何 達， 馬子越， 席俊峰

(陜西省榆林市第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科, 陜西 榆林 719000)

肺癌發(fā)病率高、死亡率高，給我國醫(yī)療衛(wèi)生造成了沉重的社會負擔。因為肺癌診斷時往往處于晚期，已經(jīng)錯過了治療的最佳時機，導(dǎo)致肺癌的死亡率居高不下[1]，因此尋找新的生物標志物與治療靶點對于肺癌的治療非常重要。干細胞是未分化的細胞，具有自我更新能力和多能性，在臨床治療中具有巨大的潛力[2]。既往研究表明，癌癥干細胞作為未分化的腫瘤細胞亞群，可適應(yīng)放射/化學(xué)療法并繼續(xù)生長。癌癥干細胞的干細胞特性主要受其微環(huán)境調(diào)控，具有無限增殖和自我更新的能力，可改變與癌癥干細胞相關(guān)的信號通路，促進癌癥的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、治療耐藥和疾病的復(fù)發(fā)[3]。傳統(tǒng)的癌癥治療旨在消除增殖的癌細胞，然而針對癌干細胞的治療策略仍然是一項重大挑戰(zhàn)。小環(huán)狀RNA(microRNA，miRNA)是一種高度保守的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，在生物體內(nèi)長度約為18-24個核苷酸，可以在翻譯水平上調(diào)控基因表達。miRNA 在影響許多細胞過程的基因表達中具有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，包括生長、增殖、分化、代謝和細胞死亡。miRNA的異常表達和失調(diào)與多種人類疾病有關(guān)，包括癌癥、自身免疫性疾病以及心血管和神經(jīng)系統(tǒng)疾病[4]。miR-653是miRNA的一種，研究表明miR-653失調(diào)可能與癌癥、缺氧和中風(fēng)等許多疾病的過程有關(guān)，對于疾病的發(fā)展發(fā)揮不同的影響。然而miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對肺癌干細胞的干性維持的調(diào)控作用有待進一步的研究。本實驗基于miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，探討其在肺癌干細胞干性維持中的作用及其分子機制，通過miRNA-seq尋找正常肺癌組織與癌旁組織中的差異miRNA，并進行靶mRNA預(yù)測，為將來研究肺癌的免疫療法提供參考價值。

1 資料與方法

1.1臨床資料：選取2019年6月至2022年3月期間于我院手術(shù)切除的肺癌組織和癌旁組織(40例)。手術(shù)取材后立即置于液氮冷凍，保存于-80℃冰箱。所有患者術(shù)前均未接受放化療。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準，并取得患者知情同意。

1.2細胞與主要儀器試劑：H460肺癌細胞系購自中科院上海細胞庫；PBS、胎牛血清、胰酶消化液和RPMI-1640培養(yǎng)基購自武漢普諾賽生命科技有限公司；TRizol試劑購自湖南艾科瑞生物工程有限公司；High Capacity Complementary DNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Life Technologies Corporation；LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen；熒光素酶活性檢測試劑盒購自上海澤葉生物科技有限公司；miR-NC質(zhì)粒、miR-653質(zhì)粒、過表達載體陰性對照(oe-NC)、MYC過表達載體(oe-MYC)購自武漢金開瑞生物工程有限公司；SYBR Green試劑購自上海翌圣公司；GAPDH引物、miR-653引物、MYC引物由上海生工生物工程公司合成；CCK8試劑盒購自武漢菲恩生物科技有限公司；熒光標記抗體 (FITC-CD133、PE-CD24)均購自美國eBioscience公司。

1.3miRNA-seq；使用TRizol試劑提取人的肺癌組織與癌旁組織的總RNA(各5例)，然后，通過凝膠電泳分離大小為18～-30nt的RNA分子，并將3'和5'接頭連接到RNA。使用High Capacity Complementary DNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對每個樣品的1μg RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，富集140～160 bp大小的PCR產(chǎn)物構(gòu)建cDNA文庫。使用 Illumina HiSeq 2500測序系統(tǒng)進行高通量測序。通過背景校正、log2變換和分位數(shù)歸一化對數(shù)據(jù)進行預(yù)處理。通過使用Benjamini-Hochberg 程序?qū)Χ嘀乇容^進行校正。

1.4細胞培養(yǎng)及傳代：使用RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清與青鏈霉素混合雙抗)培養(yǎng)H460肺癌細胞，培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)：棄去培養(yǎng)上清，PBS潤洗細胞1-2次，加2mL胰酶消化液于培養(yǎng)瓶中消化1-2min，加少量培養(yǎng)基終止消化。按6～8mL/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000rpm條件下離心4min，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細胞懸液按1∶2到1∶5的比例分到新的含8mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測miR-653的靶mRNA及其參與的信號通路：利用TargetScan7數(shù)據(jù)庫(http://www.targetscan.org/vert_71/)和LncRNA2Target數(shù)據(jù)庫(http://123.59.132.21/lncrna2target/index.jsp)預(yù)測miR-653的靶基因，結(jié)果通過Cytoscape軟件作圖導(dǎo)出。使用KEGG數(shù)據(jù)庫(KEGG Database https://www.kegg.jp/kegg/kegg1.html)分析分析miR-653靶基因參與的信號通路。

1.6細胞轉(zhuǎn)染與熒光素酶報告基因檢測實驗：收集對數(shù)生長期的H460細胞接種至6孔板，根據(jù)LipofectamineTM 2000說明書進行轉(zhuǎn)染，將miR-NC、miR-653、oe-NC、oe-MYC轉(zhuǎn)染至H460肺癌細胞系，分組為：miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC)、miR-653組(轉(zhuǎn)染miR-653)、miR-653+oe-NC組(轉(zhuǎn)染miR-653+ oe-NC)、miR-653+oe-MYC組(轉(zhuǎn)染miR-653+oe-MYC)，轉(zhuǎn)染48h后進行后續(xù)實驗檢測；分別將miR-NC、miR-653、野生型MYC、突變型MYC轉(zhuǎn)染至H460肺癌細胞中，分組為：野生型MYC+miR-NC組、野生型MYC+miR-653組、突變型MYC+miR-NC組、突變型MYC+miR-653組。轉(zhuǎn)染48h后，將細胞鋪板至96孔板，應(yīng)用熒光素酶活性檢測試劑盒檢測H460肺癌細胞的熒光素酶活性。依據(jù)以下公式進行計算:相對luciferase活性=firefly luciferase活性/ renilla luciferase活性× 100%。

1.7CCK8實驗檢測細胞增殖水平：將對數(shù)階段生長的各組H460細胞接種于96孔板，每孔細胞數(shù)為1×104。細胞繼續(xù)培養(yǎng)24h后，如前所述處理和轉(zhuǎn)染細胞。將細胞培養(yǎng)24h后，然后每孔加入10μL CCK-8溶液，37℃培養(yǎng)4h。通過酶標儀測量450nmoL/L的光密度(OD)值。細胞增殖(%)=(其余組OD450)/0ng/L DEXOD450)×100%。

1.8有限稀釋法檢測細胞成球?qū)嶒灒菏占D(zhuǎn)染后的H460細胞，進行消化、離心，加入含TGF生長因子的無血清培養(yǎng)基并吹打分散為單細胞懸浮液，調(diào)整細胞數(shù)量以4、8、16個/孔接種于96孔板，每組6個孔。置于37℃、CO2恒溫孵育箱中培養(yǎng)，1周后于倒置顯微鏡下觀察并計數(shù)每視野下形成的細胞球，以>50μm作為一個細胞球。成球頻率=(對應(yīng)孔陽性細胞數(shù)/4+對應(yīng)孔陽性細胞數(shù)/8+對應(yīng)孔陽性細胞/16)×100%。

1.9qRT-PCR法檢測腫瘤組織或細胞基因的表達：TRIzol試劑提取總RNA，酶標儀檢測總RNA的純度和含量。按照qRT-PCR試劑盒實驗說明，依次進行逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR實驗。qRT-PCR反體系：cDNA模板2ng，上下游引物各0.4μL，SYBR Primix Ex TaqTM 5μL，ddH2O補充至10μL。qRT-PCR反應(yīng)條件：95oC(30s)預(yù)變性后，變性95oC(7s)，退火55oC(30s)，72℃(15s)，40個循環(huán)周期。擴增結(jié)果根據(jù)2-△△Ct法計算mRNA的相對表達量。qRT-PCR引物序列：GAPDH-F，5-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3，GAPDH-R，5-GCGCCCAATACGACCAAATC-3；miR-653-F，5-TCAGGGGCCTTCAGGACTAA-3，5-CCGAGGTGTTCAAACAATCT-3；MYC-F,5-AGTTCTAAGGCACCGGCTTC-3，MCY-R，5-GTCCTCCCCAGTCTCCTCAT-3。

1.10流式細胞術(shù)檢測CD133+與CD24+細胞比例：收集H460細胞，細胞處理計數(shù)后，用細胞洗液(含2%胎牛血清的PBS)重懸細胞，使細胞濃度為1×107/mL，空白對照管不加抗體，同型對照和待測管分別加入10μL同型抗體和靶標抗體，充分混勻，經(jīng)室溫避光孵育30min孵育，期間每隔10min晃動一下反應(yīng)管，使細胞和抗體充分反應(yīng)，孵育結(jié)束后，反復(fù)洗滌2次棄上清，使用100μL細胞洗液重懸細胞，分別加入FITC-CD133、PE-CD24抗體，充分混勻，至4℃避光孵育30min，加入100μL細胞洗液后上機檢測。

2 結(jié) 果

2.1肺癌組織與癌旁組織中miRNA差異比較：miRNA-seq結(jié)果顯示，與癌旁組織比較，腫瘤組織中有326個miRNA表達升高，363個miRNA表達降低，見圖1A。qRT-PCR結(jié)果顯示，癌旁組織比較，腫瘤組織中miR-653表達降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1B。

圖1 癌旁組織和腫瘤組織差異miRNA比較注：A為癌旁組織和腫瘤組織差異miRNA比較；B為癌旁組織和腫瘤組織miR-653表達水平比較。與癌旁組織比較，＊P<0.05

2.2miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)預(yù)測：對miR-653進行靶mRNA預(yù)測。結(jié)果顯示，miR-653靶向22個mRNA，見圖2A。KEGG分析miR-653靶基因參與調(diào)控多能性干細胞等信號通路，見圖2B。預(yù)測結(jié)果顯示，miR-653與MYC有9個堿基互補。熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，在野生型MYC中，miR-653組熒光強度低于miR-NC組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；在突變型MYC中，miR-653組和miR-NC組熒光強度沒有顯著性差異(P>0.05)，見圖3。

圖2 miR-633靶基因預(yù)測及功能分析注：A為miR-653靶基因預(yù)測；B為miR-653靶基因KEGG分析

圖3 miR-633靶向MYC驗證注：A為miR-653與MYC結(jié)合位點；B為熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測各組細胞相對熒光強度。與miR-NC組比較，＊P<0.05

2.3miR-653與MYC對肺癌細胞CD133、CD24表達的影響：qRT-PCR結(jié)果顯示，與miR-NC組比較，miR-653組miR-653表達升高，MYC表達降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與miR-653+oe-NC組比較，miR-653+oe-MYC組MYC表達升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，與miR-NC組比較，miR-653組CD133、CD24表達降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與miR-653+oe-NC組比較，miR-653+oe-MYC組CD133、CD24表達升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

圖4 各組細胞miR-633、MYC表達水平的比較注：A為miR-653表達水平；B為MYC表達水平。與miR-NC組比較，＊P<0.05；與miR-NC+oe-NC組比較，#P<0.05

圖5 各組細胞CD133、CD24表達水平的比較注：與miR-NC組比較，＊P<0.05；與miR-NC+oe-NC組比較，#P<0.05

2.4miR-653與MYC對肺癌細胞增殖的影響：CCK8結(jié)果顯示，與miR-NC組比較，miR-653組細胞增殖水平降低，在72h時表現(xiàn)出顯著性差異(P<0.05)；與miR-653+oe-NC組比較，miR-653+oe-MYC組細胞增殖水平升高，在72h時表現(xiàn)出顯著性差異(P<0.05)，見圖6。

圖6 各組細胞增殖水平的比較注：與miR-NC組比較，＊P<0.05；與miR-NC+oe-NC組比較，#P<0.05

2.5miR-653與MYC對肺癌細胞干性成球比例的影響：細胞成球結(jié)果顯示，與miR-NC組比較，miR-653組細胞成球比例降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與miR-653+oe-NC組比較，miR-653+oe-MYC組細胞成球比例升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖7。

圖7 各組細胞成球頻率的比較注：與miR-NC組比較，＊P<0.05；與miR-NC+oe-NC組比較，#P<0.05

3 討 論

腫瘤被認為是一種由細胞克隆而起源的疾病，其特點是單個轉(zhuǎn)化細胞獲得產(chǎn)生異質(zhì)腫瘤細胞群的能力，每個子細胞具有相同的產(chǎn)生更多腫瘤細胞的能力。最近，越來越多的研究提出了癌癥干細胞模型，癌癥干細胞樣細胞可以通過成體干細胞或祖細胞的重編程產(chǎn)生，這些細胞負責腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移[5]。此外研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細胞樣細胞有助于腫瘤產(chǎn)生耐藥性，極大的增加了復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率。這些干細胞樣細胞與傳統(tǒng)干細胞相似，它們能夠自我更新、不對稱分裂[6]。鑒于這些特性，了解和開發(fā)靶向癌癥干細胞的免疫療法已成為癌癥研究的重要領(lǐng)域。

基因表達的調(diào)控是一個復(fù)雜的多步驟過程。產(chǎn)生功能性蛋白質(zhì)受多種因素的影響，從轉(zhuǎn)錄到翻譯，然后是翻譯后修飾，其中miRNA參與大多數(shù)過程并在這個高度復(fù)雜的調(diào)節(jié)系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[7]。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與癌癥干細胞的干性維持相關(guān)，例如Ma等[8]研究發(fā)現(xiàn)miR-139-5p可逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌癌癥干細胞的干性維持和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，抑制腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移。miR-653表達的變化與人類癌癥的腫瘤侵襲性和不良預(yù)后有關(guān)，并且在某些類型的癌癥中發(fā)揮腫瘤抑制作用，例如乳腺癌、宮頸癌、肝癌、腎癌和肺癌[9]。miRNA通過精確調(diào)節(jié)基因表達而廣泛參與各種生命過程，miRNA通過靶向mRNA的3'UTR、5'UTR、編碼序列或基因啟動子，介導(dǎo)細胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)錄后基因沉默或激活[10]。本實驗通過使用miRNA-seq技術(shù)檢測肺癌組織與癌旁組織中的差異miRNA，結(jié)合qRT-PCR結(jié)果，發(fā)現(xiàn)與癌旁組織比較，肺癌組織中miR-653表達顯著降低。miR-653的預(yù)測靶基因KEGG分析顯示，這些基因參與調(diào)控多能性干細胞等信號通路，并且miR-653表達上調(diào)可以抑制癌細胞增殖與成球比例，說明miR-653在肺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵性的作用。

MYC蛋白是一螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)的亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子，可協(xié)調(diào)細胞生長、增殖、侵襲、擴張和血管生成所必需的多種轉(zhuǎn)錄程序。MYC在多種癌癥疾病中過表達，MYC的靶基因眾多，這些基因幾乎在細胞生物學(xué)和腫瘤學(xué)的各個方面發(fā)揮作用。MYC激活后可以廣泛抑制miRNA表達，激活抗凋亡蛋白，并參與調(diào)節(jié)癌細胞存活和耐藥性[11]。例如，有研究發(fā)現(xiàn)在B細胞淋巴瘤中，miR-29家族與MYC表達呈負相關(guān)，并調(diào)節(jié)癌細胞生長和存活[12]。此外，已有研究表明miR-653可能通過MYC抑制成纖維細胞活力和遷移水平，提示miR-653可能靶抑制MYC從而發(fā)揮細胞生物學(xué)功能[13]。在本實驗中，通過對miR-653的靶mRNA進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)miR-653與MYC的mRNA有9個堿基互補。miR-653表達增加后，MYC的表達水平降低，提示miR-653可能通過靶向MYC發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

隨著研究地不斷深入，越來越多的腫瘤干細胞表面標志物被確立，并應(yīng)用于干細胞的鑒別與分選[14]。CD133和CD24均為腫瘤干細胞的特征性表面標志物，CD133+細胞與CD24+細胞均表現(xiàn)為更強的增殖能力和不良的預(yù)后[15]。在本實驗中，miR-653組的CD133、CD24的表達降低，說明上調(diào)miR-653的表達可以抑制癌癥細胞的干性，然而當過表達MYC后，CD133、CD24表達升高，說明過表達MYC可以逆轉(zhuǎn)miR-653對癌細胞干性的抑制作用。此外，過表達MYC也可以逆轉(zhuǎn)miR-653上調(diào)造成的癌細胞增殖下降與成球比例降低。以上結(jié)果表明，MYC位于miR-653信號調(diào)節(jié)的下游，miR-653可以通過抑制MYC降低癌癥干細胞的干性維持。

綜上所述，在肺癌組織中，存在miR-653的表達下調(diào)。通過上調(diào)miR-653的表達可以抑制癌細胞的干性及增殖能力，miR-653可以靶向調(diào)控MYC抑制肺癌細胞干細胞維持。以上結(jié)果初步明確了miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在肺癌細胞干性維持中所發(fā)揮的作用，為進一步探索肺癌的治療靶點提供一定的參考意義。