李 丹，黃艷丹，盧 艷

（廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科，廣西 南寧 530021）

Gasdermin（GSDM）家族蛋白是一組結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白，由GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME（DFNA5）和PJVK（DFNB59）共6 個(gè)成員組成，參與細(xì)胞增殖死亡、炎癥及腫瘤等生理和病理性過程[1-3]。GSDMs 在肝癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌等表達(dá)異常，并與患者不良預(yù)后相關(guān)[4-7]。然而，有關(guān)GSDMs 與子宮內(nèi)膜癌（uterine corpus endometrial carcinoma，UCEC）之間的聯(lián)系尚不清楚。本研究通過生物信息學(xué)方法綜合分析GSDMs 家族在內(nèi)膜癌中的表達(dá)情況及預(yù)后價(jià)值，以期為GSDMs 的靶向治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 UCEC 中的GSDMs 家族表達(dá) 通過ULACAN 數(shù)據(jù)庫[8]（http://ualcan.path.uab.edu/）比較GSDMs 家族在內(nèi)膜癌組織和正常子宮內(nèi)膜中的表達(dá)水平及與腫瘤分期的關(guān)系。

1.2 GSDMs 家族在UCEC 中的預(yù)后生存分析 在Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫[9]中從總生存期（OS）、無進(jìn)展生存期（RFS）兩方面分析GSDMs 表達(dá)與內(nèi)膜癌患者預(yù)后的關(guān)系。

1.3 UCEC 中GSDMs 及其相關(guān)基因的PPI 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)和GO 功能、KEGG 通路富集 選擇cBioportal 網(wǎng)站[10，11]中的數(shù)據(jù)集UCEC（TCGA，F(xiàn)irehose Legacy）Complete samples 7 例，以∣Spearman’s correlation∣＞0.95，P＜0.001 為條件篩選與GSDMs共表達(dá)基因。STRING 數(shù)據(jù)庫[12]對(duì)GSDMs 家族基因其及共表達(dá)基因進(jìn)行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析，Cytoscape[13]開展可視化分析并篩選核心基因，在Metascape 數(shù)據(jù)庫[14]中進(jìn)行GO 功能和KEGG 通路富集分析。

1.4 UCEC 中GSDMs 家族與免疫浸潤的關(guān)系 根據(jù)TISIDB 網(wǎng)站[15]中TCGA 的UCEC 數(shù)據(jù)分析GSDMs家族基因與免疫抑制檢查點(diǎn)的關(guān)聯(lián)。另通過TIMER數(shù)據(jù)庫[16]評(píng)估GSDMs 表達(dá)和腫瘤免疫細(xì)胞浸潤水平的預(yù)后價(jià)值。

2 結(jié)果

2.1 GSDMs 家族在UCEC 中的表達(dá) ULACAN 數(shù)據(jù)庫分析顯示，相較于正常內(nèi)膜組織，子宮內(nèi)膜癌組織中GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD 表達(dá)升高，GSDME 和PJVK 基因表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1A；GSDMB 和DFNA5 的表達(dá)與腫瘤分期有關(guān)，見圖1B。

圖1 GSDMs 家族在UCEC 中的表達(dá)

2.2 GSDMs 表達(dá)與UCEC 患者生存預(yù)后的關(guān)系Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫探究GSDMs 表達(dá)與內(nèi)膜癌患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示GSDMD 低表達(dá)患者OS 和RFS 下降（P＜0.05），而其他基因表達(dá)量與患者OS、RFS 未見明顯相關(guān)性（P＞0.05），見圖2。

圖2 GADMs 在UCEC 中的預(yù)后價(jià)值

2.3 GSDMs 家族及共表達(dá)基因的功能富集分析 通過cBioportal 數(shù)據(jù)庫篩選了共表達(dá)基因，并進(jìn)行功能富集分析，結(jié)果顯示有169 個(gè)基因與GSDMs 表達(dá)呈正相關(guān)，324 個(gè)基因與GSDMs 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；通過String 數(shù)據(jù)庫和Cytoscape 進(jìn)行蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析，篩選出AKT1、HRAS 等核心基因，見圖3A。GO分析顯示，GSDMs 及其相關(guān)基因生物學(xué)過程主要富集于有絲分裂細(xì)胞周期、泛素依賴性蛋白質(zhì)代謝過程；細(xì)胞組成變化主要在內(nèi)體膜、中心體；分子功能變化顯著富集在核苷三磷酸酶活性；KEGG 信號(hào)通路富集分析顯示，GSDMs 及其相關(guān)基因主要在鞘脂類信號(hào)通路、AMPK 信號(hào)通路等，見圖3B。

圖3 GSDMs 家族及共表達(dá)基因的潛在機(jī)制

2.4 GSDMs 家族與UCEC 中免疫浸潤的相關(guān)性 在TIMER 中將GSDMs 家族和6 種TILs（B 細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和DC 細(xì)胞）進(jìn)行Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析后發(fā)現(xiàn)，CD4+T細(xì)胞（HR=0.000，P=0.005）、CD8+T 細(xì)胞（HR=0.001，P=0.001）、GSDMB（HR=1.216，P=0.028）、GSDMD（HR=0.674，P=0.016）和GSDME（HR=1.330，P=0.026）可能是UCEC 的獨(dú)立預(yù)后因素，見表1。

表1 UCEC 中GSDMs 家族與主要TILs 的Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型（TIMER）

表1（續(xù)）

2.5 GSDMs 家族與免疫抑制檢查點(diǎn)的關(guān)系 在TISIDB 數(shù)據(jù)庫中分析發(fā)現(xiàn)，GSDMA、GSDMB、GSDMD 與PD-1 呈正相關(guān)；PD-L1 與GSDMA、GSDMC呈正相關(guān)，與PJVK 呈負(fù)相關(guān)；GSDMA、GSDMB、GSDMD 與CTLA4 呈正相關(guān)，見圖4。

圖4 UCEC 中GSDMs 家族mRNA 表達(dá)與免疫抑制檢查點(diǎn)mRNA 表達(dá)的相關(guān)性

圖4 UCEC 中GSDMs 家族mRNA 表達(dá)與免疫抑制檢查點(diǎn)mRNA 表達(dá)的相關(guān)性（續(xù)）

3 討論

GSDMs 家族是介導(dǎo)細(xì)胞焦亡的一組重要蛋白，除PJVK 外，所有家族蛋白均含有形成膜孔的N-末端結(jié)構(gòu)域、具有調(diào)節(jié)性的C-末端結(jié)構(gòu)域、中央接頭區(qū)域3 個(gè)相似結(jié)構(gòu)[17，18]。在正常情況下，C-末端結(jié)構(gòu)域緊密結(jié)合并掩蓋N-末端并抑制其活性，使得全蛋白失活。當(dāng)受到外界刺激時(shí)，中央接頭結(jié)構(gòu)域被半胱天冬酶或顆粒酶裂解切割后，N-末端與C-末端結(jié)構(gòu)域分離，結(jié)合脂質(zhì)并通過寡聚化和插入膜形成細(xì)胞膜孔隙，導(dǎo)致了促炎細(xì)胞因子和細(xì)胞內(nèi)容物過度釋放，引起細(xì)胞破裂，甚至細(xì)胞焦亡，破壞機(jī)體穩(wěn)態(tài)發(fā)揮關(guān)鍵作用[19-21]。生物信息學(xué)分析是一種綜合計(jì)算機(jī)科學(xué)、信息學(xué)及統(tǒng)計(jì)學(xué)的復(fù)雜的生物學(xué)研究方法，有助于臨床全方面的識(shí)別疾病的轉(zhuǎn)錄水平、突變特征等多變的生物學(xué)意義[22，23]。本研究基于多個(gè)免費(fèi)開放的權(quán)威性數(shù)據(jù)庫的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)對(duì)GSDMs 家族在子宮內(nèi)膜癌中的生物學(xué)意義進(jìn)行綜合系統(tǒng)性的探究。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相較于正常內(nèi)膜組織，子宮內(nèi)膜癌組織中GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD 表達(dá)升高，GSDME 和PJVK 基因表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且GSDMB 和DFNA5 的表達(dá)與腫瘤分期有關(guān)。然而，僅GSDMD 低表達(dá)患者OS 和RFS 下降（P＜0.05），而其他基因表達(dá)量與患者OS、RFS 未見明顯相關(guān)性（P＞0.05），與Yang Y 等[24]研究結(jié)果類似。但關(guān)于GSDMs 對(duì)UCEC 的預(yù)后價(jià)值仍有待進(jìn)一步研究，這可能是因?yàn)槟[瘤發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，單基因并不能完全預(yù)測(cè)患者總體的生存意義，也可能是數(shù)據(jù)信息不足或存在偏倚，期待后續(xù)更換數(shù)據(jù)庫、收集臨床樣本或者尋找相關(guān)的機(jī)制與GSDMs 交互性的探索分析。此外，本研究中GO 和KEGG 通路富集分析顯示，GSDMs 家族參與調(diào)控細(xì)胞分裂周期、泛素依賴性蛋白質(zhì)代謝過程、內(nèi)體膜、鞘脂信號(hào)通路和AMPK 信號(hào)通路等，且通過對(duì)GSDMs 家族及相關(guān)基因進(jìn)行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)AKT1、HRAS、KRAS 等基因與GSDMs 的表達(dá)及調(diào)控機(jī)制有關(guān)。腫瘤相關(guān)免疫浸潤細(xì)胞是腫瘤免疫研究的熱點(diǎn)。子宮內(nèi)膜周期變化與慢性炎癥密切相關(guān)，免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子、趨化因子等微環(huán)境成分的變化參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程。在TIMER 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析發(fā)現(xiàn)，CD4+T 細(xì)胞（HR=0.000，P=0.005）、CD8+T 細(xì)胞（HR=0.001，P=0.001）、GSDMB（HR=1.216，P=0.028）、GSDMD（HR=0.674，P=0.016）和GSDME（HR=1.330，P=0.026）可能是UCEC 的獨(dú)立預(yù)后因素，有望成為腫瘤免疫治療的新型腫瘤標(biāo)志物。有研究表明[25]，在乳腺癌中過表達(dá)GSDME 增強(qiáng)了TAM 對(duì)腫瘤細(xì)胞的吞噬作用以及腫瘤浸潤性自然殺傷細(xì)胞和CD8+T 淋巴細(xì)胞的數(shù)量。Xi G 等[26]研究表明，GSDMD 在非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)并與CD8+T 淋巴細(xì)胞顯著正相關(guān)，CD8+T 淋巴細(xì)胞活化后，GSDMD 的mRNA 表達(dá)水平及裂解形式的蛋白表達(dá)水平上升。由此推測(cè)，GSDMs 通過調(diào)控免疫細(xì)胞浸潤在UCEC 的致病機(jī)制中發(fā)揮作用。

免疫檢查點(diǎn)指固定在免疫系統(tǒng)中的抑制通路，主要維持自身耐受性和調(diào)節(jié)外周組織生理免疫反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間和幅度，在腫瘤中機(jī)體將免疫檢查點(diǎn)作為腫瘤免疫抵抗的重要機(jī)制之一[27]。本研究通過分析UCEC 中GSDMs 表達(dá)與經(jīng)典免疫檢查點(diǎn)關(guān)鍵基因表達(dá)的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，除了PJVK 與PD-L1 表達(dá)存在負(fù)相關(guān)性外，其他基因與免疫檢查點(diǎn)呈中度甚至較強(qiáng)的正相關(guān)性，推測(cè)GSDMs 可能是未來免疫檢查點(diǎn)治療的潛在預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物。

綜上所述，GSDMs 家族與子宮內(nèi)膜癌的致病機(jī)制、預(yù)后價(jià)值、免疫浸潤相關(guān)，是子宮內(nèi)膜癌診斷標(biāo)志物以及免疫治療的潛在靶點(diǎn)。雖然本研究基于多個(gè)數(shù)據(jù)庫綜合分析了GSDMs 家族在UCEC 中的表達(dá)特征、預(yù)后價(jià)值及免疫浸潤等的關(guān)系，然而本研究還存在一定的局限性：首先，研究為在線數(shù)據(jù)庫分析，雖有可信度，但缺乏基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；其次，GSDMs的預(yù)后價(jià)值不佳，這可能與樣本量不足、數(shù)據(jù)偏倚或疾病機(jī)制復(fù)雜有關(guān)。相信在未來通過生物信息技術(shù)與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的深入研究能挖掘出GSDMs 家族在UCEC 的作用機(jī)制，讓GSDMs 家族能成為UCEC 的診斷、治療和預(yù)后判斷的有效靶點(diǎn)。