王瑜婷，黃貴發(fā)，何榮榮，黃醒鵬，黎桃敏，孫建焱，陳江平

（1.廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，廣東佛山 528244；2.浙江一方制藥有限公司，浙江金華 321000）

皂角刺為豆科植物皂莢的干燥棘刺，味辛，性溫，歸肝、胃經，始載于《本草衍義補遺》，具有消腫托毒，排膿，殺蟲的功效[1-2]。皂角刺資源豐富，主要分布在我國河南、山東、河北等地。現(xiàn)代研究表明，皂角刺主要含有黃酮類、三萜類、酚酸類、香豆素類化合物，其中黃酮類化合物是其主要活性成分。花旗松素是皂角刺中含量較高的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗腫瘤、神經保護、改善心肌細胞纖維化等作用[3-6]。

2020 年版《中國藥典》一部中皂角刺的質量標準僅規(guī)定了藥材的性狀、顯微鑒別和薄層鑒別，沒有含量測定和特征圖譜檢驗項，難以有效地控制皂角刺藥材整體質量。中藥特征圖譜能較全面系統(tǒng)地反映中藥整體化學成分的特征信息，是目前公認的最適合中藥物質群質量控制的手段之一[7]，因此筆者采用高效液相色譜（HPLC）法建立皂角刺不同部位（主刺根、支刺根、刺尖）的特征圖譜，運用方差分析、熱圖和聚類分析、主成分分析等化學模式識別方法對其HPLC 特征圖譜進行統(tǒng)計分析，同時測定皂角刺不同部位的花旗松素含量，以期為皂角刺藥效物質基礎及質量控制研究奠定基礎。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Waters Arc 型，沃特世科技（上海）有限公司。

電子天平：（1）XP26 型，感量為0.001 mg；（2）ME204E型，感量為0.1 mg，瑞士梅特勒托利多儀器（上海）公司。

超純水系統(tǒng)：Milli-Q Direct 型，德國默克密理博公司。

高速中藥粉碎機：111B 型，浙江瑞安市永歷制藥機械有限公司。

數(shù)控超聲波清洗器：KQ-500DE型，昆山市超聲儀器有限公司。

HWS28型恒溫水浴鍋：HWS28型，上海一恒科技有限公司。

花旗松素對照品：批號為111816—201102，質量分數(shù)為98.9%，中國食品藥品檢定研究院。

香草酸對照品：批號為110776—201503，質量分數(shù)為99.8%，中國食品藥品檢定研究院。

槲皮素對照品：批號為100081—201510，質量分數(shù)為99.8%，中國食品藥品檢定研究院。

乙腈、甲醇：色譜純，德國默克公司。

甲酸：色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司。

其它試劑均為分析純。

實驗用水為超純水。

皂角刺藥材樣品：編號為S1～S12，經廣東一方制藥有限公司孫冬梅主任中藥師鑒定為正品，均為豆科植物皂莢的干燥棘刺，產地為河南、河北。

1.2 樣品制備

皂角刺主刺根、支刺根、刺尖示意圖見圖1。按照圖1將12批皂角刺藥材的主刺根、支刺根、刺尖分離，得主刺根（編號：A1～A12）、支刺根（編號：B1～B12）和刺尖（編號：C1～C12）。

圖1 皂角刺主刺根、支刺根、刺尖示意圖

1.3 溶液配制

1.3.1 對照品溶液

香草酸、花旗松素、槲皮素混合對照品溶液：分別取香草酸、花旗松素、槲皮素對照品適量，精密稱定，用70%（體積分數(shù)，下同）的甲醇溶解、稀釋、定容，制成各目標化合物的質量濃度分別為14.571、100.696、24.551 μg/mL的混合對照品溶液。

花旗松素對照品溶液：198.631 μg/mL，取花旗松素對照品適量，精密稱定，用70%甲醇溶解、稀釋、定容。

1.3.2 樣品溶液

取樣品粉末（過3號篩）約1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，稱取質量，加熱回流45 min，取出，放冷，再稱取質量，用70%乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.4 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry 柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm，美國沃特世公司）；流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B），流量為1.0 mL/min；梯度洗脫程序：0～5 min 5%～13% A，5～20 min 13%～16% A，20～45 min 16%～20% A，45～50 min 20%～25% A，50～65 min 25% A，65～80 min 25%～40% A；柱溫：25 ℃；檢測波長：260 nm；進樣體積：5 μL［3，8-9］。

1.5 實驗方法

采用色譜峰面積標準曲線法對皂角刺中花旗松素定量。采用方差分析、聚類分析、主成分分析法對皂角刺不同部位各特征峰進行化學模式識別分析。

2 結果與討論

2.1 樣品制備方法

分別對樣品的提取方式（超聲法、回流法）、提取溶劑（50%、70%、100%甲醇，50%、70%、100%乙醇）、提取時間（30、45、60 min）及溶劑體積（25、50、100 mL）進行考察，結果表明加入70%乙醇25 mL，回流45 min已提取充分，各特征峰的響應值和分離度均較好，因此采用1.3.2樣品溶液制備方法。

2.2 檢測波長

采用PDA檢測器對樣品溶液進行全波長掃描，比較波長在190～400 nm時的色譜圖數(shù)據(jù)，結果表明在260 nm時色譜峰信息較豐富，故波長用260 nm。

2.3 專屬性試驗

分別精密吸取混合對照品溶液、空白溶液及樣品溶液，在1.4色譜條件下測定，色譜圖見圖2。

圖2 專屬性試驗色譜圖

由圖2 可知，樣品溶液色譜在與對照品溶液色譜相應的保留時間處具有相同的色譜峰，且空白溶劑無干擾，表明該方法專屬性良好。

2.4 線性關系

精密吸取花旗松素對照品溶液，加入70%甲醇稀釋制成系列質量濃度的花旗松素對照品溶液，按1.3項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以對照品溶液質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，繪制標準工作曲線?；ㄆ焖伤氐馁|量濃度線性范圍、線性方程及相關系數(shù)見表1。由表1可知，花旗松素的質量濃度在9.932～198.631 μg/mL范圍內與色譜峰面積具有良好的關系。

表1 花旗松素的線性范圍、線性方程及相關系數(shù)

2.5 精密度試驗

精密稱定主刺根粉末（編號A12）6 份，按1.3.2方法制備樣品溶液，按1.4色譜條件進樣測定，試驗結果見表2。由表2可知，測定結果的相對標準偏差為0.95%，表明該方法精密度良好。

表2 精密度試驗結果 %

2.6 穩(wěn)定性試驗

取主刺根粉末（編號A12），按1.3.2方法制備樣品溶液，分別于制備0、4、8、12、24、48 h后按1.4色譜條件進樣測定。以首次測定花旗松素色譜峰為參照峰，各特征峰相對峰面積、相對標準偏差列于表3。由表3可知，各色譜峰相對峰面積基本不變，表明樣品溶液在48 h內穩(wěn)定性良好。

表3 穩(wěn)定性試驗色譜峰相對面積

2.7 加標回收試驗

取已知花旗松素含量的主刺根樣品粉末，精密稱取9 份，每份約0.5 g，置于具塞錐形瓶中，分為3組，每組分別精密加入相當于花旗松素含量50%、100%、150%的花旗松素對照品溶液，按1.3.2 方法制備樣品溶液，按1.4色譜條件進樣測定，計算加標回收率，試驗結果見表4。由表4 可知，花旗松素的平均加標回收率為88.10%，表明該法準確度較高。

表4 樣品加標回收試驗結果

2.8 特征圖譜的建立

取12 批主刺根、支刺根和刺尖樣品，按1.3.2 方法制備樣品溶液，按1.4色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。采用國家藥典委員會頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012 版”對色譜圖進行匹配，分別以樣品A1、B1 和C1 的色譜圖為參照圖譜，時間窗寬度為0.1 min，通過多點校正、全譜峰匹配分別生成對照特征圖譜R1、R2、R3，確定皂角刺主刺根、支刺根和刺尖均有8 個相同的共有峰。通過與對照品圖譜對比，確定3 號峰為香草酸，7 號峰為花旗松素，8號峰為槲皮素。

2.9 化學模式識別分析

2.9.1 方差分析

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計分析軟件，以12 批共36 個樣品各特征峰的單位峰面積（峰面積與取樣質量比值）為變量進行單因素方差分析，結果見表5。

表5 12批主刺根、支刺根和刺尖HPLC特征圖譜共有峰的方差分析結果

由表5可知，與主刺根比較，支刺根、刺尖的峰2均有顯著性差異（P＜0.05）；與刺尖比較，主刺根、支刺根的花旗松素、槲皮素均有顯著性差異（P＜0.05），表明峰2對應化合物、花旗松素、槲皮素是導致皂角刺不同部位質量差異的主要成分。由于槲皮素峰面積較小、含量低，故只測定了花旗松素含量。

2.9.2 熱圖和聚類分析

采用熱圖（HemI） 1.0 軟件，以12 批主刺根、支刺根和刺尖共36 個樣品各特征峰的單位峰面積為變量進行熱圖和聚類分析[10]。聚類分析結果顯示，36 個樣品可以分為3 類，A1、A2 聚為一類，A3～A6、A8、A10～A12、B2、B4、B5、B11 聚為一類，C1～C12、B1、B3、B6～B10、B12、A7、A9 聚為一類。除A1、A2、A7、A9外，主刺根與刺尖可以分為兩類，支刺根分散在主刺根和刺尖類別之中，無法較好地聚類，表明主刺根和刺尖的質量差異較明顯。

2.9.3 主成分分析

采用SPSS 26.0軟件，對12批主刺根、支刺根和刺尖共36個樣品各特征峰峰面積進行主成分分析，結果顯示KMO＞0.5，Bartlett 檢驗P＜0.01，表明各峰面積適合做主成分因子分析［11-12］。當特征值大于1 時，共提取3 個主成分因子，其特征值和方差貢獻率見表6。旋轉后主成分因子載荷矩陣見表7。

表6 主刺根、支刺根和刺尖主成分分析特征值及方差貢獻率

表7 主刺根、支刺根和刺尖旋轉后主成分因子載荷矩陣

由表6、表7 可知，前三個主成分累積貢獻率為83.192%，表明提取的3個主成分能反映皂角刺特征圖譜的大部分信息。主成分1的特征值為3.696，方差貢獻率為46.197%，載荷較高的峰有峰2、花旗松素、槲皮素，表明這3個峰主要反映主成分1的信息；主成分2的特征值為1.872，方差貢獻率為23.403%，載荷較高的峰有峰1、峰4、峰5、峰6，表明這4 個峰主要反映主成分2 的信息；主成分3 的特征值為1.087，方差貢獻率為13.592%，載荷較高的峰有香草酸，表明香草酸主要反映主成分3的信息。

2.9.4 綜合評分

根據(jù)表6 和表7 的數(shù)據(jù)，由公式Fi=a1X1+a2X2+…….+aj Xm（a為特征值，由成分矩陣中的第j列載荷除以對應成分特征值的算術平方根所得［13-14］；Xi為各單位峰面積的標準化值），計算得到主成分得分F1、F2、F3，主成分得分圖見圖3。

圖3 皂角刺主刺根、支刺根和刺尖HPLC特征圖譜主成分得分圖

36 個樣品可以分為2 類，再根據(jù)綜合評分函數(shù)F=F1×0.461 97+F2×0.234 03+F3×0.135 92（其 中F1、F2、F3為3個主成分的得分，系數(shù)為各成分的方差貢獻率），計算得到皂角刺不同部位HPLC特征圖譜的綜合評分，結果見表8。從各部位綜合得分的排名情況可知，排名前10的樣品中，刺尖有6批，支刺根有4 批；排名倒數(shù)10 名的樣品中，主刺根有6 批，支刺根有3批，刺尖有1批?？傮w來說，同一批次皂角刺藥材的刺尖品質最優(yōu)，支刺根居中，主刺根最差。

表8 皂角刺主刺根、支刺根和刺尖綜合得分排名表

2.10 含量測定

分別取12批主刺根、支刺根、刺尖樣品，按1.3.2方法制備樣品溶液，按1.4色譜條件進樣測定，計算花旗松素的含量，結果見表9。由結果可知，12批皂角刺藥材不同部位的花旗松素含量均為刺尖＞支刺根＞主刺根，說明花旗松素主要富集于刺尖。結合熱圖分析結果中刺尖部位的花旗松素、槲皮素顏色較主刺根、支刺根偏暖，花旗松素和槲皮素均為黃酮類成分，推測黃酮類成分主要富集于刺尖，黃酮類成分為皂角刺主要活性成分，因此，為保證臨床療效，應保證藥材不同部位的完整性，另皂角刺在煎煮過程中應進行合理的前處理確保刺尖部位有效成分的溶出。

表9 主刺根、支刺根、刺尖的花旗松素含量測定結果 %

3 結語

本研究建立了皂角刺藥材不同部位的HPLC特征圖譜并同時測定了花旗松素的含量測定，該方法簡便、穩(wěn)定、可靠，結合化學模式識別分析，較全面、系統(tǒng)地評價了皂角刺藥材不同部位的質量差異，有利于皂角刺藥材的進一步開發(fā)使用。