賴家文，林麗云，王東翔，林鈺，黎倩，楊麗紅，陳健勤，劉靖

炎癥是機體遭受各種內(nèi)外刺激后的一種防御性反應，巨噬細胞是機體固有免疫的重要組成部分，同時也是產(chǎn)生炎癥反應的重要細胞?，F(xiàn)代研究[1]表明，巨噬細胞在炎癥性疾病的發(fā)生和炎癥維持中具有關鍵作用。因此從抗炎的角度研究和開發(fā)具有巨噬細胞保護作用的藥物對炎癥性疾病的治療具有重要意義。

中藥板藍根、大青葉、青黛都具有清熱解毒、涼血等功效[2-4]，現(xiàn)代研究早已證實以上3種中藥均具有良好的抗炎作用，中藥單體靛藍(indigo, IDG)是他們的共同主要有效活性成分之一[5-6]。近些年研究[7]發(fā)現(xiàn)，靛藍具有抗炎和抗腫瘤作用，但目前對于其治療臨床炎癥性疾病的研究相當罕見，靛藍對脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導THP-1細胞炎性反應的影響更是未見報道。基于此，本研究采用LPS建立THP-1細胞炎癥模型，觀察靛藍對LPS誘導的炎癥反應的影響，以期從細胞水平發(fā)掘靛藍的抗炎作用，為靛藍治療炎癥性疾病的開發(fā)和臨床合理應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細胞系 人巨噬細胞系(THP-1來源)，購自于武漢大學典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2藥物及主要試劑 靛藍(Indigo，IDG，純度100%)購自成都瑞芬思生物科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈雙抗、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；磷酸脂多糖(LPS)、二甲基亞砜(DMSO)均購自美國Sigma公司；MTT試劑盒、BCA試劑盒均購自上海碧云天公司； ELISA試劑盒包括：人IL-23p19 (Cat # 88-7237-86)、人IL-6(Cat # 88-7066-22)、人IL-8(Cat # 88-8086-22)、人TNF-α (Cat # 88-7346-88)、IL-1β (Catalog # 88-7261-88)及Prestained Protein Ladder均購自美國Thermo Scientific公司：Trizol Reagent、M-MLV試劑盒均購自美國Invitrogen 公司；Recombinant RNase Inhibitor、dNTP Mixture、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ MasterMix均購自日本TaKaRa公司；本實驗中所用的一抗：兔抗人Nrf2(16396-1-AP)、HO-1(10701-1-AP)均購自于Proteintech公司(武漢，中國)。二抗：山羊抗兔(#32460)購自美國Thermo Scientific公司。ECL化學發(fā)光顯色液購自美國BIO-RAD公司。

1.3主要儀器 HealForce HF90 型二氧化碳培養(yǎng)箱(香港力康生物醫(yī)療科技控股集團)、ABI 7500 型熒光定量PCR儀器(美國Applied Biosystems 公司)、酶標儀(德國Eppendorf公司)、C-Digit化學發(fā)光掃描儀(美國LI-COR公司)。

1.4細胞培養(yǎng) THP-1使用RPMI-1640(含10%胎牛血清，青、鏈霉素，谷氨酰胺及非營養(yǎng)必需氨基酸)培養(yǎng)，于37 ℃、5% CO2條件下進行常規(guī)培養(yǎng)和傳代操作。

1.5THP-1炎癥損傷模型制備 取對數(shù)生長期的THP-1細胞按2×106個/孔培養(yǎng)于6孔板，培養(yǎng)24 h后，加入終濃度為20 ng/mL LPS刺激24 h制備THP-1細胞炎癥損傷模型。

1.6RNA的提取、逆轉(zhuǎn)錄及定量PCR 每個培養(yǎng)孔加入250 μL Trizol Reagent，按說明書提取RNA，以Nanodrop 2000超微量紫外/可見光光度計(美國Thermo Scientific公司)測定RNA濃度；按M-MLV說明書進行逆轉(zhuǎn)錄。使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ Master Mix配制20 μL定量PCR反應體系。每個反應使用模板cDNA 0.5 μg。使用ABI 7500 型熒光定量PCR儀器進行擴增及定量檢測；擴增條件為95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個周期。以融解曲線判斷是否存在非特異擴增。每個樣品測3個重復孔，檢測結果取均值。引物序列見表1。

表1 定量PCR引物序列表Tab.1 Real-time PCR primer sequences.

1.7酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA) 不同濃度的靛藍干預1 h后，收集各組細胞培養(yǎng)上清，用ELISA試劑盒檢測其中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-23p19和TNF-α細胞因子的含量，具體操作按說明書進行。

1.8Western blot實驗檢測 收集THP-1細胞，按RIPA裂解液說明書得到總蛋白，BCA法定量后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后將條帶電轉(zhuǎn)至0.2 μm PVDF膜上。5%牛血清白蛋白室溫封閉3 h，加入適當濃度的一抗4 ℃孵育過夜，再置于1∶1 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗溶液中室溫孵育2 h，洗膜后加入ECL發(fā)光液顯色，美國LI-COR公司的C-Digit化學發(fā)光掃描儀進行掃描拍照。照片通過使用ImageJ軟件進行光密度分析。計算時采用各指標與β-actin的光密度比值的相對表達量。

1.9統(tǒng)計學處理 使用 SPSS26.0 統(tǒng)計學軟件根據(jù)數(shù)據(jù)性質(zhì)進行統(tǒng)計分析。計量資料進行K-S(Kolmogorov-Smirnor)檢驗，是否符合正態(tài)分布，以P>0.05認為符合正態(tài)分布。對于符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，其中符合正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)，兩兩比較采用LSD檢驗；對于方差不齊的數(shù)據(jù)，兩兩比較使用Tamhance′sT2檢驗；對于不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，采用非參數(shù)檢驗的“Indepen-dent-SamplesKruskal-WallisText”。檢驗結果P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。使用Graphpad prism 8.0作圖。

2 結果

2.1靛藍對LPS誘導的THP-1細胞炎癥相關因子mRNA表達的影響 與空白組比較，LPS刺激24 h后，IL-1β、IL-6、IL-8、IL-23p19及TNF-α mRNA的表達均顯著增高(P<0.05)。0.4 μmol/L和4 μmol/L濃度的靛藍干預后均可下調(diào)LPS誘導的IL-1β、IL-6、IL-8、IL-23p19和TNF-α的mRNA表達水平(P<0.05)；40 μmol/L濃度的靛藍亦可顯著抑制IL-6、IL-23p19、TNF-α的轉(zhuǎn)錄(P<0.01)，對IL-1β和IL-8的抑制作用雖無統(tǒng)計學意義，但較LPS組相比，仍表現(xiàn)出抑制作用。結果表明，靛藍可通過下調(diào)相關炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，阻斷LPS誘導的炎癥反應，發(fā)揮對THP-1細胞的保護作用，其中0.4 μmol/L和4 μmol/L這兩個濃度作用效果更明顯，見圖1。

Note: Compared with blank group#P<0.05, ##P<0.01, ####P<0.000 1；compared with LPS group *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.000 1.圖1 靛藍對各細胞因子mRNA表達的影響Fig.1 Effects of indigo on mRNA expression of cytokines

2.2靛藍對LPS刺激的THP-1細胞培養(yǎng)上清中炎癥細胞因子含量的影響 經(jīng)LPS刺激后，培養(yǎng)上清中的IL-1β、IL-6、IL-8、IL-23p19、TNF-α這4種炎癥細胞因子的含量均顯著升高(P<0.001)。4 μmol/L的靛藍對上述炎癥因子的表達均有顯著抑制作用(P<0.05)，而0.4 μmol/L和40 μmol/L濃度的靛藍亦可顯著抑制IL-1β、IL-8、IL-23和TNF-α的表達(P<0.05)，但它們下調(diào)IL-6的表達差異無明顯統(tǒng)計學意義。說明不同濃度的靛藍均可發(fā)揮一定的抗炎作用，其中4 μmol/L濃度的靛藍作用效果最明顯，見圖2。

Note: Compared with blank group###P<0.001,####P<0.000 1；compared with LPS group *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.00 1,****P<0.000 1.圖2 靛藍對細胞培養(yǎng)上清中各炎癥因子表達含量的影響Fig.2 Effects of indigo on the expression of inflammatory factors

2.3靛藍對Nrf2/HO-1細胞信號通路的影響 LPS可顯著抑制Nrf2、HO-1信號通路相關蛋白的表達，且其差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而靛藍處理后可增加Nrf2、HO-1信號通路的表達(P<0.05)；提示靛藍可能通過刺激Nrf2/HO-1信號通路，參與抑制LPS誘導的THP-1細胞相關炎癥反應，見圖3。

Note: Compared with blank group #P<0.05, ##P<0.01, ####P<0.000 1；compared with LPS group *P<0.05, **P<0.01, ****P<0.000 1.圖3 靛藍對THP-1細胞中Nrf2、HO-1蛋白表達含量的影響Fig.3 Effects of indigo on the content of Nrf2 and HO-1 proteins

3 討論

近年來，很多常用中藥及其有效活性成分都被證實可從免疫調(diào)節(jié)、抑制炎癥、促進細胞凋亡等不同方面發(fā)揮治療作用，從植物中發(fā)掘新型抗炎藥物，研究其抗炎作用并探討其機制，是當今研究熱點之一。靛藍是常用清熱解毒中藥板藍根、大青葉、青黛的共同有效活性成分，雖有初步研究表明靛藍具有抗炎作用，但大部分僅停留在網(wǎng)絡藥理、動物實驗等層面，在細胞層面研究較少，具體機制仍不清楚。

THP-1 細胞可經(jīng)過誘導分化為成熟的巨噬細胞，常用于單核細胞和巨噬細胞相關的機制研究中[8]。LPS是一種來自革蘭氏陰性細菌外膜的特異性抗原復合物，是免疫系統(tǒng)最有效的激活劑之一[9]。LPS能與巨噬細胞表面的Toll樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)結合，激活相關炎癥信號通路，促使IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、IL-23等炎性細胞因子的表達，引起機體過度的免疫反應和炎癥損傷，是建立THP-1細胞炎癥模型公認的造模方法之一[10]。本實驗采用LPS刺激THP-1細胞24 h以模擬THP-1巨噬細胞炎癥模型，通過ELISA及qRT-PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)，用20 ng/mL濃度的LPS刺激24 h后，THP-1細胞中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-23p19及TNF-α的表達均有不同程度的升高，且與空白組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明本實驗的炎癥模型構建成功。有趣的是，本實驗結果表明，靛藍干預后，可以顯著抑制IL-1β、IL-6、IL-8、IL-23p19及TNF-α的表達，且在低濃度時就具有較好的抑制作用，說明靛藍具有良好的抗炎效果，是治療炎癥性疾病的潛力藥物。

炎癥損傷可引起細胞活性氧升高，而過量的ROS可誘導CD4+T淋巴細胞向輔助性T(helper T cell，Th)17細胞增殖分化，進而分泌大量炎癥因子如IL-17、IL-22、TNF-α等，擴大炎癥反應[11-12]。多種炎癥性疾病使用抗氧化劑藥物治療后可取得較好的療效[13-14]。Nrf2/HO-1信號通路是防御氧化應激的重要通路之一，在生理條件下，Nrf2主要存在于細胞質(zhì)中；刺激后，Nrf2將迅速轉(zhuǎn)移到細胞核中，并且通過激活靶基因啟動子區(qū)的抗氧化反應元件進一步激活HO-1的表達，以防止細胞氧化損傷，從而緩解損傷及炎癥反應[15]。在某些炎癥性疾病如銀屑病、特應性皮炎、炎癥性腸病等的發(fā)病機制中，已證實某些促炎細胞因子如IL-17、IL-1β和TNF-α等可產(chǎn)生過量的活性氧代謝產(chǎn)物，導致相關免疫細胞激活，進一步刺激炎癥的發(fā)展[16]。本實驗表明靛藍可誘導Nrf2、HO-1的表達，說明靛藍可以激活Nrf2/HO-1信號通路，可能通過抗氧化應激途徑發(fā)揮抗炎作用；但其是否確實清除了細胞中的ROS，以及其抑制相關炎癥因子的表達與其抗氧化作用之間的關系，仍需進一步實驗探索。

巨噬細胞對調(diào)控皮膚微環(huán)境變化和宿主炎癥反應的過程至關重要。本研究從治療銀屑病的常用中藥板藍根、大青葉、青黛的共同有效成分靛藍入手，探索中藥單體靛藍對巨噬細胞炎癥反應的作用。實驗首次證實靛藍在LPS誘導的THP-1細胞炎癥模型上的治療效果，同時首次證明靛藍可下調(diào)Nrf2/HO-1信號通路，提示靛藍可能是抗炎的潛力藥物，同時也為青黛、大青葉、板藍根等中藥治療銀屑病提供新的科學依據(jù)。