王瑜婷，黃貴發(fā)，何榮榮，黃醒鵬，黎桃敏，孫建焱，陳江平

（1.廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗室，廣東佛山 528244；2.浙江一方制藥有限公司，浙江金華 321000）

皂角刺為豆科植物皂莢的干燥棘刺，味辛，性溫，歸肝、胃經(jīng)，始載于《本草衍義補(bǔ)遺》，具有消腫托毒，排膿，殺蟲的功效[1-2]。皂角刺資源豐富，主要分布在我國河南、山東、河北等地?，F(xiàn)代研究表明，皂角刺主要含有黃酮類、三萜類、酚酸類、香豆素類化合物，其中黃酮類化合物是其主要活性成分?；ㄆ焖伤厥窃斫谴讨泻枯^高的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)、改善心肌細(xì)胞纖維化等作用[3-6]。

2020 年版《中國藥典》一部中皂角刺的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅規(guī)定了藥材的性狀、顯微鑒別和薄層鑒別，沒有含量測定和特征圖譜檢驗項，難以有效地控制皂角刺藥材整體質(zhì)量。中藥特征圖譜能較全面系統(tǒng)地反映中藥整體化學(xué)成分的特征信息，是目前公認(rèn)的最適合中藥物質(zhì)群質(zhì)量控制的手段之一[7]，因此筆者采用高效液相色譜（HPLC）法建立皂角刺不同部位（主刺根、支刺根、刺尖）的特征圖譜，運(yùn)用方差分析、熱圖和聚類分析、主成分分析等化學(xué)模式識別方法對其HPLC 特征圖譜進(jìn)行統(tǒng)計分析，同時測定皂角刺不同部位的花旗松素含量，以期為皂角刺藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制研究奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Waters Arc 型，沃特世科技（上海）有限公司。

電子天平：（1）XP26 型，感量為0.001 mg；（2）ME204E型，感量為0.1 mg，瑞士梅特勒托利多儀器（上海）公司。

超純水系統(tǒng)：Milli-Q Direct 型，德國默克密理博公司。

高速中藥粉碎機(jī)：111B 型，浙江瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司。

數(shù)控超聲波清洗器：KQ-500DE型，昆山市超聲儀器有限公司。

HWS28型恒溫水浴鍋：HWS28型，上海一恒科技有限公司。

花旗松素對照品：批號為111816—201102，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.9%，中國食品藥品檢定研究院。

香草酸對照品：批號為110776—201503，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.8%，中國食品藥品檢定研究院。

槲皮素對照品：批號為100081—201510，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.8%，中國食品藥品檢定研究院。

乙腈、甲醇：色譜純，德國默克公司。

甲酸：色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

其它試劑均為分析純。

實(shí)驗用水為超純水。

皂角刺藥材樣品：編號為S1～S12，經(jīng)廣東一方制藥有限公司孫冬梅主任中藥師鑒定為正品，均為豆科植物皂莢的干燥棘刺，產(chǎn)地為河南、河北。

1.2 樣品制備

皂角刺主刺根、支刺根、刺尖示意圖見圖1。按照圖1將12批皂角刺藥材的主刺根、支刺根、刺尖分離，得主刺根（編號：A1～A12）、支刺根（編號：B1～B12）和刺尖（編號：C1～C12）。

圖1 皂角刺主刺根、支刺根、刺尖示意圖

1.3 溶液配制

1.3.1 對照品溶液

香草酸、花旗松素、槲皮素混合對照品溶液：分別取香草酸、花旗松素、槲皮素對照品適量，精密稱定，用70%（體積分?jǐn)?shù)，下同）的甲醇溶解、稀釋、定容，制成各目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度分別為14.571、100.696、24.551 μg/mL的混合對照品溶液。

花旗松素對照品溶液：198.631 μg/mL，取花旗松素對照品適量，精密稱定，用70%甲醇溶解、稀釋、定容。

1.3.2 樣品溶液

取樣品粉末（過3號篩）約1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，稱取質(zhì)量，加熱回流45 min，取出，放冷，再稱取質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.4 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry 柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm，美國沃特世公司）；流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B），流量為1.0 mL/min；梯度洗脫程序：0～5 min 5%～13% A，5～20 min 13%～16% A，20～45 min 16%～20% A，45～50 min 20%～25% A，50～65 min 25% A，65～80 min 25%～40% A；柱溫：25 ℃；檢測波長：260 nm；進(jìn)樣體積：5 μL［3，8-9］。

1.5 實(shí)驗方法

采用色譜峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線法對皂角刺中花旗松素定量。采用方差分析、聚類分析、主成分分析法對皂角刺不同部位各特征峰進(jìn)行化學(xué)模式識別分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品制備方法

分別對樣品的提取方式（超聲法、回流法）、提取溶劑（50%、70%、100%甲醇，50%、70%、100%乙醇）、提取時間（30、45、60 min）及溶劑體積（25、50、100 mL）進(jìn)行考察，結(jié)果表明加入70%乙醇25 mL，回流45 min已提取充分，各特征峰的響應(yīng)值和分離度均較好，因此采用1.3.2樣品溶液制備方法。

2.2 檢測波長

采用PDA檢測器對樣品溶液進(jìn)行全波長掃描，比較波長在190～400 nm時的色譜圖數(shù)據(jù)，結(jié)果表明在260 nm時色譜峰信息較豐富，故波長用260 nm。

2.3 專屬性試驗

分別精密吸取混合對照品溶液、空白溶液及樣品溶液，在1.4色譜條件下測定，色譜圖見圖2。

圖2 專屬性試驗色譜圖

由圖2 可知，樣品溶液色譜在與對照品溶液色譜相應(yīng)的保留時間處具有相同的色譜峰，且空白溶劑無干擾，表明該方法專屬性良好。

2.4 線性關(guān)系

精密吸取花旗松素對照品溶液，加入70%甲醇稀釋制成系列質(zhì)量濃度的花旗松素對照品溶液，按1.3項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以對照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線?；ㄆ焖伤氐馁|(zhì)量濃度線性范圍、線性方程及相關(guān)系數(shù)見表1。由表1可知，花旗松素的質(zhì)量濃度在9.932～198.631 μg/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積具有良好的關(guān)系。

表1 花旗松素的線性范圍、線性方程及相關(guān)系數(shù)

2.5 精密度試驗

精密稱定主刺根粉末（編號A12）6 份，按1.3.2方法制備樣品溶液，按1.4色譜條件進(jìn)樣測定，試驗結(jié)果見表2。由表2可知，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.95%，表明該方法精密度良好。

表2 精密度試驗結(jié)果 %

2.6 穩(wěn)定性試驗

取主刺根粉末（編號A12），按1.3.2方法制備樣品溶液，分別于制備0、4、8、12、24、48 h后按1.4色譜條件進(jìn)樣測定。以首次測定花旗松素色譜峰為參照峰，各特征峰相對峰面積、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差列于表3。由表3可知，各色譜峰相對峰面積基本不變，表明樣品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表3 穩(wěn)定性試驗色譜峰相對面積

2.7 加標(biāo)回收試驗

取已知花旗松素含量的主刺根樣品粉末，精密稱取9 份，每份約0.5 g，置于具塞錐形瓶中，分為3組，每組分別精密加入相當(dāng)于花旗松素含量50%、100%、150%的花旗松素對照品溶液，按1.3.2 方法制備樣品溶液，按1.4色譜條件進(jìn)樣測定，計算加標(biāo)回收率，試驗結(jié)果見表4。由表4 可知，花旗松素的平均加標(biāo)回收率為88.10%，表明該法準(zhǔn)確度較高。

表4 樣品加標(biāo)回收試驗結(jié)果

2.8 特征圖譜的建立

取12 批主刺根、支刺根和刺尖樣品，按1.3.2 方法制備樣品溶液，按1.4色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。采用國家藥典委員會頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012 版”對色譜圖進(jìn)行匹配，分別以樣品A1、B1 和C1 的色譜圖為參照圖譜，時間窗寬度為0.1 min，通過多點(diǎn)校正、全譜峰匹配分別生成對照特征圖譜R1、R2、R3，確定皂角刺主刺根、支刺根和刺尖均有8 個相同的共有峰。通過與對照品圖譜對比，確定3 號峰為香草酸，7 號峰為花旗松素，8號峰為槲皮素。

2.9 化學(xué)模式識別分析

2.9.1 方差分析

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計分析軟件，以12 批共36 個樣品各特征峰的單位峰面積（峰面積與取樣質(zhì)量比值）為變量進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果見表5。

表5 12批主刺根、支刺根和刺尖HPLC特征圖譜共有峰的方差分析結(jié)果

由表5可知，與主刺根比較，支刺根、刺尖的峰2均有顯著性差異（P＜0.05）；與刺尖比較，主刺根、支刺根的花旗松素、槲皮素均有顯著性差異（P＜0.05），表明峰2對應(yīng)化合物、花旗松素、槲皮素是導(dǎo)致皂角刺不同部位質(zhì)量差異的主要成分。由于槲皮素峰面積較小、含量低，故只測定了花旗松素含量。

2.9.2 熱圖和聚類分析

采用熱圖（HemI） 1.0 軟件，以12 批主刺根、支刺根和刺尖共36 個樣品各特征峰的單位峰面積為變量進(jìn)行熱圖和聚類分析[10]。聚類分析結(jié)果顯示，36 個樣品可以分為3 類，A1、A2 聚為一類，A3～A6、A8、A10～A12、B2、B4、B5、B11 聚為一類，C1～C12、B1、B3、B6～B10、B12、A7、A9 聚為一類。除A1、A2、A7、A9外，主刺根與刺尖可以分為兩類，支刺根分散在主刺根和刺尖類別之中，無法較好地聚類，表明主刺根和刺尖的質(zhì)量差異較明顯。

2.9.3 主成分分析

采用SPSS 26.0軟件，對12批主刺根、支刺根和刺尖共36個樣品各特征峰峰面積進(jìn)行主成分分析，結(jié)果顯示KMO＞0.5，Bartlett 檢驗P＜0.01，表明各峰面積適合做主成分因子分析［11-12］。當(dāng)特征值大于1 時，共提取3 個主成分因子，其特征值和方差貢獻(xiàn)率見表6。旋轉(zhuǎn)后主成分因子載荷矩陣見表7。

表6 主刺根、支刺根和刺尖主成分分析特征值及方差貢獻(xiàn)率

表7 主刺根、支刺根和刺尖旋轉(zhuǎn)后主成分因子載荷矩陣

由表6、表7 可知，前三個主成分累積貢獻(xiàn)率為83.192%，表明提取的3個主成分能反映皂角刺特征圖譜的大部分信息。主成分1的特征值為3.696，方差貢獻(xiàn)率為46.197%，載荷較高的峰有峰2、花旗松素、槲皮素，表明這3個峰主要反映主成分1的信息；主成分2的特征值為1.872，方差貢獻(xiàn)率為23.403%，載荷較高的峰有峰1、峰4、峰5、峰6，表明這4 個峰主要反映主成分2 的信息；主成分3 的特征值為1.087，方差貢獻(xiàn)率為13.592%，載荷較高的峰有香草酸，表明香草酸主要反映主成分3的信息。

2.9.4 綜合評分

根據(jù)表6 和表7 的數(shù)據(jù)，由公式Fi=a1X1+a2X2+…….+aj Xm（a為特征值，由成分矩陣中的第j列載荷除以對應(yīng)成分特征值的算術(shù)平方根所得［13-14］；Xi為各單位峰面積的標(biāo)準(zhǔn)化值），計算得到主成分得分F1、F2、F3，主成分得分圖見圖3。

圖3 皂角刺主刺根、支刺根和刺尖HPLC特征圖譜主成分得分圖

36 個樣品可以分為2 類，再根據(jù)綜合評分函數(shù)F=F1×0.461 97+F2×0.234 03+F3×0.135 92（其 中F1、F2、F3為3個主成分的得分，系數(shù)為各成分的方差貢獻(xiàn)率），計算得到皂角刺不同部位HPLC特征圖譜的綜合評分，結(jié)果見表8。從各部位綜合得分的排名情況可知，排名前10的樣品中，刺尖有6批，支刺根有4 批；排名倒數(shù)10 名的樣品中，主刺根有6 批，支刺根有3批，刺尖有1批?？傮w來說，同一批次皂角刺藥材的刺尖品質(zhì)最優(yōu)，支刺根居中，主刺根最差。

表8 皂角刺主刺根、支刺根和刺尖綜合得分排名表

2.10 含量測定

分別取12批主刺根、支刺根、刺尖樣品，按1.3.2方法制備樣品溶液，按1.4色譜條件進(jìn)樣測定，計算花旗松素的含量，結(jié)果見表9。由結(jié)果可知，12批皂角刺藥材不同部位的花旗松素含量均為刺尖＞支刺根＞主刺根，說明花旗松素主要富集于刺尖。結(jié)合熱圖分析結(jié)果中刺尖部位的花旗松素、槲皮素顏色較主刺根、支刺根偏暖，花旗松素和槲皮素均為黃酮類成分，推測黃酮類成分主要富集于刺尖，黃酮類成分為皂角刺主要活性成分，因此，為保證臨床療效，應(yīng)保證藥材不同部位的完整性，另皂角刺在煎煮過程中應(yīng)進(jìn)行合理的前處理確保刺尖部位有效成分的溶出。

表9 主刺根、支刺根、刺尖的花旗松素含量測定結(jié)果 %

3 結(jié)語

本研究建立了皂角刺藥材不同部位的HPLC特征圖譜并同時測定了花旗松素的含量測定，該方法簡便、穩(wěn)定、可靠，結(jié)合化學(xué)模式識別分析，較全面、系統(tǒng)地評價了皂角刺藥材不同部位的質(zhì)量差異，有利于皂角刺藥材的進(jìn)一步開發(fā)使用。