陰睿媛， 王 蓓， 許亞靜， 董 夏

(1.陜西省西安市西北婦女兒童醫(yī)院心臟中心， 陜西 西安 710000 2.陜西省西安市中醫(yī)醫(yī)院， 陜西 西安 710000)

病毒性心肌炎是由嗜心肌病毒感染心臟引起的，嚴(yán)重者會(huì)發(fā)展成擴(kuò)張型心肌病和心力衰竭，嚴(yán)重威脅生命健康[1]?？滤_奇病毒B3(Coxsackie B3 virus，CBV3)是引起病毒性心肌炎的最常見(jiàn)病毒，其感染心肌細(xì)胞后激活炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，引起心肌組織損傷[2]。目前，對(duì)病毒性心肌炎的臨床治療，還缺乏有效地手段。病毒性心肌炎的進(jìn)展涉及多種基因的異常表達(dá)和調(diào)控，靶向特定基因來(lái)干預(yù)心肌炎的進(jìn)展和減輕心肌炎引起的組織損傷，是目前研究的一個(gè)熱點(diǎn)，有望為病毒性心肌炎的臨床治療帶來(lái)曙光[3]。因此，探尋對(duì)病毒性心肌炎有調(diào)控作用的新基因及其作用機(jī)制，有望為新型基因治療方法的研發(fā)提供可參考的靶標(biāo)分子和理論基礎(chǔ)。炎癥小體是一種蛋白質(zhì)復(fù)合體，其在組織損傷、細(xì)菌和病毒感染等多種病理?xiàng)l件下被激活，參與調(diào)控多種疾病的進(jìn)展過(guò)程。由Nod樣受體家族包含pyrin結(jié)構(gòu)域3(NOD-like receptor family pyrin domain-containing 3，NLRP3)蛋白組成的NLRP3炎癥小體是目前研究比較廣泛的一種炎癥小體[4]。NLRP3炎癥小體由NLRP3蛋白，凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1，Caspase-1)組成[5]。激活NLRP3炎癥小體可對(duì)白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和白介素-18(interleukin-18，IL-18)的前體蛋白進(jìn)行切割加工，產(chǎn)生有活性的IL-1β和IL-18，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞死亡[6]。NLRP3炎癥小體的激活和病毒性心肌炎密切相關(guān)。抑制NLRP3炎癥小體的激活可以有效減輕CBV3誘導(dǎo)的心肌炎[7]。NLRP3炎癥小體的激活受多種上游信號(hào)分子的調(diào)控，探尋對(duì)該炎癥小體具有重要調(diào)控作用的新分子，對(duì)于開(kāi)發(fā)病毒性心肌炎的治療方法，具有十分重要的意義。補(bǔ)體C1q /腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白6 (C1q/tumor necrosis factor-related protein 6，CTRP6) 是脂肪因子超家族的一員，和脂聯(lián)素結(jié)構(gòu)相似，具有廣泛的組織表達(dá)模式，特別在心臟和脂肪組織中高表達(dá)。CTRP6具有多種生物功能，可調(diào)控細(xì)胞分化、纖維化、炎癥反應(yīng)和組織損傷等生物學(xué)過(guò)程，在多種疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用。有趣的是CTRP6還具有心肌保護(hù)作用[8]。豈止為止，關(guān)于CTRP6是否對(duì)病毒性心肌炎引起的心肌損傷具有保護(hù)作用，尚不明確。本項(xiàng)目通過(guò)CBV3感染心肌細(xì)胞建立病毒性心肌炎的體外模型，來(lái)研究CTRP6對(duì)病毒性心肌炎細(xì)胞損傷的調(diào)控作用和其潛在的分子作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑:人心肌細(xì)胞AC-16購(gòu)自北京北納生物公司；CBV3病毒株購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心ATCC；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自武漢Procell生命科技有限公司；RNA提取試劑Trizol和TUNEL試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司；cDNA合成試劑盒和FastSYBR Mixture購(gòu)自江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司；蛋白提取試劑盒、蛋白濃度測(cè)定試劑盒和TransIntro EL轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司；CK-MB試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所有限公司；cTn-I試劑盒購(gòu)自上海艾博抗貿(mào)易有限公司；AdipoR1 siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)和合成；IL-1β、TNF-α和IL-18 ELISA試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；兔抗人CTRP6抗體、α-actin抗體、Bcl2抗體、Bax抗體、NLRP3抗體、ASC抗體和HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.2方 法

1.2.1心肌細(xì)胞培養(yǎng)：將AC-16心肌細(xì)胞接種于含10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于5% CO2的培養(yǎng)箱中37℃生長(zhǎng)。每2～3d更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2的比例傳代。

1.2.2CBV3感染心肌細(xì)胞模型的建立：CBV3感染Hela細(xì)胞進(jìn)行繁殖和擴(kuò)增。根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算50%組織感染率(50% tissue culture infective doses，TCID50)。將心肌細(xì)胞接種到6孔板中，過(guò)夜培養(yǎng)。第2天，加入100μ的100 TCID50，細(xì)胞置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h。然后，去除CBV3病毒液，添加正常培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3RT-qPCR檢測(cè)mRNA表達(dá)：收集細(xì)胞，去除培養(yǎng)基，用PBS洗滌，加入Trizol充分裂解細(xì)胞，按試劑盒步驟抽提細(xì)胞總RNA。以RNA為模板，采用SuperRT cDNA 合成試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。以cDNA為模板，加入FastSYBR Mixture和引物，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器進(jìn)行擴(kuò)增。熱循環(huán)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95℃，20s；40個(gè)循環(huán)(變性95℃，3 s；退火/延伸60℃，30s)。以α-actin為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct公式計(jì)算靶基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.4Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)：收集細(xì)胞，去除培養(yǎng)基，用PBS洗滌，加入蛋白提取緩沖液和蛋白酶抑制劑，充分裂解細(xì)胞。離心，收集上清液，采用蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)量蛋白濃度。將蛋白樣品和上樣緩沖液混合，沸水煮沸10min使蛋白變性。配置濃縮膠和分離膠，按每孔30μg進(jìn)行上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。采用半干法轉(zhuǎn)模，轉(zhuǎn)模完成后，將膜放入5%脫脂奶粉中，室溫封閉1h。將膜放入到一抗抗體的稀釋液中，4℃搖床過(guò)夜孵育。一抗孵育結(jié)束后，TBST洗膜，加入到二抗的稀釋液中，室溫孵育1h。二抗孵育完成后，TBST洗膜。配置ECL發(fā)光液，將發(fā)光液均勻涂抹膜上，孵育2min，將膜放入成像儀中，進(jìn)行成像和拍照。

1.2.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染：根據(jù)CTRP6的cDNA序列，設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的引物，進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物回收、酶切和純化后，插入到pcDNA3.1載體，轉(zhuǎn)化受態(tài)細(xì)胞。挑選陽(yáng)性克隆，進(jìn)行測(cè)序鑒定，測(cè)序正確的單克隆進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右時(shí)，采用TransIntro EL轉(zhuǎn)染試劑，將pcDNA3.1-CTRP6或PCNDA3.1空載體轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞中。將0.8μg質(zhì)粒和50μL Opti-MEM培養(yǎng)基混合；加入1.6μL轉(zhuǎn)染試劑，輕柔混合，室溫孵育15min。然后，將上述混合物加入到細(xì)胞中，于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h；更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h。

1.2.6CK-MB活性測(cè)定：細(xì)胞處理后，離心收集培養(yǎng)基上清，取40μL上清液加入到比色皿中。然后，加入800μL試劑R1和400μL試劑R2，混勻，37℃孵育2min。采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定340nm波長(zhǎng)的吸光度值，計(jì)算CK-MB活性。

1.2.7cTn-I濃度測(cè)定：細(xì)胞處理后，離心收集培養(yǎng)基上清，加入到96孔培養(yǎng)板中(50μL/孔)。然后，每孔加入50μL混合抗體，封閉細(xì)胞培養(yǎng)板，室溫?fù)u床孵育1h。洗滌并徹底干燥細(xì)胞培養(yǎng)孔，每孔加入100μL TMB溶液，室溫?fù)u床孵育10min后，每孔加入100μL終止反應(yīng)液，室溫?fù)u床孵育1min。采用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm波長(zhǎng)的吸光度值，計(jì)算cTn-I濃度。

1.2.8TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡：細(xì)胞處理后，去除培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞。PBS洗滌細(xì)胞，加入含0.3% Triton X-100的PBS，透化細(xì)胞。PBS洗滌細(xì)胞，每孔加入50μL TUNEL檢測(cè)液，于37℃避光孵育60min。去除反應(yīng)液，PBS洗滌細(xì)胞，加入DAPI溶液，室溫避光孵育10min。抗熒光淬滅封片液封片后，采用熒光顯微鏡觀察和拍照。

1.2.9ELISA檢測(cè)炎癥因子濃度：細(xì)胞處理后，離心收集培養(yǎng)基上清，加入到酶標(biāo)板中(100μL/孔)。酶標(biāo)板覆膜，于37℃孵育90min。去除孔內(nèi)液體，每孔加入生物素抗體工作液100μL，于37℃孵育60min。去除孔內(nèi)液體，每孔加入洗滌液350μL，浸泡1min，重復(fù)洗板3次。加入酶結(jié)合物工作液100μL，于37℃孵育30min。重復(fù)洗板5次，每孔加TMB溶液90μL，于37℃避光孵育15min。每孔加終止液50μL，終止反應(yīng)。立即用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm波長(zhǎng)的吸光度值，計(jì)算炎癥因子濃度。

2 結(jié) 果

2.1CBV3感染對(duì)CTRP6在心肌細(xì)胞中的表達(dá)水平的影響：RT-qPCR結(jié)果表明，CBV3感染后心肌細(xì)胞中CTRP6的mRNA表達(dá)量降低，與正常組細(xì)胞相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見(jiàn)圖1A)。Western blotting結(jié)果顯示，CBV3感染后心肌細(xì)胞中CTRP6的蛋白表達(dá)量降低，與正常組細(xì)胞相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見(jiàn)圖1B和C)。

圖1 CBV3感染對(duì)CTRP6在心肌細(xì)胞中的表達(dá)水平的影響注：A為RT-qPCR檢測(cè)CTRP6的mRNA表達(dá)水平；B為Western blotting檢測(cè)CTRP6的蛋白表達(dá)水平；C為CTRP6蛋白定量圖。與正常組比較，**P<0.01

2.2轉(zhuǎn)染CTRP6表達(dá)質(zhì)粒對(duì)CTRP6表達(dá)水平的影響：與CBV3+空載體組相比，轉(zhuǎn)染CTRP6表達(dá)載體可提高CBV3感染的心肌細(xì)胞中的CTRP6的mRNA和蛋白表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見(jiàn)圖2)。

圖2 轉(zhuǎn)染CTRP6表達(dá)質(zhì)粒對(duì)CTRP6在CBV3感染的心肌細(xì)胞中的表達(dá)水平的影響注：A為RT-qPCR檢測(cè)CTRP6的mRNA表達(dá)水平；B為Western blotting檢測(cè)CTRP6的蛋白表達(dá)水平；C為CTRP6蛋白定量圖。與正常組比較，**P<0.01；與CBV3+空載體組比較，&&P<0.01

2.3CTRP6過(guò)表達(dá)對(duì)CBV3感染誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響：與正常組相比，CBV3感染上調(diào)心肌損傷標(biāo)志物CK-MB和cTn-I的活性水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表1。與CBV3+空載體組相比，過(guò)表達(dá)CTRP6可降低CBV3感染的心肌細(xì)胞中CK-MB和cTn-I的活性水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 CTRP6過(guò)表達(dá)對(duì)CBV3感染誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響

2.4CTRP6過(guò)表達(dá)對(duì)CBV3誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響：與正常組相比，CBV3感染組Bax蛋白水平上調(diào)，而B(niǎo)cl2蛋白水平下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見(jiàn)圖3)。在CBV3感染的心肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)CTRP6可下調(diào)Bax蛋白水平，而上調(diào)Bcl2蛋白水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見(jiàn)圖3)。TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組相比，CBV3感染組心肌細(xì)胞凋亡比例增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見(jiàn)圖4)。與CBV3+空載組相比，過(guò)表達(dá)CTRP6可減少CBV3誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見(jiàn)圖4)。

圖3 Western blotting檢測(cè)CTRP6過(guò)表達(dá)對(duì)CBV3感染的心肌細(xì)胞中Bax和Bcl2表達(dá)的影響注：與正常組比較，**P<0.01；與CBV3+空載體組比較，&&P<0.01

圖4 TUNEL檢測(cè)CTRP6過(guò)表達(dá)對(duì)CBV3感染誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響注：與正常組比較，**P<0.01；與CBV3+空載體組比較，&&P<0.01

2.5CTRP6過(guò)表達(dá)對(duì)CBV3誘導(dǎo)的炎癥因子釋放的影響：LISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組相比，CBV3感染增加炎癥因子IL-1β，TNF-α和IL-18在心肌細(xì)胞中的釋放量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見(jiàn)表2)。與CBV3+空載組相比，過(guò)表達(dá)CTRP6可以減少CBV3感染誘導(dǎo)的IL-1β，TNF-α和IL-18炎癥因子的釋放，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 CTRP6過(guò)表達(dá)對(duì)CBV3誘導(dǎo)的炎癥因子釋放的影響

2.6CTRP6過(guò)表達(dá)對(duì)CBV3誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體激活的影響：與正常組相比，CBV3感染可上調(diào)NLRP3、ASC和Caspase-1的蛋白表達(dá)量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見(jiàn)圖5)，表明NLRP3炎癥小體活性升高。與CBV3+空載組相比，過(guò)表達(dá)CTRP6可以降低CBV3感染誘導(dǎo)的NLRP3、ASC和Caspase-1的蛋白表達(dá)上調(diào)，與CBV3+空載體組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見(jiàn)圖5)，表明NLRP3炎癥小體的活性降低。

圖5 Western blotting檢測(cè)CTRP6過(guò)表達(dá)對(duì)CBV3誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體激活的影響注：與正常組比較，**P<0.01；與CBV3+空載體組比較，&&P<0.01

2.7AdipoR1敲除對(duì)CTRP6介導(dǎo)的心肌保護(hù)作用的影響：與CBV3+CTRP6載體+control siRNA組相比，CBV3+CTRP6載體+AdipoR1 siRNA組AdipoR1表達(dá)水平減少，而NLRP3、ASC和Caspase-1的蛋白表達(dá)水平增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見(jiàn)圖6)。另外，敲除AdipoR1也阻斷了CTRP6過(guò)表達(dá)對(duì)CBV3誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷和炎癥因子的釋放)的抑制效應(yīng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表3、表4。

表3 AdipoR1敲除對(duì)CTRP6調(diào)控的CBV3誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響

表4 AdipoR1敲除對(duì)CTRP6調(diào)控的CBV3誘導(dǎo)的炎癥因子釋放的影響

圖6 Western blotting檢測(cè)AdipoR1敲除對(duì)CTRP6調(diào)控的CBV3誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體激活的影響注：與正常組比較，**P<0.01；與CBV3+空載體組比較，&&P<0.01；與CBV3+CTRP6載體+ control siRNA組比較，@@P<0.01

3 討 論

CBV3感染心肌細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致大量基因異常表達(dá)和調(diào)控，促進(jìn)炎癥和心肌細(xì)胞損傷的發(fā)展。探尋CBV3感染心肌細(xì)胞中異常表達(dá)的新基因，研究其對(duì)心肌炎細(xì)胞損傷的調(diào)控作用，是目前研究熱點(diǎn)，有望為病毒性心肌炎的基因治療提供可參考的靶標(biāo)分子和理論基礎(chǔ)。CBV3感染心肌細(xì)胞是研究病毒性心肌炎疾病的一個(gè)常用細(xì)胞模型。CBV3感染會(huì)引起炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，從而造成心肌細(xì)胞損傷，導(dǎo)致心肌功能障礙。本項(xiàng)目通過(guò)建立CBV3感染心肌細(xì)胞模型，檢測(cè)CTRP6對(duì)CBV3感染引起的炎癥、細(xì)胞凋亡和損傷的作用，初步探討CTRP6在病毒性心肌炎疾病中可能的調(diào)控作用。

CTRP6具有心臟保護(hù)作用。在小鼠心肌中特異性過(guò)表達(dá)CTRP6可減輕阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性和心肌細(xì)胞凋亡，改善心臟功能[8]。關(guān)于CTRP6是否在病毒性心肌炎細(xì)胞損傷中發(fā)揮心肌保護(hù)作用，目前還沒(méi)有相關(guān)研究。因此，本研究探討了CTRP6對(duì)CBV3誘導(dǎo)的心肌炎細(xì)胞損傷的調(diào)控作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在心肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)CTRP6可顯著下調(diào)CBV3感染引起的炎癥、心肌細(xì)胞凋亡和損傷。本項(xiàng)目研究結(jié)果進(jìn)一步明確了CTRP6的心臟保護(hù)作用，拓展了其對(duì)病毒性心肌炎細(xì)胞損傷的保護(hù)效應(yīng)。

CTRP6對(duì)NLRP3炎癥小體的活化具有抑制作用[9]。NLRP3炎癥小體的激活和病毒性心肌炎密切相關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)CBV3感染的心肌細(xì)胞中NLRP3，ASC和Caspase-1的蛋白水平顯著上調(diào)，表明CBV3感染激活了NLRP3炎癥小體。過(guò)表達(dá)CTRP6可顯著下調(diào)CBV3感染的心肌細(xì)胞中NLRP3、ASC和Caspase-1的表達(dá)水平，表明CTRP6對(duì)NLRP3炎癥小體具有抑制作用。本研究進(jìn)一步證明了CTRP6對(duì)NLRP3炎癥小體的抑制性調(diào)控作用。因此，CTRP6調(diào)控的NLRP3炎癥小體通路在病毒性心肌炎的進(jìn)展過(guò)程中可能具有十分重要的作用。

CTRP6和脂聯(lián)素結(jié)構(gòu)相似，主要通過(guò)脂聯(lián)素受體AdipoR1發(fā)揮作用[10]。據(jù)報(bào)道，AdipoR1可以抑制NLRP3炎癥小體的激活[11]。為了研究CTRP6是否通過(guò)AdipoR1抑制病毒性心肌炎中NLRP3炎癥小體的激活，本研究采用siRNA沉默技術(shù)敲除了AdipoR1在心肌細(xì)胞中的表達(dá)，然后檢測(cè)抑制AdipoR1是否會(huì)阻斷CTRP6對(duì)NLRP3炎癥小體的抑制作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲除AdipoR1顯著阻斷了CTRP6對(duì)CBV3誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體激活的抑制作用。另外，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敲除AdipoR1也可逆轉(zhuǎn)CTRP6對(duì)CBV3誘導(dǎo)的炎癥和心肌細(xì)胞損傷的抑制作用。因此，本項(xiàng)目研究結(jié)果表明CTRP6通過(guò)AdipoR1調(diào)控NLRP3炎癥小體，從而抑制CBV3感染誘導(dǎo)的心肌炎細(xì)胞損傷。綜上所述，本研究表明CTRP6通過(guò)作用于AdipoR1抑制NLRP3炎癥小體的激活來(lái)減輕CBV3感染誘導(dǎo)的心肌炎細(xì)胞損傷，為了解病毒性心肌炎的發(fā)生和進(jìn)展提供了一個(gè)新的分子作用機(jī)制。鑒于CTRP6的心臟保護(hù)作用，CTRP6可作為病毒性心肌炎基因治療的一個(gè)潛在靶基因。但是，本研究結(jié)果主要是通過(guò)體外CBV3感染心肌細(xì)胞模型得到的，存在一定的局限性。因此，關(guān)于CTRP6在病毒性心肌炎中的明確作用，需要通過(guò)動(dòng)物模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步的研究和驗(yàn)證。