張霄霄，邵海連，戈偉，汪定成，董軻，應(yīng)后群

1.中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科，陜西 西安 710038；

2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，江西 南昌 330006

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)是感染的主要病原菌之一，由于其耐藥性的產(chǎn)生，導(dǎo)致臨床治療困難，降低其耐藥性是臨床治療的重要途徑之一[1]。萬古霉素是臨床上治療MRSA的首選藥，但其不合理使用會導(dǎo)致耐萬古霉素菌株的菌株產(chǎn)生，從而導(dǎo)致MRSA感染的治療變得十分困難[2]。細菌耐藥性與生物膜的形成有關(guān)，生物膜是病原體在體內(nèi)外黏附于物體表面，通過細菌和胞外多聚物、細胞外基質(zhì)連接形成的高度組織化結(jié)構(gòu)。有研究表明中藥具有抗MRSA生物膜產(chǎn)生的作用，可降低其耐藥性[3]，如桂皮中的桂皮醛、黃芩中的黃芩苷以及人參中的人參皂苷Rh2等。桂皮醛能顯著增強萬古霉素抗MRSA生物膜的作用[4]，黃芩苷能破壞金黃色葡萄球菌生物膜的形成，增強萬古霉素對其清除作用[5]。而人參皂苷Rh2是人參的主要有效成分，其不僅有著改善記憶、神經(jīng)保護等藥理作用，還具有抑菌活性和抑菌生物膜的功能[6-7]，且人參皂苷Rh2單體能抑制金黃色葡萄球菌生物被膜的形成[8]。本實驗旨在研究人參皂苷Rh2聯(lián)合萬古霉素對萬古霉素耐藥型耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生物膜和抑菌效果的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑及培養(yǎng)基人參皂苷Rh2購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，批號：150108，純度：＞98%；注射用鹽酸萬古霉素購自重慶萊美藥業(yè)股份有限公司，批號：160814，規(guī)格：500 mg；胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)購自武漢純度生物科技有限公司，貨號：CD-B2007S-PYJ。

1.1.2 儀器及試劑盒逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司，貨號：WE0149-NXR；ELX808酶標儀購自美國Bio-Tek公司；BS-MFL-01麥氏比濁儀購自北京金洋萬達科技有限公司；Bio-rad分光光度計購自北京賽百奧科技有限公司。

1.2 萬古霉素耐藥型耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的誘導(dǎo)收集本院臨床分離并鑒定的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)，用接種環(huán)挑取單個菌落于含萬古霉素濃度為1μg/mL的TSB培養(yǎng)基中，于35℃下培養(yǎng)24 h，選取生長的菌落用下一濃度(比前一次增加1μg/mL)的萬古霉素TSB培養(yǎng)基培養(yǎng)，同時每一濃度連續(xù)傳代4次以穩(wěn)定萬古霉素耐藥特征，直至在含16μg/mL的萬古霉素的培養(yǎng)上仍能生長的菌落作為萬古霉素耐藥型耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(vancomycinresistant S.aureus，VRSA)；原始分離的命名為萬古霉素敏感型耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(vancomycinsensitive S.aureus，VSSA)。

1.3 細胞處理與分組VRSA分別用10μg/mL、30μg/mL、90μg/mL人參皂苷Rh2處理，作為不同濃度人參皂苷Rh2處理組；VRSA分別用1μg/mL、4μg/mL、16μg/mL萬古霉素處理，作為不同濃度萬古霉素處理組；10μg/mL人參皂苷Rh2和1μg/mL萬古霉素共同作用VRSA記為10μg/mL人參皂苷Rh2+1μg/mL萬古霉素組；不作處理的VRSA作為空白對照組；原始分離的對萬古霉素敏感型的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌作為VSSA組。

1.4 生物膜形成實驗挑取單個菌落于4 mL TSB培養(yǎng)基中35℃，120 r/min震蕩培養(yǎng)24 h，將菌液調(diào)至0.5麥氏濁度，然后吸取10μL至含190μL TSB培養(yǎng)液的96孔板中，35℃培養(yǎng)24 h后每孔用蒸餾水輕輕漂洗3次，干燥固定1 h后加入100μL結(jié)晶紫溶液室溫染色10 min，蒸餾水洗去過量染料，待干燥后用酶標儀檢測590 nm處吸光度值(A)，實驗重復(fù)3次，每次設(shè)3個復(fù)孔。

1.5 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測fnbA、atlA表達水平各組菌液培養(yǎng)至對數(shù)生長期時用Trizol試劑提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進行PCR，其反應(yīng)體系總共為25μL，其中EvaGreen 2×qPCR MasterMix-ROX 12.5μL，上下游引物各0.5μL，cDNA 2μL，ddH2O 9.5μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)。以16s RNA為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算相對表達量。fnbA上游引物序列：5'-TGGTGTCGGTGGCGTTGGTG-3'，下游引物序列：5'-GCGAAGCAGGTCACGTTGGAG-3'；atlA上游引物序列：5'-AACAGCACCAACGGATTAC-3'，下游引物序列：5'-CATAGTCAGCATAGTTATTCATTG-3'；16sRNA上游引物序列：5'-CGTGCTACAATGGACAATACAAA-3'，下游引物序列：5'-ATCTACGATTACTAGCGATTCCA-3'。

1.6 菌活性檢測各實驗組分別挑取單個菌落于TSB培養(yǎng)液中在35℃、120 r/min條件下震蕩培養(yǎng)24 h，用分光光度計檢測600 nm處吸光度值(A)，實驗重復(fù)3次，每次設(shè)3個復(fù)孔。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS20.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，兩兩比較行兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VSSA組與VRSA組的生物膜形成能力及生物膜形成相關(guān)基因比較與VSSA組比較，VRSA組生物膜的光密度值及fnbA、atlA的表達水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 VSSA組與VRSA組的生物膜形成能力及生物膜形成相關(guān)基因比較(±s，n=9)Table 1 Comparison of biofilm formation ability and biofilm formation related genes between VSSA group and VRSA group(±s,n=9)

表1 VSSA組與VRSA組的生物膜形成能力及生物膜形成相關(guān)基因比較(±s，n=9)Table 1 Comparison of biofilm formation ability and biofilm formation related genes between VSSA group and VRSA group(±s,n=9)

組別VSSA組VRSA組t值P值A(chǔ) 590 0.93±0.12 1.89±0.15 14.993 0.001 fnbA 1.00±0.18 5.73±0.24 47.300 0.001 atl A 1.00±0.19 3.64±0.22 27.246 0.001

2.2 人參皂苷Rh2和萬古霉素單用及聯(lián)用對VRSA增殖活性的影響與空白對照組比較，不同濃度人參皂苷Rh2處理的VRSA增殖活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。16μg/mL萬古霉素及10μg/mL人參皂苷Rh2+1μg/mL萬古霉素處理的VRSA增殖活性明顯降低；而10μg/mL人參皂苷Rh2+1μg/mL萬古霉素處理的VRSA增殖活性明顯低于不同濃度人參皂苷Rh2處理組，且明顯高于4μg/mL萬古霉素處理者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

表2 人參皂苷Rh2和萬古霉素單用及聯(lián)用對VRSA增殖活性的影響(±s，n=9)Table 2 Effects of Ginsenoside Rh2 and Vancomycin alone and in combination on proliferation of VRSA(±s,n=9)

表2 人參皂苷Rh2和萬古霉素單用及聯(lián)用對VRSA增殖活性的影響(±s，n=9)Table 2 Effects of Ginsenoside Rh2 and Vancomycin alone and in combination on proliferation of VRSA(±s,n=9)

注：與空白對照組比較，a P＜0.05，b P＜0.05；與10μg/m L人參皂苷Rh2+1μg/mL萬古霉素組比較，c P＜0.05，d P＜0.05，e P＜0.05，f P＜0.05，g P＜0.05。Note:Compared with blank control group,a P＜0.05,b P＜0.05;Compared with 10μg/mL ginsenoside Rh2+1μg/mL vancomycin group,c P＜0.05,d P＜0.05,e P＜0.05,f P＜0.05,g P＜0.05.

2.3 不同濃度人參皂苷Rh2對VRSA生物膜形成及相關(guān)基因表達的影響與空白對照組比較，不同濃度人參皂苷Rh2處理的VRSA生物膜的光密度值明顯降低，fnbA、atlA的表達水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表3。

表3 不同濃度人參皂苷Rh2對VRSA生物膜形成及相關(guān)基因表達的影響(±s，n=9)Table 3 Effects of different concentrations of ginsenoside Rh2 on VRSA biofilm formation and related gene expression(±s,n=9)

表3 不同濃度人參皂苷Rh2對VRSA生物膜形成及相關(guān)基因表達的影響(±s，n=9)Table 3 Effects of different concentrations of ginsenoside Rh2 on VRSA biofilm formation and related gene expression(±s,n=9)

注：與空白對照組比較，a P＜0.05，b P＜0.05，c P＜0.05，d P＜0.05，e P＜0.05，f P＜0.05，g P＜0.05，h P＜0.05，i P＜0.05。Note:Compared with the blank control group,a P＜0.05,b P＜0.05,c P＜0.05,d P＜0.05,e P＜0.05,f P＜0.05,g P＜0.05,h P＜0.05,i P＜0.05.

2.4 不同濃度萬古霉素對VRSA生物膜形成及相關(guān)基因表達的影響與空白對照組比較，不同濃度萬古霉素處理的VRSA中fnbA、atlA表達水平明顯升高；4μg/mL和16μg/mL萬古霉素處理的VRSA生物膜的光密度值明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表4。

表4 不同濃度萬古霉素對VRSA生物膜形成及相關(guān)基因表達的影響(±s，n=9)Table 4 Effects of different concentrations of vancomycin on VRSA biofilm formation and related gene expression(±s，n=9)

表4 不同濃度萬古霉素對VRSA生物膜形成及相關(guān)基因表達的影響(±s，n=9)Table 4 Effects of different concentrations of vancomycin on VRSA biofilm formation and related gene expression(±s，n=9)

注：與空白對照組比較，a P＜0.05，b P＜0.05，c P＜0.05，d P＜0.05，e P＜0.05，f P＜0.05，g P＜0.05，h P＜0.05，i P＜0.05。Note:Compared with the blank control group,a P＜0.05,b P＜0.05,c P＜0.05,d P＜0.05,e P＜0.05,f P＜0.05,g P＜0.05,h P＜0.05,i P＜0.05.

2.5 人參皂苷Rh2和萬古霉素聯(lián)用對VRSA生物膜形成及相關(guān)基因表達的影響與空白對照組比較，10μg/mL人參皂苷Rh2組及10μg/mL人參皂苷Rh2+1μg/mL萬古霉素組VRSA生物膜的光密度值及fnbA、atlA的表達水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而1μg/mL萬古霉素組VRSA生物膜的光密度值無顯著變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。fnbA、atlA的表達水平明顯升高；10μg/mL人參皂苷Rh2+1μg/mL萬古霉素組VRSA生物膜的光密度值及fnbA、atlA的表達水平均明顯高于10μg/mL人參皂苷Rh2組，但明顯低于1μg/mL萬古霉素組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表5。

表5 人參皂苷Rh2和萬古霉素聯(lián)用對VRSA生物膜形成及相關(guān)基因表達的影響(±s，n=9)Table 5 Effects of ginsenoside Rh2 combined with vancomycin on VRSA biofilm formation and related gene expression(±s，n=9)

表5 人參皂苷Rh2和萬古霉素聯(lián)用對VRSA生物膜形成及相關(guān)基因表達的影響(±s，n=9)Table 5 Effects of ginsenoside Rh2 combined with vancomycin on VRSA biofilm formation and related gene expression(±s，n=9)

注：與空白對照組比較，a P＜0.05，b P＜0.05，c P＜0.05，d P＜0.05，e P＜0.05，f P＜0.05，g P＜0.05，h P＜0.05；與10μg/mL人參皂苷Rh2+1μg/mL萬古霉素組比較，i P＜0.05，j P＜0.05，k P＜0.05，l P＜0.05，m P＜0.05，n P＜0.05。Note:Compared with the blank control group,by LSD-t test,a P＜0.05,b P＜0.05,c P＜0.05,d P＜0.05,e P＜0.05,f P＜0.05,g P＜0.05,h P＜0.05;And 10μg/mL ginsenoside Rh2+1μg/mL vancomycin group,i P＜0.05,j P＜0.05,k P＜0.05,l P＜0.05,m P＜0.05,n P＜0.05.

3 討論

MRSA是造成感染的主要病原體，隨著抗菌藥物的長期使用和濫用，其耐藥性日益嚴重，給臨床治療帶來巨大困難，增加MRSA菌株對抗生素的敏感性對臨床治療具有重要意義[9]。生物膜能夠阻滯抗生素和機體防御系統(tǒng)對膜內(nèi)細菌的殺傷，所以生物膜的形成是造成細菌耐藥的重要原因，抑制生物膜的形成是增強藥物敏感性的重要途徑[10]。fnbA基因可以編碼fnbA蛋白，fnbA蛋白主要負責金黃色葡萄球菌與宿主細胞和細胞外基質(zhì)進行黏附和生物被膜的形成。而atlA基因可以編碼產(chǎn)生細菌自溶素[11]。本實驗通過用不同濃度的萬古霉素誘導(dǎo)MRSA形成VRSA，與VSSA比較，VRSA中生物膜的光密度值顯著升高，fnbA、atlA表達水平明顯升高。說明VRSA的耐藥性可能與生物膜形成有關(guān)。

萬古霉素是MRSA感染患者的一線用藥[12]。本實驗用1μg/mL、4μg/mL、16μg/mL萬古霉素處理VRSA，結(jié)果顯示，萬古霉素可上調(diào)fnbA、atlA表達，4μg/mL、16 μg/mL萬古霉素可促進生物膜形成。而萬古霉素對VRSA抑菌作用較弱，僅濃度為16μg/mL的萬古霉素具有較強的抑菌效果。研究發(fā)現(xiàn)中藥提取物對MRSA具有抑菌作用，可調(diào)節(jié)其耐藥敏感性[13]。研究報道人參皂苷Rb1對金黃色葡萄球菌有一定的抑菌作用，濃度越高抑菌作用越強[14]。人參皂苷對金黃色葡萄球菌生物被膜具有顯著的抑制作用，隨著藥物濃度的增加，其抑制率顯著增加[15]。人參皂苷Rh2能在體外抑制致齲菌生物膜形成[16]。人參皂苷Rh2通過抑制NorA聯(lián)合環(huán)丙沙星增強其對金黃色葡萄球菌的抑菌作用[17]。本實驗結(jié)果顯示，不同濃度人參皂苷Rh2對VRSA菌活性無明顯影響，但人參皂苷可抑制VRSA生物膜形成和fnbA、atlA表達。說明人參皂苷Rh2可抑制VRSA生物膜形成，但抑菌效果不明顯。且本實驗用10μg/mL人參皂苷Rh2聯(lián)合1μg/mL萬古霉素作用可抑制VRSA生物膜形成和fnbA、atlA表達，且其比單獨萬古霉素處理，菌活性降低，說明兩者聯(lián)合作用可增強萬古霉素對VRSA的抑菌作用。

綜上所述，人參皂苷Rh2可抑制VRSA生物膜形成，但不抑菌；萬古霉素可抑菌但不能抑制生物膜形成，而兩者聯(lián)用能抑制生物膜形成且人參皂苷Rh2可增強萬古霉素的抑菌作用，其聯(lián)合作用機制仍有待進一步的研究證實。