劉 蘭，張遠哲，陳 銘

（1.常德職業(yè)技術學院基礎醫(yī)學院，湖南 常德 415000；2.貴州中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，貴州 貴陽 550025）

黃連溫膽湯出自清代陸廷珍《六因條辨》卷上，源于宋代陳言的《三因極一病癥方論》中溫膽湯去大棗加黃連而成，主治“傷暑汗出，身不大熱，煩閉欲嘔，舌黃膩?！秉S連溫膽湯由8 味藥物組成，分別為黃連、竹茹、枳實、半夏、陳皮、茯苓、甘草及生姜，具有疏理氣機、通利三焦、清熱化濕等功效[1]，臨床常用于失眠、高血壓、糖尿病、胃炎等疾病的治療[2-4]。本研究利用網(wǎng)絡藥理學技術對黃連溫膽湯治療失眠的核心靶點和主要化合物進行分析，以期對黃連溫膽湯治療失眠的可能機制做出預測，為后續(xù)臨床研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 黃連溫膽湯的中藥化學成分信息收集 綜合中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫（TCMSP）和中藥綜合數(shù)據(jù)庫（TCMID）2 個數(shù)據(jù)庫分別收集“黃連、竹茹、枳實、半夏、陳皮、茯苓、甘草、生姜”8 味中藥的化合物成分。以藥物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（Drug-likeness，DL）≥0.18 進行閾值篩選，得到相關中藥有效成分信息。

1.2 黃連溫膽湯中藥靶點的獲取 在TCMSP 數(shù)據(jù)庫和STITCH 數(shù)據(jù)庫中獲取對應靶標蛋白名稱。登錄UNIPROT 數(shù)據(jù)庫，設定生物物種為“HUMAN”，數(shù)據(jù)類型為“REVIEWED”，獲取所有基因名稱及UNIPROTKB。

1.3 疾病靶點的獲取 分別在GeneCards 數(shù)據(jù)庫、TTD 數(shù)據(jù)庫以“insomnia”為關鍵詞進行檢索，獲取失眠相關基因。

1.4 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡構建及關鍵基因篩選 將藥物與疾病的共同靶點導入String 數(shù)據(jù)庫，物種選擇“Homo sapiens（人類）”，分析蛋白互作關系，并將結果以tsv 格式導出。將導出結果導入Cytoscape_v3.8.2軟件，構建PPI 網(wǎng)絡，利用“Network Analyzer”工具，篩選Degree 值、中心性（closeness centrality）、介數(shù)（betweenness centrality）、特征向量（eigenvector centrality）、局部平均聯(lián)通（LAC）分別大于各自中位數(shù)的靶點，從而獲得關鍵基因。

2 結果

2.1 黃連溫膽湯主要活性成分的篩選 通過TCMSP、TCMID 數(shù)據(jù)庫檢索，設置OB≥30%，DL≥0.18，而后匹配疾病基因后去重，共篩選到黃連溫膽湯活性成分：黃連11 個、茯苓4 個、半夏10 個、枳實19 個、甘草85個、生姜3 個、陳皮5 個，竹茹0 個。通過CytoNCA軟件對藥物靶點進行拓撲分析，得到有效成分的Degree 值，篩選出Degree 值大于中位值前8 位的有效成分，列出其對應的藥物、主要相關的藥物ID 與成分信息，見表1。

表1 黃連溫膽湯的主要活性成分表

2.2 黃連溫膽湯與失眠共有靶點的韋恩圖及主要成分-靶點網(wǎng)絡 在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中共檢索到疾病相關靶點2587 個，TTD 數(shù)據(jù)庫中共檢索到26 個，兩數(shù)據(jù)庫去重后得到疾病靶點共2595 個。通過檢索得到黃連溫膽湯主要成分對應的靶點252 個，疾病靶點2595 個，共有靶點117 個，見圖1、圖2。

圖1 疾病與藥物交集靶點韋恩圖

圖2 中藥-疾病靶點網(wǎng)絡圖

2.3 PPI 網(wǎng)絡與關鍵靶點分析 對117 個交集基因根據(jù)Degree 值、BC、CC、EC、LAC 篩選得到4 個核心靶點：IL6、IL1B、TNF、AKT1，見圖3。4 個核心靶點主要存在于黃連、枳實、甘草3 味中藥中，主要對應成分有quercetin、luteolin、kaempferol 等，見表2。

表2 黃連溫膽湯治療失眠的核心靶點對應藥物、成分表

圖3 黃連溫膽湯治療失眠的靶點核心網(wǎng)絡圖

圖3 黃連溫膽湯治療失眠的靶點核心網(wǎng)絡圖（續(xù)）

3 討論

失眠（insomnia）是一種常見的臨床疾病，是神經(jīng)系統(tǒng)疾病最常見的睡眠障礙之一，其特點是難以啟動或保持睡眠，并伴有清醒時的煩躁或疲勞等癥狀[5，6]。中醫(yī)辨證論治失眠的方劑眾多且療效俱佳，不良反應輕，如歸脾湯、酸棗仁湯、黃連溫膽湯等?，F(xiàn)代藥理研究表明[7-9]，黃連溫膽湯具有降脂、降糖、抗炎等作用，廣泛用于心血管系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)、胃腸系統(tǒng)等疾病的治療。

本研究分析后得到黃連溫膽湯治療失眠的4 個核心蛋白，分別為IL6、IL1B、TNF、AKT1。IL6 是一種多功能細胞因子，具有明確的促炎癥和抗炎特性，有研究表明[10，11]，睡眠障礙患者夜間血清IL6 濃度明顯增加。IL1B 為一類強力促炎細胞因子，在機體主要發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，研究顯示[12]，IL1B 水平下降與失眠認知行為治療后睡眠質(zhì)量的改善有關。TNF 是哺乳動物免疫反應的關鍵介導劑和調(diào)節(jié)劑，在白天過度嗜睡的相關疾病中，促炎細胞因子IL6 或TNF會升高[13，14]，這說明失眠的發(fā)生與炎癥密切相關，慢性失眠癥患者的炎癥介質(zhì)血清水平顯著升高。AKT1是AKT 激酶的3 種激酶之一，目前暫未查閱到相關研究直接證實AKT1 可影響睡眠，但有相關報道黃花菜可通過影響果蠅的mRNA 表達來改善睡眠，其核心靶點為AKT1、Cat 和Sod[15]。結合黃連溫膽湯的藥物組成，4 個核心基因皆存在于中藥黃連與甘草中，黃連的主要成分小檗堿有明顯的抗炎作用，且小檗堿的抗炎作用可能與抑制IL6 和TNF 等炎癥因子的活性有關[16]；而甘草中的類黃酮化合物也可以發(fā)揮抗菌、抗炎的作用[17]。由上可知，失眠的發(fā)生與治療與炎癥水平密切相關，臨床可通過抑制失眠患者的炎癥介質(zhì)血清水平從而改善失眠癥狀，減輕不良反應[18，19]。黃連溫膽湯中主要化合物成分為槲皮素、木犀草素、山奈酚，皆屬于類黃酮化合物，能與血清素系統(tǒng)相互作用，作為鎮(zhèn)定劑使用和治療失眠[20]。在黃花菜通過影響果蠅的mRNA 表達來改善睡眠的實驗中，結果顯示槲皮素、木犀草素、山奈酚和咖啡酸是黃花菜改善睡眠的主要活性成分[15]。其中，槲皮素為藥物黃連的核心成分，具有催眠活性，可通過血清素能系統(tǒng)增強戊巴比妥的催眠作用[21]。而木犀草素具有神經(jīng)保護作用，能降低戊巴比妥誘導的睡眠小鼠的睡眠潛伏期，增加睡眠時間，減少喚醒時間。

綜上所述，失眠與促炎因子的升高有關，而黃連溫膽湯治療失眠的可能機制為抑制失眠患者的炎癥介質(zhì)血清水平。此外，黃連溫膽湯的三大關鍵成分皆屬于類黃酮化合物，具有催眠活性，可誘導睡眠。盡管網(wǎng)絡藥理學技術的應用為挖掘中醫(yī)藥的內(nèi)涵，發(fā)現(xiàn)藥物靶標，推動中藥新藥研發(fā)提供有力手段，但由于中藥藥效學方面研究不足、數(shù)據(jù)庫來源單一、數(shù)據(jù)庫更新緩慢、已知疾病種類及靶點有限等問題，其結果仍需進一步的藥理學和生物學實驗的驗證。