張小云，劉 本，連建春，姜玉章，唐朝貴，王 霞

（南京醫(yī)科大學附屬淮安一院檢驗科，江蘇 淮安 223300）

血流感染（blood stream infection，BSI）是臨床常見的嚴重感染性疾病，具有起病急、病死率高的特點[1]。研究發(fā)現(xiàn)[2-5]，早期適當?shù)目咕幬镏委熆梢愿纳蒲鞲腥净颊叩念A后，而每延遲1 h 治療，患者死亡率會增加9%，而血培養(yǎng)為診斷血流感染的“金標準”，其血液培養(yǎng)陽性的周轉時間（turn-around time，TAT），即抗微生物藥物敏感性試驗報告結果是72～96 h。因此，改進方法縮短微生物鑒定和藥敏試驗的報告時間是目前微生物學檢驗面臨的巨大挑戰(zhàn)之一。研究發(fā)現(xiàn)[6]，利用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技術可對血培養(yǎng)陽性標本進行快速直接鑒定且具有較高的準確性。歐洲抗菌藥物敏感性試驗委員會（EUCAST）已經提出了抗微生物快速藥敏試驗（rapid drug sensitivity test，RAST），該方法是從陽性血培養(yǎng)瓶中取出標本直接進行藥敏試驗[7，8]。本研究應用MALDI-TOF MS 對細菌進行快速菌種鑒定，同時參考EUCAST 中血培養(yǎng)RAST 方法對腸桿菌目細菌和銅綠假單胞菌的血培養(yǎng)陽性標本進行藥敏試驗，并將結果與常規(guī)細菌鑒定和MIC 藥敏結果進行對比，為建立血培養(yǎng)陽性標本快速鑒定及藥敏試驗方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集南京醫(yī)科大學附屬淮安一院檢驗科微生物室2021 年8 月-2022 年3 月血培養(yǎng)報警陽性標本共133 份（報警時間＜48 h），將同一人的同一天報警的重復標本及2 種以上菌混合感染的標本剔除。

1.2 儀器試劑 Bactec FX 全自動血培養(yǎng)儀和血培養(yǎng)瓶（美國BD 公司）、真空采血管（浙江龔東醫(yī)療器械有限公司）、基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜儀質譜儀（法國生物梅里埃有限公司）、瓊脂培養(yǎng)基（鄭州安圖生物工程股份有限公司）、藥敏紙片（賽默飛世爾科技＜中國＞有限公司）、細菌培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技＜中國＞有限公司）；全自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)VITEK2 Compact（法國梅里埃生物有限公司）、離心機（賽默飛世爾科技＜中國＞有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 血培養(yǎng)陽性標本快速鑒定及藥敏試驗①Vitek MS快速鑒定細菌：血培養(yǎng)瓶陽性報警后，取出血培養(yǎng)瓶內培養(yǎng)物進行革蘭染色，當鏡下顯示單一革蘭陰性桿菌時取1 ml 陽性血培養(yǎng)標本置于1.5 ml EP管，離心管中加入200 μl 5% SDS 溶液充分混勻，13 000 r/min 離心2 min，棄去上清液，加入1000 μl無菌蒸餾水，充分混勻管內懸液，13 000 r/min 離心2 min，棄去上清液，得到沉淀，取0.5 μl 沉淀點樣至金屬靶板，加1 μl 基質液，待靶板干燥后進行快速鑒定，質控菌株為大腸埃希菌ATCC8739 與產氣腸桿菌ATCC13048；②陽性血培養(yǎng)液RAST 快速藥敏鑒定：以質譜快速鑒定結果為革蘭陰性細菌的血培養(yǎng)陽性標本作為RAST 的研究對象。參考2018 年EUCAST 公布的陽性血培養(yǎng)液RAST 方法[9]，從血培養(yǎng)瓶中直接吸取100 μl 培養(yǎng)液至直徑90 mm 的M-H 平板上，均勻涂布平板后貼上抗菌藥物紙片。質譜快速鑒定為大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的藥敏紙片包括慶大霉素（CN，10 μg）、頭孢噻肟（CTX，5 μg）、哌拉西林/他唑巴坦（TZP，36 μg/6 μg）、頭孢他啶（CAZ，10 μg）、美羅培南（MEN，10 μg）、阿米卡星（AK，30 μg）、環(huán)丙沙星（CIP，5 μg），妥布霉素（TOB，10 μg）；銅綠假單胞菌的藥敏紙片包括慶大霉素（CN，10 μg）、亞胺培南（IPM，10 μg）、頭孢噻肟（CTX，5 μg）、哌拉西林/他唑巴坦（TZP，36 μg/6 μg）、美羅培南（MEN，10 μg）、阿米卡星（AK，30 μg）、環(huán)丙沙星（CIP，5 μg），妥布霉素（TOB，10 μg），35 ℃溫育4、6、8 h 后，分別量取抑菌圈直徑，根據(jù)指南中不同細菌在不同時間的快速藥敏折點判讀藥敏結果，質控菌株為大腸埃希ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853。

1.3.2 血培養(yǎng)陽性標本常規(guī)鑒定及藥敏試驗 當血培養(yǎng)儀提示陽性報警時，取出陽性瓶進行革蘭染色并轉種至相應的平板，分離出的單個菌落采用質譜儀進行鑒定。同時選擇相應的藥敏卡通過VITEK 2 Compact 進行抗菌藥物敏感性分析。質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853。

1.3.3 藥敏結果比較 比較RAST 藥敏結果與常規(guī)藥敏結果的一致性，判斷標準如下：①結果符合（categorial agreement，CA）：常規(guī)藥敏結果顯示為敏感（或耐藥），RAST 結果也為敏感（或耐藥）；②錯誤（error，Er）：包括以下3 種情況：非常重大錯誤（very major errors，VME）：假敏感，即常規(guī)藥敏結果判定為耐藥，RAST 結果為敏感；重大錯誤（major errors，ME）：假耐藥，即常規(guī)藥敏結果判定為敏感，RAST 結果為耐藥；微小錯誤（minor errors，mE）：常規(guī)藥敏結果判定為中介，RAST 結果為敏感或耐藥。無ATU 結果的判讀及比較。

2 結果

2.1 Vitek MS 快速鑒定與常規(guī)鑒定結果比較 共分離出革蘭陰性菌133 株。直接鑒定與培養(yǎng)后菌落Vitek MS 鑒定結果符合率為91.73%（122/133），其中鮑曼不動桿菌檢出率最高，為100.00%（12/12），陰溝腸桿菌最低，為66.67%（6/9），見表1。

表1 Vitek MS 快速鑒定與常規(guī)鑒定結果比較[n（%）]

2.2 RAST 藥敏結果判讀 共對94 株革蘭陰性細菌RAST 結果進行研究，所有藥物CA 比例在4、6、8 h間呈現(xiàn)逐漸升高現(xiàn)象。在8 h 時除了TZP 和MEM，其他藥物CA 均高于可接受值（CA＞90%）；94 例革蘭陰性桿菌中僅有1 例銅綠假單胞菌對TZP 的藥敏結果在6、8 h 時為VME，1 例大腸埃希菌對TZP、AK 在4、6、8 h 時為ME，2 例肺炎克雷伯菌的TZP、CAZ 在4、6、8 h 時為ME，1 例銅綠假單胞菌的TOB 和CN 在6、8 h 時為mE，見表2～表4。

表2 大腸埃希菌RAST 藥敏結果與常規(guī)藥敏結果一致性比較[n（%）]

表3 肺炎克雷伯菌RAST 藥敏結果與常規(guī)藥敏結果一致性比較[n（%）]

表4 銅綠假單胞菌RAST 藥敏結果與常規(guī)藥敏結果一致性比較[n（%）]

3 討論

血流感染是引起患者死亡的主要因素之一，早期且準確的病原學檢測和藥敏結果對患者的診治十分重要。MALDI-TOF-MS 是近些年發(fā)展起來的一種新型細菌鑒定技術，可以快速準確地進行細菌及真菌菌種鑒定，對培養(yǎng)后菌落的鑒定技術在臨床已應用成熟。且菌落鑒定技術成本也遠低于傳統(tǒng)生化鑒定，極大縮短了菌株的鑒定時間[10]?，F(xiàn)階段MALDITOF-MS 技術對于標本的直接鑒定仍然為實驗室檢測的難點之一。采用不同方法處理血培養(yǎng)陽性標本后質譜直接鑒定的研究一直在不斷的改進中，不同的前處理方法可直接影響細菌鑒定效果及結果的判定[11，12]。本研究中血培養(yǎng)陽性報警標本采用5% SDS（十二烷基硫酸鈉）法處理后進行直接進行質譜鑒定，鑒定符合率為91.73%，與王巖等[13]研究報道的結果接近，且鑒定結果報告在1 h 以內，可為臨床早期經驗性用藥及后續(xù)快速藥敏結果判讀提供快速可靠的病原學依據(jù)。

陽性血培養(yǎng)液快速藥敏試驗近年來已成為國內外研究的熱點[14]。Sakarikou C 等[15]將陽性血培養(yǎng)液預處理后制備成0.5 麥氏濁度單位的菌懸液，使用全自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)VITEK 2 Compact 進行藥敏試驗，但此法耗時相對較長，獲得最終藥敏結果需18～24 h。Weme ET[16]利用分子生物學方法快速檢測細菌的耐藥基因，但檢測成本較高，不適用于臨床實驗室常規(guī)開展。Faria-Ramos I 等[17]利用流式細胞術對細菌的代謝參數(shù)進行檢測，可在3 h內檢測細菌對抗菌藥物的敏感性，但此法方法需要特殊儀器，一般實驗室難以實現(xiàn)。2018 年4 月EUCAST 發(fā)布了陽性血培養(yǎng)液RAST 及折點，該方法是從陽性血培養(yǎng)瓶中取出標本直接進行藥敏試驗，操作簡單、成本低、耗時短，易于臨床實驗室常規(guī)開展，目前革蘭陰性桿菌中肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌以及銅綠假單胞菌可進行RAST，藥敏結果最早可在4 h 內解讀。

本研究結果顯示，肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌以及銅綠假單胞菌的RAST 中的所有藥物CA 比例在4、6、8 h 3 個點呈現(xiàn)逐漸升高現(xiàn)象。在8 h 除了TZP和MEM 兩種藥物，其他藥物CA 比例均高于可接受值（＞90%）。94 例革蘭陰性桿菌中僅有1 例銅綠假單胞菌對TZP 的藥敏結果在6、8 h 時判讀為VME，有1 例大腸埃希菌菌對TZP、AK 在4、6、8 h 時判讀為ME，1 例肺炎克雷伯菌對TZP、CAZ 在4、6、8 h時判讀為ME，1 例銅綠假單胞菌對TOB 和CN 在6、8 h 時判讀為mE。不同抗菌藥物在不同時間點判讀的藥敏CA 比例有所差別。陸燕飛等[18]研究報道，應用RAST 在6 h 判讀腸桿菌目細菌藥敏結果時，TZP 和MEM 分別表現(xiàn)出最低和最高的CA（91.10%vs98.90%）。本研究發(fā)現(xiàn)，6、8 h 的TZP 藥敏判讀結果CA 最低，與上述文獻報道一致。雖然本研究檢測到相比4 h，6 h 時大部分藥物的CA 升高，但在6 h時TZP、MEM 及TOB 的ATU 比例仍然較高，CA＜90%，所以建議藥敏結果報告必須在8 h 評估后提交。在本研究中，大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對TZP、銅綠假單胞菌對MEM 的CA＜90%，這兩種抗生素的CA 比例較低，與部分研究結果相似[19]。Soo YT 等[20]對148 例陽性血培養(yǎng)瓶RAST 和Vitek-2檢測結果進行了比較，結果顯示在8 h 時無VME，ME 檢出率在3.3%～18.2%。與其報道的高ME 率相反，在本研究僅4 株菌株出現(xiàn)ME，1 株菌株出現(xiàn)mE。Martins A 等[21]檢測36 株大腸桿菌和25 株肺炎克雷伯菌4 h 和6 h 對8 種抗菌藥物的RAST 結果，發(fā)現(xiàn)CIP 和CTX 的ME 大于3%，在6 h 對AK和TZP 的mE 各為34.4%和21.6%，該研究建議RAST 可以代替除AK 以外的其他抗生素的傳統(tǒng)藥敏方法。本研究中，在8 h 時除TZP 和MEM 外，其他CA 均在可接受范圍內，因此本研究建議對于革蘭陰性桿菌的RAST 應謹慎使用TZP 和MEM 檢測結果。這可能與本次選取的菌株數(shù)量不同及本地區(qū)的細菌耐藥性分布不同所致，后續(xù)需要更多的血培養(yǎng)陽性培養(yǎng)液RAST 的數(shù)據(jù)資料來驗證。

本研究不足：本研究中血培養(yǎng)陽性瓶培養(yǎng)液RAST 分析的數(shù)量不多，且未對革蘭陽性菌的RAST進行評價。這些問題都有待進一步收集更多臨床血培養(yǎng)陽性樣本進行RAST 研究來解決。且RAST 方法本身也存在局限性，該方法不能對革蘭氏染色后多種細菌混合感染標本及生長緩慢的細菌進行藥物敏感性檢測。在測量早期時間點的抑制區(qū)域，特別是4 h，由于在顯影邊緣細菌生長容易造成人為檢測錯誤?；赗AST 研究應該增加多中心研究，這將有助于獲得更多可靠的結果。

綜上所述，革蘭陰性桿菌血培養(yǎng)陽性標本采用5% SDS 沉淀法對樣本進行前處理后采用MALDITOF MS 直接鑒定細菌準確性較高。在重癥感染患者，尤其是敗血癥患者早期及時提供藥敏結果進行治療是非常重要的。許多新的技術方法旨在實現(xiàn)這一目標，但在資源有限的實驗室中不適用。使用RAST 方法是一個切實可行的方法，在日常工作流程中可以實現(xiàn)，使血培養(yǎng)陽性的TAT 大大減少。根據(jù)RAST 結果可以指導臨床用藥，及時升級或降級抗生素治療，這將有助改善重癥患者的預后。然而該方法是勞動密集型方法，要求每4、6、8 h 閱讀一次結果，因此，建議將8 h 作為單一的時間點閱讀并報告結果最為準確。隨著研究的不斷深入，標本前處理方法的不斷完善，MALDI-TOF-MS 細菌直接鑒定及RAST 的應用將會為臨床重癥感染患者的診治提供更好的實驗室依據(jù)和幫助。