朱君雅 姚 文 倪錫森 蔣 沁

糖尿病視網膜病變(DR)是糖尿病中最常見的微血管并發(fā)癥之一，也是成人失明的主要原因[1-2]。DR的發(fā)病癥狀表現(xiàn)為周細胞丟失、內皮細胞受損、基底膜增厚、血管通透性增加、血管閉塞、微動脈瘤以及視網膜水腫等[3]，其中糖尿病性黃斑水腫(DME)是DR患者視力損害的主要原因，目前尚未得到有效治療。DME的機制包括以玻璃體牽引綜合征為代表的物理機械原因，神經遞質的興奮毒性，血管內皮生長因子(VEGF)以及炎癥因子等因素。血-視網膜屏障(BRB)由內屏障(iBRB)和外屏障(oBRB)組成，其中iBRB是由毛細血管管壁的內皮細胞和壁內周細胞組成，其結構基于神經血管單元(NVU)能夠控制血液成分不能自由進入視網膜，一旦屏障破壞將導致視網膜水腫。越來越多的研究表明，DR是一種神經血管性疾病[4-5]，導致血管功能障礙的潛在機制包括BRB的改變，血管通透性增加以及毛細血管退行性改變[6]，在DME中，由于BRB分解等外部因素，如缺血、高血糖、炎癥、氧化應激、神經元死亡以及由此產生的炎癥細胞因子導致血漿成分在視網膜內積累而導致黃斑水腫。本文從NVU的角度就黃斑水腫的發(fā)病機制與BRB的關系進行綜述。

1 NVU

NVU的概念最初起源于血-腦屏障，指的是神經元、膠質細胞和中樞神經系統(tǒng)高度分化的血管系統(tǒng)之間的功能耦合和相互依賴關系[7-8]。在視網膜中，NVU主要是由血管系統(tǒng)(內皮細胞和周細胞)、大膠質細胞(星形膠質細胞和Müller細胞)、神經元(神經節(jié)細胞、無長突細胞和水平細胞)以及免疫細胞(小膠質細胞和巨噬細胞)組成[9]。星形膠質細胞和小膠質細胞等在淺層毛細血管叢形成表層NVUs,而無長突細胞和神經膠質細胞的神經突如小膠質細胞形成中間神經叢NVUs,小膠質細胞包裹水平細胞形成深層神經叢NVUs[10]，并且每條神經均能在某種程度上調控相鄰毛細血管的血管通透性。

視網膜細胞完成自身功能依賴于持續(xù)性供能，血液作為氧氣的載體能夠與紅細胞內的血紅蛋白以及其他可溶性分子(如葡萄糖)結合產生ATP，并在輸送過程中受到其他局部因素的調節(jié)[11]。流經視網膜的血液和神經元活動緊密耦合，而神經元又依賴于光刺激，已有研究證明，增加光刺激可以增加視網膜血流量[12-13]，這一現(xiàn)象是由神經血管耦合引起的。視網膜NVU的所有細胞均緊密相連，根據(jù)代謝需求調節(jié)血流量，并維持內部BRB完整性。

2 BRB血管通透性與視網膜水腫

視網膜作為高代謝組織依靠BRB供應營養(yǎng)[14]，BRB能夠調節(jié)離子平衡、維持水和血漿滲透壓并保證氨基酸和葡萄糖的輸送[15]。BRB由兩個不同的屏障組成，oBRB由相鄰的色素上皮細胞形成的緊密連接組成，控制毛細血管和視網膜內部運輸，能夠調節(jié)血液中的溶質和營養(yǎng)物質[16]，iBRB由位于基底膜上的內皮細胞以及周細胞組成，并被Müller細胞的突起包裹，Müller細胞能夠通過傳遞調控信號來影響視網膜內皮細胞和iBRB的活性[17]。iBRB毛細血管為神經元提供氧氣、葡萄糖和必需的營養(yǎng)物質，并且能夠限制血液里的其他分子和細胞進入視網膜組織[18]，iBRB破壞的中心機制是視網膜內皮細胞通透性改變，這是許多眼部疾病的一個重要標志，包括DR、年齡相關性黃斑變性和黃斑水腫。視網膜毛細血管沒有外膜或者中膜，只有一層內皮細胞，周細胞嵌在血管周邊的間隙內，血管內皮細胞和周細胞周圍及之間的基底膜形成血管腔。BRB的血管通透性受內皮細胞間連接以及內皮細胞與細胞外基質的結合進行調節(jié)。血管內皮細胞間的緊密連接是通過存在于細胞間隙的緊密連接蛋白包括閉合蛋白(occludin)、血管內皮鈣連蛋白(VE-cadherin)和Claudin來建立的。DME形成的最主要原因是血管通透性增加，其特征是血管滲漏、組織水腫和中央視網膜硬性滲出物的沉積，長期的高血糖會導致視網膜血管自我調節(jié)能力喪失，小動脈和小靜脈擴張[19-20]，增加毛細血管靜水壓，導致組織水腫，并導致毛細血管壁擴張形成微動脈瘤或者破裂出血[21]。由于較小的溶質更容易在血管壁上雙向擴散，特別是通過細胞旁途徑，所以間質中大蛋白濃度的增加是導致組織滲透壓增加以及隨后視網膜水腫形成的主要原因，BRB破裂引起的血漿溶質滲漏以及毛細血管靜水壓升高會導致間質滲透壓升高，從而導致視網膜水腫。

3 NVU與BRB血管通透性

BRB的改變是DME疾病的主要標志，其特征在于周細胞丟失，內皮細胞連接破壞以及基底膜增厚。有研究表明，膠質細胞以及神經元也會影響B(tài)RB的功能[22-23]，神經節(jié)、無長突和小膠質細胞在結構和功能上均為構成NVU的主要細胞[24]，為內皮細胞的正常功能提供支持和保護[25]，因此，神經元損傷會間接影響視網膜血管和膠質細胞，研究表明，組成NVU的所有細胞均以不同方式參與了BRB的分解[10]。視網膜血管主要由淺血管叢、中血管叢、深血管叢三層組成，這三層血管網相互連通供養(yǎng)視網膜內組織。視網膜中血管叢和深血管叢中的毛細血管是構成iBRB的主要毛細血管。神經節(jié)細胞作為視網膜的信號調節(jié)因子，是第一個被檢測到的由糖尿病誘導而發(fā)生凋亡的神經元[7,26]，并且，先前的研究表明，DR患者視網膜功能第一個可測量的變化是視網膜電圖測試中振蕩電位的降低[1]。一旦視網膜節(jié)細胞功能障礙，信號傳遞異常，神經膠質細胞等支持細胞出現(xiàn)功能失代償會導致NVU細胞之間異常信號增多[27]。由于視網膜內血管缺乏自主神經，神經功能障礙會導致微血管損傷，此后隨著時間推移，膠質細胞受損，吞噬和清除細胞碎片的能力下降，從而導致代謝產物和有毒化學物質的累積[28]，這些堆積的產物不僅對內皮細胞以及色素上皮細胞有害，還會造成缺血缺氧的環(huán)境，從而破壞VEGF以及抗VEGF之間的平衡，改變視網膜內穩(wěn)態(tài)，促進BRB的破壞。

3.1 周細胞周細胞作為視網膜血管壁的主要壁細胞，其突起包裹毛細血管，促進局部血管運動控制，通過收縮毛細血管來防止血栓清除后的缺血-再灌注，舒張血管增加血流量[29-30]。體內外研究表明，周細胞可增強屏障特性[31-32]，在超微結構上,視網膜上的周細胞與內皮細胞比例為11，比大腦(13)以及其他微血管床(110)相對較高，提示周細胞在維持BRB的生理穩(wěn)態(tài)上具有重要作用[33]。

周細胞丟失作為DR早期的典型組織學病變，能夠提高內皮細胞對VEGF信號轉導的反應性，并導致局灶性內皮細胞增殖從而形成微動脈瘤。研究表明，毛細血管周細胞的密度和相對表面覆蓋率與內皮屏障特性呈正相關[34]，周細胞和內皮細胞之間的相互作用對于血管生成以及血管系統(tǒng)的成熟和維持非常重要，這一作用主要是通過生長因子的自分泌和旁分泌調節(jié)并對基底膜的調節(jié)來實現(xiàn)[35]。在血管生成和發(fā)育過程的早期，內皮細胞與周細胞之間的黏附主要受內皮細胞釋放趨化因子的調節(jié)來誘導周細胞募集和分化；另一方面，周細胞分泌生長因子來調節(jié)內皮細胞的功能或者吸引膠質細胞[36]。Platania等[37]研究發(fā)現(xiàn)，高血糖能夠誘導P2X7R受體激活從而導致周細胞死亡和BRB損傷，使用P2X7R的拮抗劑后能夠有效阻斷高糖誘導的BRB分解，從而緩解DME損傷。長效雙特異性抗體faricimab可以通過減少周細胞丟失以及內皮細胞損傷用于特定的DME治療，并在較長治療間隔時間內顯示出明顯改善[38]。

3.2 內皮細胞迄今為止，血管內皮改變是DR唯一成功的治療靶點，激光光凝為許多患者提供了控制增殖和水腫的有效手段[39-40]，目前臨床常用于治療DME的藥物有阿柏西普、貝伐單抗和雷珠單抗，其均是通過阻斷VEGF發(fā)揮作用。視網膜內皮細胞作為DR病變的關鍵參與者，一方面向視網膜組織供應氧氣和營養(yǎng)物質，檢查視網膜是否存在潛在的病原體；另一方面通過去除循環(huán)分子毒素，微生物和促炎白細胞來保護BRB[41]。

內皮細胞通過緊密連接復合物和黏附連接形成緊密單層，在DR動物視網膜微血管中觀察到細胞-細胞間連接破壞，表現(xiàn)為occludin和VE-cadherin表達水平下降[42]。研究表明，Notch信號通路可以調控內皮細胞黏附連接的形成，阻斷內皮細胞Notch信號通路可導致健康小鼠血管基底膜形成受阻，血流灌注減少，BRB破壞[43]；Yan等[44]研究顯示，通過依賴于AMPK信號通路的保護作用可以改善內皮細胞損傷，增強occludin和Claudin-5的表達，從而穩(wěn)定iBRB的緊密連接；Qin等[45]研究顯示，激活Tie2/Akt/mTOR信號通路可提高內皮細胞間的緊密連接蛋白，改善iBRB損害。此外，在DR患者中可觀察到內皮細胞凋亡，最終在DR晚期形成無細胞毛細血管[46]，內皮細胞凋亡或結構損傷，伴隨著周細胞的凋亡，這可能是導致BRB功能障礙的直接原因。氧化應激，白細胞停滯，內皮祖細胞功能障礙和衰老是視網膜內皮細胞死亡的潛在機制。在高糖環(huán)境下，晚期糖基化終末產物累積進一步產生活性氧(ROS)，持續(xù)性產生的ROS導致內皮細胞進一步凋亡，并且在高血糖以及持續(xù)性暴露于氧化應激的環(huán)境下，內皮細胞具有更高的增殖速率，并且處于不可逆的細胞周期阻滯，更可能產生凋亡[47-48]，從而導致視網膜組織增厚、腫脹、變形，最終表現(xiàn)為黃斑區(qū)水腫。

3.3 膠質細胞視網膜中的神經膠質細胞和內皮細胞僅由基底層分開，主要為Müller細胞、星形膠質細胞和小膠質細胞[49]。神經膠質細胞的主要功能是從神經末梢攝取神經遞質，同時分泌神經活性物質，包括神經遞質，類花生酸，類固醇，神經肽和生長因子如VEGF。DME的病理性水腫是血漿溶質通過功能失調的BRB滲漏到視網膜間質中而發(fā)生的，膠質細胞在形成和維持BRB以及生理條件下吸收營養(yǎng)物質和處置代謝產物方面發(fā)揮關鍵作用。研究表明，適當?shù)纳窠浤z質功能是形成深毛細血管層的必要條件，內皮細胞需要膠質細胞內足介導的接觸來增加其屏障特性，從而促進緊密連接的形成[50]。神經膠質細胞向形成BRB所需的視網膜血管內皮細胞提供WNT信號轉導，能夠提供BRB形成所需的Norrin信號轉導。

Müller細胞是視網膜主要的膠質細胞，主要存在于內核層，形成廣泛的絨毛網絡為神經元提供精細支持和保護，并且與血管緊密接觸，為神經血管細胞間的交流提供額外途徑[51]。Müller細胞能夠釋放多種誘導視網膜血管緊密連接形成的細胞因子，在DR進程中因代謝異常被激活并過表達膠質纖維酸性蛋白(GFAP)，進一步影響血管屏障特性，內皮細胞通過與Müller細胞相互作用，視網膜發(fā)生水穩(wěn)態(tài)調節(jié)的變化。研究表明，在條件性基因敲除小鼠(Müller細胞中特異性敲除VEGF)中檢測到炎癥生物標志物的降低以及血管異常的減少[52]。此外，在DR過程中，Müller細胞中水通道蛋白(AQPs)和Kir4.1水平升高，導致細胞腫脹，產生血管活性物質如VEGF，δ樣蛋白4(DLL4)蛋白，血管生成素樣蛋白4以及富亮氨酸α2糖蛋白1，從而增加血管通透性，促進血管生成[3]，另外，研究表明，AQP4敲低的DR大鼠視網膜血管通透性增強，VEGF以及GFAP水平升高[53]。星形膠質細胞主要位于視網膜神經纖維層，同時包裹于血管周圍，形成神經膠質限制因子，調節(jié)多種內皮細胞功能，并與神經突觸接觸維持BRB的穩(wěn)態(tài)[54]。研究顯示，星形膠質細胞中p75基因的過表達通過激活核因子κB(NF-κB)和缺氧誘導因子1α(HIF-1α)信號上調基質金屬蛋白酶(MMP)-9和VEGF的表達[55]，MMP-9已被證實能夠降解緊密連接蛋白occludin和Claudin-5，并構成基底膜的Ⅳ型膠原，從而破壞BRB[56]。小膠質細胞是視網膜的常駐巨噬細胞，通常以吞噬作用清除突觸重塑和細胞凋亡后的代謝產物和組織碎片。最近的動物實驗和臨床研究表明，DME是一種炎癥性疾病，研究發(fā)現(xiàn)，在DR大鼠視網膜中，激活的小膠質細胞與受損的周細胞和內皮細胞相互作用部位存在明顯的白蛋白滲漏，小膠質細胞通過對PI3K/Akt/Stat3/NF-κB信號通路的激活釋放過量的促炎介質[57]，包括細胞因子，趨化因子，半胱天冬酶以及谷氨酸[58]，這些介質誘導視網膜神經元和內皮細胞的額外凋亡，同時活化的炎癥細胞表達細胞黏附因子并分泌具有降解細胞外基質蛋白供能的MMP，破壞基底膜和血管內皮細胞，損害BRB血管通透性。同時，Xie等[59]發(fā)現(xiàn)，活化的小膠質細胞穿透iBRB的基底膜并吞噬內皮細胞導致iBRB的破壞，而促紅細胞生成素能夠通過激活小膠質細胞中的Src/Akt/cofilin信號通路，保持iBRB完整性。

3.4 神經元細胞視網膜是唯一直接暴露于光的神經組織，研究表明，DR在早期血管病變之前就已發(fā)生神經退行性變，DR的神經元功能障礙由多重因素引起，包括谷氨酸代謝受損[60]，突觸和樹突缺失以及神經節(jié)細胞凋亡[61]等，患者進一步出現(xiàn)視覺功能改變，比如色覺喪失，對比敏感度下降，視網膜電圖異常。視網膜神經節(jié)和無長突細胞是第一個檢測到DR誘導的細胞凋亡的神經元，同時光感受器的凋亡率也隨之增加。光學相干斷層掃描(OCT)發(fā)現(xiàn)，DR患者神經節(jié)細胞層以及神經纖維層明顯變薄，并且對未出現(xiàn)DR的糖尿病患者檢測發(fā)現(xiàn)，更薄的神經纖維層與其視盤周圍血管形態(tài)和密度的早期變化相關[62]。此外，在DR早期，神經營養(yǎng)因子如色素上皮衍生因子(PEDF)、生長抑素(SST)下調，并伴隨VEGF和促紅細胞生成素表達上調，且神經保護因子表達下調占主導地位[63-64]。研究表明，無長突細胞受損，視網膜內層毛細血管也同時受損，表現(xiàn)為無長突細胞所在的內核層變薄以及內叢狀層變薄，毛細血管血流量減少[65]。在高糖環(huán)境的視網膜中，神經元細胞分泌促進BRB功能障礙的分子semaphorin-3A，通過與其同源受體Nrp1結合，引起內皮細胞連接松動，導致血管源性水腫[66]；Ji等[67]研究發(fā)現(xiàn)，神經元衍生的Scg3作為DR的選擇性神經血管調節(jié)因子，能夠調控視網膜血管生成以及血管滲漏，導致BRB分解，進一步促進DME的發(fā)生發(fā)展。由此提出兩種假設，首先，BRB改變導致視網膜水腫，細胞外液組成改變以致隨后的神經元細胞損失；其次，高血糖可直接導致神經元細胞凋亡，進而導致BRB分解，但具體是哪種機制仍尚未完全明確。

4 小結

本文著重強調了NVU如何影響B(tài)RB功能從而調控DME的進展。目前，大多數(shù)中心性DME患者采取抗VEGF治療，但黃斑水腫的治療效果仍不理想，且仍存在40%～50%的DME患者對抗VEGF治療沒有完全反應，其原因可能是抗VEGF僅是針對視網膜毛細血管的治療，但DME是由于內部BRB破裂導致的微循環(huán)衰竭，即視網膜毛細血管和神經膠質組成的NVU破壞。神經元以及膠質細胞功能障礙能夠引起并促進黃斑水腫，因此，從NVU綜合概念的角度，通過恢復受損神經膠質細胞以及鄰近血管網絡對DME治療的新方法值得進一步研究探索。