗病性鑒定，篩選出優(yōu)良的抗病蘿卜品種，進(jìn)而通過有性雜交和子房培養(yǎng)方法，結(jié)合形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)及分子檢測技術(shù)，將油菜近緣種蘿卜的抗根腫病基因?qū)氲接筒酥?，以期獲得具有免疫或高抗根腫病的中間材料，進(jìn)而拓寬甘藍(lán)型油菜的根腫抗病性遺傳基礎(chǔ)，為應(yīng)對油菜根腫病抗性基因單一帶來的抗性易喪失問題提供更多可供選擇利用的種質(zhì)資源。