王瑜婷,黃貴發(fā),何榮榮,黃醒鵬,黎桃敏,孫建焱,陳江平
(1.廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗室,廣東佛山 528244;2.浙江一方制藥有限公司,浙江金華 321000)
皂角刺為豆科植物皂莢的干燥棘刺,味辛,性溫,歸肝、胃經(jīng),始載于《本草衍義補(bǔ)遺》,具有消腫托毒,排膿,殺蟲的功效[1-2]。皂角刺資源豐富,主要分布在我國河南、山東、河北等地?,F(xiàn)代研究表明,皂角刺主要含有黃酮類、三萜類、酚酸類、香豆素類化合物,其中黃酮類化合物是其主要活性成分?;ㄆ焖伤厥窃斫谴讨泻枯^高的黃酮類化合物,具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)、改善心肌細(xì)胞纖維化等作用[3-6]。
2020 年版《中國藥典》一部中皂角刺的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅規(guī)定了藥材的性狀、顯微鑒別和薄層鑒別,沒有含量測定和特征圖譜檢驗項,難以有效地控制皂角刺藥材整體質(zhì)量。中藥特征圖譜能較全面系統(tǒng)地反映中藥整體化學(xué)成分的特征信息,是目前公認(rèn)的最適合中藥物質(zhì)群質(zhì)量控制的手段之一[7],因此筆者采用高效液相色譜(HPLC)法建立皂角刺不同部位(主刺根、支刺根、刺尖)的特征圖譜,運(yùn)用方差分析、熱圖和聚類分析、主成分分析等化學(xué)模式識別方法對其HPLC 特征圖譜進(jìn)行統(tǒng)計分析,同時測定皂角刺不同部位的花旗松素含量,以期為皂角刺藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制研究奠定基礎(chǔ)。
高效液相色譜儀:Waters Arc 型,沃特世科技(上海)有限公司。
電子天平:(1)XP26 型,感量為0.001 mg;(2)ME204E型,感量為0.1 mg,瑞士梅特勒托利多儀器(上海)公司。
超純水系統(tǒng):Milli-Q Direct 型,德國默克密理博公司。
高速中藥粉碎機(jī):111B 型,浙江瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司。
數(shù)控超聲波清洗器:KQ-500DE型,昆山市超聲儀器有限公司。
HWS28型恒溫水浴鍋:HWS28型,上海一恒科技有限公司。
花旗松素對照品:批號為111816—201102,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.9%,中國食品藥品檢定研究院。
香草酸對照品:批號為110776—201503,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.8%,中國食品藥品檢定研究院。
槲皮素對照品:批號為100081—201510,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.8%,中國食品藥品檢定研究院。
乙腈、甲醇:色譜純,德國默克公司。
甲酸:色譜純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。
其它試劑均為分析純。
實(shí)驗用水為超純水。
皂角刺藥材樣品:編號為S1~S12,經(jīng)廣東一方制藥有限公司孫冬梅主任中藥師鑒定為正品,均為豆科植物皂莢的干燥棘刺,產(chǎn)地為河南、河北。
皂角刺主刺根、支刺根、刺尖示意圖見圖1。按照圖1將12批皂角刺藥材的主刺根、支刺根、刺尖分離,得主刺根(編號:A1~A12)、支刺根(編號:B1~B12)和刺尖(編號:C1~C12)。
圖1 皂角刺主刺根、支刺根、刺尖示意圖
1.3.1 對照品溶液
香草酸、花旗松素、槲皮素混合對照品溶液:分別取香草酸、花旗松素、槲皮素對照品適量,精密稱定,用70%(體積分?jǐn)?shù),下同)的甲醇溶解、稀釋、定容,制成各目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度分別為14.571、100.696、24.551 μg/mL的混合對照品溶液。
花旗松素對照品溶液:198.631 μg/mL,取花旗松素對照品適量,精密稱定,用70%甲醇溶解、稀釋、定容。
1.3.2 樣品溶液
取樣品粉末(過3號篩)約1.0 g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,精密加入70%乙醇25 mL,稱取質(zhì)量,加熱回流45 min,取出,放冷,再稱取質(zhì)量,用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。
色譜柱:Waters Symmetry 柱(250 mm × 4.6 mm,5 μm,美國沃特世公司);流動相:乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B),流量為1.0 mL/min;梯度洗脫程序:0~5 min 5%~13% A,5~20 min 13%~16% A,20~45 min 16%~20% A,45~50 min 20%~25% A,50~65 min 25% A,65~80 min 25%~40% A;柱溫:25 ℃;檢測波長:260 nm;進(jìn)樣體積:5 μL[3,8-9]。
采用色譜峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線法對皂角刺中花旗松素定量。采用方差分析、聚類分析、主成分分析法對皂角刺不同部位各特征峰進(jìn)行化學(xué)模式識別分析。
分別對樣品的提取方式(超聲法、回流法)、提取溶劑(50%、70%、100%甲醇,50%、70%、100%乙醇)、提取時間(30、45、60 min)及溶劑體積(25、50、100 mL)進(jìn)行考察,結(jié)果表明加入70%乙醇25 mL,回流45 min已提取充分,各特征峰的響應(yīng)值和分離度均較好,因此采用1.3.2樣品溶液制備方法。
采用PDA檢測器對樣品溶液進(jìn)行全波長掃描,比較波長在190~400 nm時的色譜圖數(shù)據(jù),結(jié)果表明在260 nm時色譜峰信息較豐富,故波長用260 nm。
分別精密吸取混合對照品溶液、空白溶液及樣品溶液,在1.4色譜條件下測定,色譜圖見圖2。
圖2 專屬性試驗色譜圖
由圖2 可知,樣品溶液色譜在與對照品溶液色譜相應(yīng)的保留時間處具有相同的色譜峰,且空白溶劑無干擾,表明該方法專屬性良好。
精密吸取花旗松素對照品溶液,加入70%甲醇稀釋制成系列質(zhì)量濃度的花旗松素對照品溶液,按1.3項下色譜條件進(jìn)樣測定,記錄色譜圖。以對照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸,繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線?;ㄆ焖伤氐馁|(zhì)量濃度線性范圍、線性方程及相關(guān)系數(shù)見表1。由表1可知,花旗松素的質(zhì)量濃度在9.932~198.631 μg/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積具有良好的關(guān)系。
表1 花旗松素的線性范圍、線性方程及相關(guān)系數(shù)
精密稱定主刺根粉末(編號A12)6 份,按1.3.2方法制備樣品溶液,按1.4色譜條件進(jìn)樣測定,試驗結(jié)果見表2。由表2可知,測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.95%,表明該方法精密度良好。
表2 精密度試驗結(jié)果 %
取主刺根粉末(編號A12),按1.3.2方法制備樣品溶液,分別于制備0、4、8、12、24、48 h后按1.4色譜條件進(jìn)樣測定。以首次測定花旗松素色譜峰為參照峰,各特征峰相對峰面積、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差列于表3。由表3可知,各色譜峰相對峰面積基本不變,表明樣品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
表3 穩(wěn)定性試驗色譜峰相對面積
取已知花旗松素含量的主刺根樣品粉末,精密稱取9 份,每份約0.5 g,置于具塞錐形瓶中,分為3組,每組分別精密加入相當(dāng)于花旗松素含量50%、100%、150%的花旗松素對照品溶液,按1.3.2 方法制備樣品溶液,按1.4色譜條件進(jìn)樣測定,計算加標(biāo)回收率,試驗結(jié)果見表4。由表4 可知,花旗松素的平均加標(biāo)回收率為88.10%,表明該法準(zhǔn)確度較高。
表4 樣品加標(biāo)回收試驗結(jié)果
取12 批主刺根、支刺根和刺尖樣品,按1.3.2 方法制備樣品溶液,按1.4色譜條件進(jìn)樣測定,記錄色譜圖。采用國家藥典委員會頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012 版”對色譜圖進(jìn)行匹配,分別以樣品A1、B1 和C1 的色譜圖為參照圖譜,時間窗寬度為0.1 min,通過多點(diǎn)校正、全譜峰匹配分別生成對照特征圖譜R1、R2、R3,確定皂角刺主刺根、支刺根和刺尖均有8 個相同的共有峰。通過與對照品圖譜對比,確定3 號峰為香草酸,7 號峰為花旗松素,8號峰為槲皮素。
2.9.1 方差分析
采用SPSS 26.0 統(tǒng)計分析軟件,以12 批共36 個樣品各特征峰的單位峰面積(峰面積與取樣質(zhì)量比值)為變量進(jìn)行單因素方差分析,結(jié)果見表5。
表5 12批主刺根、支刺根和刺尖HPLC特征圖譜共有峰的方差分析結(jié)果
由表5可知,與主刺根比較,支刺根、刺尖的峰2均有顯著性差異(P<0.05);與刺尖比較,主刺根、支刺根的花旗松素、槲皮素均有顯著性差異(P<0.05),表明峰2對應(yīng)化合物、花旗松素、槲皮素是導(dǎo)致皂角刺不同部位質(zhì)量差異的主要成分。由于槲皮素峰面積較小、含量低,故只測定了花旗松素含量。
2.9.2 熱圖和聚類分析
采用熱圖(HemI) 1.0 軟件,以12 批主刺根、支刺根和刺尖共36 個樣品各特征峰的單位峰面積為變量進(jìn)行熱圖和聚類分析[10]。聚類分析結(jié)果顯示,36 個樣品可以分為3 類,A1、A2 聚為一類,A3~A6、A8、A10~A12、B2、B4、B5、B11 聚為一類,C1~C12、B1、B3、B6~B10、B12、A7、A9 聚為一類。除A1、A2、A7、A9外,主刺根與刺尖可以分為兩類,支刺根分散在主刺根和刺尖類別之中,無法較好地聚類,表明主刺根和刺尖的質(zhì)量差異較明顯。
2.9.3 主成分分析
采用SPSS 26.0軟件,對12批主刺根、支刺根和刺尖共36個樣品各特征峰峰面積進(jìn)行主成分分析,結(jié)果顯示KMO>0.5,Bartlett 檢驗P<0.01,表明各峰面積適合做主成分因子分析[11-12]。當(dāng)特征值大于1 時,共提取3 個主成分因子,其特征值和方差貢獻(xiàn)率見表6。旋轉(zhuǎn)后主成分因子載荷矩陣見表7。
表6 主刺根、支刺根和刺尖主成分分析特征值及方差貢獻(xiàn)率
表7 主刺根、支刺根和刺尖旋轉(zhuǎn)后主成分因子載荷矩陣
由表6、表7 可知,前三個主成分累積貢獻(xiàn)率為83.192%,表明提取的3個主成分能反映皂角刺特征圖譜的大部分信息。主成分1的特征值為3.696,方差貢獻(xiàn)率為46.197%,載荷較高的峰有峰2、花旗松素、槲皮素,表明這3個峰主要反映主成分1的信息;主成分2的特征值為1.872,方差貢獻(xiàn)率為23.403%,載荷較高的峰有峰1、峰4、峰5、峰6,表明這4 個峰主要反映主成分2 的信息;主成分3 的特征值為1.087,方差貢獻(xiàn)率為13.592%,載荷較高的峰有香草酸,表明香草酸主要反映主成分3的信息。
2.9.4 綜合評分
根據(jù)表6 和表7 的數(shù)據(jù),由公式Fi=a1X1+a2X2+…….+aj Xm(a為特征值,由成分矩陣中的第j列載荷除以對應(yīng)成分特征值的算術(shù)平方根所得[13-14];Xi為各單位峰面積的標(biāo)準(zhǔn)化值),計算得到主成分得分F1、F2、F3,主成分得分圖見圖3。
圖3 皂角刺主刺根、支刺根和刺尖HPLC特征圖譜主成分得分圖
36 個樣品可以分為2 類,再根據(jù)綜合評分函數(shù)F=F1×0.461 97+F2×0.234 03+F3×0.135 92(其 中F1、F2、F3為3個主成分的得分,系數(shù)為各成分的方差貢獻(xiàn)率),計算得到皂角刺不同部位HPLC特征圖譜的綜合評分,結(jié)果見表8。從各部位綜合得分的排名情況可知,排名前10的樣品中,刺尖有6批,支刺根有4 批;排名倒數(shù)10 名的樣品中,主刺根有6 批,支刺根有3批,刺尖有1批??傮w來說,同一批次皂角刺藥材的刺尖品質(zhì)最優(yōu),支刺根居中,主刺根最差。
表8 皂角刺主刺根、支刺根和刺尖綜合得分排名表
分別取12批主刺根、支刺根、刺尖樣品,按1.3.2方法制備樣品溶液,按1.4色譜條件進(jìn)樣測定,計算花旗松素的含量,結(jié)果見表9。由結(jié)果可知,12批皂角刺藥材不同部位的花旗松素含量均為刺尖>支刺根>主刺根,說明花旗松素主要富集于刺尖。結(jié)合熱圖分析結(jié)果中刺尖部位的花旗松素、槲皮素顏色較主刺根、支刺根偏暖,花旗松素和槲皮素均為黃酮類成分,推測黃酮類成分主要富集于刺尖,黃酮類成分為皂角刺主要活性成分,因此,為保證臨床療效,應(yīng)保證藥材不同部位的完整性,另皂角刺在煎煮過程中應(yīng)進(jìn)行合理的前處理確保刺尖部位有效成分的溶出。
表9 主刺根、支刺根、刺尖的花旗松素含量測定結(jié)果 %
本研究建立了皂角刺藥材不同部位的HPLC特征圖譜并同時測定了花旗松素的含量測定,該方法簡便、穩(wěn)定、可靠,結(jié)合化學(xué)模式識別分析,較全面、系統(tǒng)地評價了皂角刺藥材不同部位的質(zhì)量差異,有利于皂角刺藥材的進(jìn)一步開發(fā)使用。