劉慧香，李啟艷，牛水蛟，劉瑩，崔玉花，于海英

（山東省食品藥品檢驗研究院，國家藥品監(jiān)督管理局化妝品原料質(zhì)量控制重點(diǎn)實驗室，濟(jì)南 250101）

玉竹為百合科植物玉竹的干燥根莖[1]，廣布于歐亞大陸溫帶地區(qū)，其生長于我國大部分省區(qū)。野生玉竹主產(chǎn)于我國東北三省及內(nèi)蒙古地區(qū)，又稱為“關(guān)玉竹”。種植玉竹主產(chǎn)于湖南、浙江、廣東、貴州、江西等地，產(chǎn)于湖南的“湘玉竹”產(chǎn)量大，品質(zhì)好[2]。玉竹最早以葳蕤之名載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，1963年開始載入《中國藥典》?！吨袊幍洹酚涊d玉竹味甘，性微寒，歸肺經(jīng)、胃經(jīng)。玉竹養(yǎng)陰潤燥，生津止渴，主治肺胃陰傷，燥熱咳嗽，咽干口渴，內(nèi)熱消渴[1]。2002 年衛(wèi)生部將玉竹納入藥食同源物品名單。如今玉竹不僅作為配伍藥材應(yīng)用于中藥處方，在民間食療、保健方面應(yīng)用也非常廣泛，如玉竹茶、玉竹飲料均深受歡迎[3-5]，另外玉竹多糖也可與甘油協(xié)同使用制備保濕護(hù)膚品[6-7]。

現(xiàn)代研究表明，玉竹中含有多糖、甾體皂苷、黃酮、生物堿、強(qiáng)心苷等多種成分，玉竹多糖為其主要活性物質(zhì)[8-9]。文獻(xiàn)調(diào)研表明，玉竹增強(qiáng)免疫活性、輔助降血糖、輔助降血脂、抗氧化、抗疲勞等多種功效均與玉竹多糖密切相關(guān)，其中多糖的單糖組成、糖苷鍵類型及空間結(jié)構(gòu)均會影響其生物活性[10-17]。玉竹多糖主要由果糖、葡聚糖、甘露糖等聚合而成，如玉竹黏多糖和玉竹果聚糖。研究表明玉竹多糖含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))一般為6.51%～10.27%[18]。玉竹多糖含量受產(chǎn)地、生長年限、采收時間等因素影響，湖南產(chǎn)的玉竹多糖含量較高，野生品玉竹多糖含量高于栽培品，三年生玉竹多糖含量高于兩年生玉竹，且三年生9 月下旬至10 月上旬采收的玉竹多糖含量最高[19]。中藥多糖由于其分子量大、缺乏發(fā)光基團(tuán)，《中國藥典》多采用硫酸-苯酚法或硫酸-蒽酮法進(jìn)行測定，另有采用液相色譜法和氣相色譜法測定多糖水解后單糖組成及含量[20]。比色法簡便易行，其準(zhǔn)確度受待測多糖單糖組成的影響；色譜方法選擇性好，但操作繁瑣，對儀器設(shè)備要求較高。

筆者建立了硫酸-苯酚法測定玉竹藥材中多糖，并重點(diǎn)分析了提取方法、沉淀用醇的濃度和沉淀時間對多糖含量測定結(jié)果的影響。與藥典方法相比，樣品處理省去了濃縮步驟，提取過程更簡便高效；醇沉淀時間適當(dāng)延長，使多糖沉淀更完全，測定結(jié)果更加穩(wěn)定、可靠。該法可為玉竹藥材的質(zhì)量控制提供數(shù)據(jù)支撐。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

電子分析天平：MS105DU 型，感量為0.01 mg，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

紫外分光光度計：TU1901 型，北京普析通用公司。

離心機(jī)：TDZ5-WS 型，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

渦旋混合器：XK96-B型，姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司。

濃硫酸：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

苯酚溶液：0.04 g/mL，準(zhǔn)確稱取4.0 g苯酚固體，加少量蒸餾水溶解，移至100 mL 容量瓶中，加水定容至標(biāo)線，避光保存。

葡萄糖對照品：純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為100%，中國食品藥品檢定研究院。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲備液：600 μg/mL，精確稱取干燥至恒重的葡萄糖對照品60.00 mg，加水溶解并定容至100 mL容量瓶中。

無水乙醇：分析純，天津市康科德科技有限公司。

玉竹樣品：共收集19批玉竹藥材，其中7批來自湖南，編號為YZ-1-7；3 批來自廣東，編號為YZ-8-10；3批來自東北，編號為YZ-11-13；5批來自浙江，編號為YZ-14-18；1 批來自河北，編號為YZ-19。以上藥材均經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)田景振教授鑒定為百合科植物玉竹的干燥根莖。經(jīng)干燥、粉碎、過篩后，保存于干燥器中備用。

實驗用水為超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制

分別精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲備液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0 mL，置于50 mL 容量瓶中，用水稀釋至標(biāo)線。精密量取上述各溶液2 mL，另取蒸餾水2 mL 作空白對照，置于具塞試管中，加入苯酚溶液1 mL，混勻，迅速加入硫酸7.0 mL，搖勻。于40℃水浴中保溫30 min，取出，置冰水浴中5 min，取出，以相應(yīng)試劑為空白，用紫外分光光度計測定490 nm波長的吸光度值。以溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.2.2 樣品測定

取玉竹樣品粗粉約l g，精密稱定，每個樣品平行取2份，置于平底燒瓶中，加入水100 mL，加熱回流1 h，趁熱過濾，至100 mL容量瓶中，加水至標(biāo)線，搖勻，精密量取2 mL，置于50 mL容量瓶中，加入無水乙醇8 mL，搖勻，置于冰箱中于4 ℃靜置12 h，離心，棄去上清液，加水定容至標(biāo)線，搖勻，得玉竹多糖樣品溶液。精密量取玉竹多糖樣品溶液2 mL，按照1.2.1 方法，自“加入苯酚溶液 l mL”起，依法測定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法得到溶液中葡萄糖質(zhì)量（μg），并計算玉竹樣品中多糖的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 測定波長的確定

取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和玉竹多糖樣品溶液，經(jīng)苯酚-硫酸法處理后，于200～800 nm 波長范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，獲得吸收曲線見圖1。由圖1 可知，葡萄糖在490 nm 波長處有最大吸收，玉竹多糖樣品在488 nm波長處有最大吸收，兩者最大吸收波長較為接近，符合藥典規(guī)定的試樣最大波長允許誤差范圍，故確定測定波長為490 nm。

圖1 溶液的紫外吸收曲線

2.2 樣品處理

2.2.1 提取方法的選擇

試驗考察了加熱回流、加熱煮沸及超聲提取對玉竹樣品中多糖含量測定值的影響。精密稱取玉竹樣品1 g，平行稱取9份，加水100 mL，其中3份加熱回流1 h，3 份煮沸1 h，3 份超聲提取1 h，其余按照1.2.2方法測定，結(jié)果列于表1。

表1 不同提取方法玉竹樣品中多糖含量測定結(jié)果 %

對表1中試驗數(shù)據(jù)采用進(jìn)行t檢驗統(tǒng)計分析，結(jié)果表明，加熱回流和加熱煮沸得到的玉竹多糖含量測定值無顯著差異（P＞0.05），而超聲提取得到的玉竹多糖測定值明顯低于前兩種方法（P＜0.05），可能由于超聲提取溫度較低，溶液中多糖不能得到充分提取，最終確定提取方法為加熱回流。

2.2.2 乙醇濃度的選擇

玉竹樣品經(jīng)一定濃度乙醇溶液沉淀將多糖分離后，消除了可溶性單糖、低聚糖及其它雜質(zhì)的干擾。不同的乙醇濃度對多糖的提取率有一定影響。戴平等研究了不同醇沉濃度對廣西莪術(shù)多糖含量的影響，發(fā)現(xiàn)使用75%（體積分?jǐn)?shù)，下同）的乙醇較為適宜[21]。試驗考察了不同濃度乙醇對玉竹多糖含量測定值的影響，比較了體積分?jǐn)?shù)分別為79%（藥典方法）、70%、75%、78%、80%、82%、85%、90%乙醇對玉竹多糖測定值的影響，不同濃度乙醇對應(yīng)的玉竹中多糖含量測定結(jié)果見圖2。

圖2 不同濃度乙醇對應(yīng)的玉竹中多糖含量測定值

由圖2可知，隨著乙醇濃度的升高，玉竹多糖含量測定值呈上升趨勢。當(dāng)乙醇的體積分?jǐn)?shù)達(dá)到85%、90%時，多糖含量測定值明顯增高，但當(dāng)乙醇的體積分?jǐn)?shù)不大于82%時，獲得的沉淀是無色透明膠狀物，而乙醇的體積分?jǐn)?shù)為85%、90%時，沉淀物漸變?yōu)榘咨腆w。高濃度乙醇獲得的沉淀中可能摻雜有其它物質(zhì)，導(dǎo)致測定結(jié)果偏高，這有待于結(jié)合紫外掃描進(jìn)一步確證。綜合多糖含量測定值及沉淀狀態(tài)，最終確定乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)為80%。

2.2.3 沉淀時間的選擇

試驗考察了乙醇沉淀0 h 和12 h 對玉竹多糖含量測定結(jié)果的影響。精密稱定本品1 g，平行稱取6份，進(jìn)行加熱回流提取。分別取多糖試液2 mL加無水乙醇8 mL，其中3份搖勻后立即離心，另3份搖勻后置于冰箱中于4 ℃放置12 h，其余按照1.2.2 方法測定，不同沉淀時間對應(yīng)的玉竹多糖含量測定結(jié)果見表2，經(jīng)t檢驗統(tǒng)計分析，結(jié)果表明，用乙醇于4 ℃沉淀12 h得到的玉竹多糖含量測定值顯著高于攪拌離心處理后的玉竹多糖含量測定值（P＜0.05），因此確定沉淀時間為12 h。

表2 不同沉淀時間對應(yīng)的玉竹多糖含量測定結(jié)果

2.3 線性關(guān)系

按照1.2.1 方法建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，線性范圍、線性方程及相關(guān)系數(shù)見表3。由表3可知，葡萄糖在0～120 μg質(zhì)量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 6。

表3 線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)

2.4 檢出限

參照GB/T 5009.1—2003《食品衛(wèi)生檢驗方法理化部分 總則》附錄A相關(guān)規(guī)定：檢出限為3倍空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差（測定次數(shù)n≥20）相對應(yīng)的質(zhì)量或濃度，吸光光度法按國際理論與應(yīng)用化學(xué)家聯(lián)合會規(guī)定計算。方法檢出限試驗數(shù)據(jù)見表4。由表4 可知，該方法檢出限為0.91 μg。

表4 方法檢出限試驗數(shù)據(jù)

2.5 精密度試驗

精密稱定同一編號混合均勻的玉竹藥材粉末6份，按照1.2.2方法測定，試驗結(jié)果見表5。由表5可知，6 份樣品玉竹多糖含量測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.15%，表明該方法精密度良好。

表5 精密度試驗結(jié)果 %

2.6 穩(wěn)定性試驗

按照1.2.2方法，分別于樣品制備完成后0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 h 測定吸光度，試驗結(jié)果見表6。由表6 可知，顯色后的溶液在6 h 內(nèi)吸光度基本不變，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.81%，表明顯色后溶液在6 h內(nèi)較為穩(wěn)定。

表6 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.7 加標(biāo)回收試驗

分別稱取已知含量的玉竹藥材粉末9份，分為3組，每組3 份樣品，每份約0.5 g，按照低、中、高3 個水平分別加入一定量的葡聚糖對照品，按照1.2.2方法進(jìn)行提取、測定，測定結(jié)果見表7。由表7可知，葡萄糖平均加標(biāo)回收率為95.9%～98.6%，表明該方法準(zhǔn)確度較高。

表7 加標(biāo)回收試驗結(jié)果

3 結(jié)語

建立了測定玉竹藥材中多糖含量的方法，對提取方法、醇沉濃度、醇沉?xí)r間分別進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定加熱回流提取、80%乙醇過夜進(jìn)行沉淀。以葡萄糖為對照，采用苯酚-硫酸法進(jìn)行比色測定。該方法具有操作簡便、穩(wěn)定性好、回收率高、經(jīng)濟(jì)實用的優(yōu)點(diǎn)，且不要求大型儀器，對于玉竹種植者，可以減少檢測成本、實用性更強(qiáng)。