苗貴芝 馬彥 程和

(山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院皮膚性病科,太原 030000)

1729年意大利植物學家Micheli[1]發(fā)現(xiàn)曲霉(Aspergillus)并命名,它屬于典型的絲狀真菌,由菌絲和孢子構(gòu)成,是人類條件致病真菌,常見的有煙曲霉、黃曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉等,其中煙曲霉的感染最常見[2]。曲霉的特點是極性生長,其孢子萌出胚芽,尖端繼續(xù)生長延伸形成菌絲,菌絲侵入組織并通過血流傳播到遠處,導致IA或變態(tài)反應性疾病[3],所以正確的菌絲形態(tài)建立與侵襲能力密切相關。真菌極性生長形成菌絲過程中涉及大量基因和多種信號轉(zhuǎn)導機制。Rho-GTPases(Rho-GTP酶)家族基因受鳥嘌呤核苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factor,GEF)和GTP酶活化蛋白(gtpase activating protein,GAP)調(diào)節(jié),在活性GTP結(jié)合構(gòu)象和非活性GDP結(jié)合構(gòu)象之間循環(huán)轉(zhuǎn)換,具有GTP酶活性[4]。Rho-GTPases基因在所有真核生物中高度保守,由rho、rac和cdc42基因組成[5],它作為“分子開關”調(diào)節(jié)真菌形態(tài)和毒力,涉及細胞極性的建立、囊泡運輸、形態(tài)發(fā)生、胞質(zhì)分裂、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等[6],是真核生物生長和分化的重要調(diào)節(jié)因子,也是探索真菌發(fā)病機制的研究熱點。本文探討了煙曲霉(Aspergillusfumigatus)和構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)兩種曲霉中Rho-GTPases基因的功能(見表1),這兩種真菌的基因組均編碼6個Rho GTP酶：Rho1-Rho4,Rac1(RacA)和Cdc42[7],重點闡述了rho1(rhoA)、rac1(racA)和cdc42(modA)基因在曲霉生長發(fā)育形態(tài)、應激反應和致病性中的作用。

1 rho與細胞壁完整性、菌絲形態(tài)、應激反應和致病性相關

1.1 細胞壁完整性

真菌細胞壁對維持細胞的完整性和毒力十分重要,是抗真菌藥物的選擇靶點之一,如棘白菌素類抗真菌藥物特異性抑制細胞壁的骨架成分β-1,3-葡聚糖合成。在正常情況下,rho1與fks1基因(煙曲霉 β-1,3-葡聚糖合酶的編碼基因)相互作用共同調(diào)節(jié)β-1,3-葡聚糖的合成[8-9],并與rho3一起定位于菌絲頂端,控制細胞壁完整性信號通路(cell wall integrity pathway,CWIP)和細胞骨架[10],以應對機械應力、溫度、滲透壓、pH值和營養(yǎng)缺乏等環(huán)境變化的影響。在37 ℃條件下,無法獲得煙曲霉rho1完全敲除株,rho1條件性缺失,即將外源性多西環(huán)素控制元件導入敲除了ku80基因的標準株CEA17,使其在多西環(huán)素濃度較低時rho1基因表達明顯下降,可影響CWIP,引起細胞裂解和死亡,證明rho1是真菌生存所必需基因[7,11]。研究報道煙曲霉Rom2(一種Rho1的GEF)與Rho1蛋白共定位于菌絲尖端,其含有一個功能未知的C端檸檬酸同源(CNH)結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域?qū)τ趓ho1調(diào)控β-1,3-葡聚糖的產(chǎn)生至關重要。CNH突變體β-1,3-葡聚糖降低,細胞壁中層的厚度減少,這可能是由于突變體無法在膜中共定位去激活足夠的Rho1,從而導致β-1,3-葡聚糖合成酶復合物(beta-1, 3-glucan synthase complex,GS)活性降低[12]。Zhang等[9]在實驗中發(fā)現(xiàn)Afrho1表達下調(diào),其細胞壁成分β-1,3-葡聚糖和葡萄糖胺減少,此外Anrho1突變體細胞壁成分半乳糖、甘露糖也減少[5]。Rho1通過蛋白激酶C1(PKC1)途徑激活下游的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)級聯(lián)反應,最后通過轉(zhuǎn)錄因子如Swi4/6和Rlm1等觸發(fā)基因的轉(zhuǎn)錄,調(diào)節(jié)細胞壁的生物合成[13]。Dichtl等[7]報道rho2和rho4對維持煙曲霉細胞壁完整性也至關重要,但關于這兩個基因在煙曲霉及構(gòu)巢曲霉當中的研究還較少。

表1 Rho-GTPases家族基因在煙曲霉及構(gòu)巢曲霉中的功能

1.2 菌絲形態(tài)

菌絲尖端的延長是大量囊泡不斷向尖端運輸細胞膜和細胞壁實現(xiàn)的,囊泡運輸?shù)鞍踪|(zhì)、脂質(zhì)等物質(zhì)需要細胞骨架元件肌動蛋白[14],活性Rho-GTP酶刺激多種效應分子,如p21激活激酶(PAK)、MAPK、雙胍和胞外復合物亞基,調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架的重排、靶向囊泡運輸和胞外作用[15]。韓改革等[16]在28 ℃條件下獲得Afrho1缺失株,發(fā)現(xiàn)菌絲末端形成孢子頭處仍持續(xù)生長,極性喪失,出現(xiàn)多分枝,菌絲頂端變薄,復合體消失,干重降低,推測與蛋白質(zhì)減少有關。野生型構(gòu)巢曲霉的一般形態(tài)特征是菌絲被隔膜分隔,并在基部到頂端的過程中出現(xiàn)側(cè)支。Guest等[5]觀察到Anrho1缺失菌株發(fā)芽緩慢,芽管生成異常,菌絲分枝延遲、不規(guī)則,表明rho1參與構(gòu)巢曲霉芽管及側(cè)支形成。Rho4是肌動蛋白環(huán)(actin ring,CAR)在分離過程中重新組裝的關鍵調(diào)節(jié)因子,構(gòu)巢曲霉Bud3是Rho4的一種GEF,Bud3-Rho4定位在隔膜,作用于分離起始網(wǎng)絡的下游,介導雙胍SepA募集到CAR組裝的位置調(diào)節(jié)菌絲隔膜的生成[17],這與Rho4在煙曲霉中參與菌絲隔膜形成的觀點一致[7]。綜上所述,Rho1、Rho4參與煙曲霉和構(gòu)巢曲霉細胞極性生長,調(diào)控芽管生成、菌絲分枝形成。法尼醇通過直接或間接作用于Rho1、Rho3擾亂煙曲霉的細胞壁結(jié)構(gòu)及其菌絲極性生長[10],說明Rho3和Rho1有相似功能,但Rho2在兩種曲霉中的功能目前了解比較少。

1.3 應激反應和毒力

煙曲霉孢子內(nèi)化侵入肺上皮細胞,在體內(nèi)生成菌絲,產(chǎn)生多種毒素和蛋白酶,引起炎癥因子、細胞因子釋放,激發(fā)免疫應答,是引起IA的關鍵步驟[29]。真菌毒力與細胞壁成分、代謝產(chǎn)物、過敏原、外界環(huán)境等相關,其中抵抗外界應激和免疫逃逸是影響毒力的主要因素[18]。理論上講,rho1缺失導致細胞壁骨架成分β-1,3-葡聚糖合成減少,細胞壁抵抗外界應激的反應減弱,侵襲力可能降低。實驗發(fā)現(xiàn)Afrho1缺失株孢子侵入細胞的量減少,對細胞壁干擾劑鈣熒光白和剛果紅的敏感性下降,生長受到抑制,對滲透壓和堿性環(huán)境的耐受無影響,對抗氧化應激壓力的能力明顯增強,證明rho1參與煙曲霉內(nèi)化侵染細胞的過程和應激反應[9,16]。Zhang等[9]檢測到Afrho1缺失菌株感染動物模型的死亡率明顯降低,參與氧化和pH應激的轉(zhuǎn)錄因子CatA、DprA、DprB和PacC表達均下降,此外,PacC還控制宿主感染期間煙曲霉進入上皮和組織侵襲的能力,表明rho1參與煙曲霉的發(fā)病機制。

2 rac1介導活性氧(ROS)產(chǎn)生,調(diào)控菌絲形態(tài)和毒力

2.1 菌絲形態(tài)

絲狀真菌同時具有Rac1和Cdc42同源物,它們在真菌的極性生長和萌發(fā)中具有保守的功能,其中Rac1在孢子萌發(fā)、菌落正常擴張、細胞極性、菌絲尖端生長和致病性中起重要作用[19]。細胞膜上NADPH氧化酶(NADPH oxidase,Nox)產(chǎn)生的活性氧(reactive oxygen species,ROS)可調(diào)節(jié)頂端生長和菌絲分枝起始的模式,是真核細胞中必不可少的信號分子。Rac1是真菌Nox的激活劑[20],囊泡內(nèi)ROS積累和瓶梗最終發(fā)育必需Rac1,在缺乏Rac1的情況下ROS的產(chǎn)生是異常的。Afrac1缺失株囊泡中ROS缺乏,瓶梗表現(xiàn)出分枝,沒有頂端優(yōu)勢,出現(xiàn)多個極性軸,菌絲和菌落形態(tài)嚴重畸形,分生孢子減少,發(fā)育異常,表明rac1是維持煙曲霉菌絲極性生長所必需[21-22]。在構(gòu)巢曲霉中,Semighini等[23]也通過實驗證明菌絲尖端產(chǎn)生的ROS在加強頂端優(yōu)勢中起著關鍵作用,Rac1和Cdc42都通過不同機制參與Nox的調(diào)控,Anrac1缺失株不能產(chǎn)生可檢測的ROS,表明Rac1可能在Nox的激活中發(fā)揮重要作用,介導ROS的產(chǎn)生,調(diào)控菌絲形態(tài)。

2.2 毒力

盡管Afrac1缺失株在體外生長存在缺陷,但在體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)它能夠在煙曲霉感染的昆蟲和動物模型中導致與野生型相當水平的死亡率,其侵襲能力甚至增強,Rac1功能的缺失并不影響煙曲霉毒力,這可能是由于Cdc42以及其他未知的氧化酶類補償了Rac介導的ROS生成[21]。在黃曲霉中,rac缺失時,分生孢子形成相關的關鍵基因abaA和brlA表達量顯著降低,產(chǎn)孢減少,菌核消失,繁殖缺陷,對細胞壁破壞劑和滲透壓應激反應敏感性增加,毒素合成降低,種子侵染能力下降[24]。rac1對不同曲霉毒力的影響有差異,真菌-宿主的相互作用復雜,rac1是否參與致病性及具體機制還需進一步研究,對構(gòu)巢曲霉毒力的影響目前鮮有相關文獻報道。

3 cdc42調(diào)控菌絲極性及毒力

3.1 菌絲形態(tài)

cdc42是極性建立的關鍵調(diào)節(jié)因子,是極性生長所必需,它作為一個分子開關,一旦被激活,可以潛在地與十多種不同的靶蛋白相互作用,以正反饋循環(huán)的方式調(diào)節(jié)肌動蛋白、微管細胞骨架的極化和定向囊泡運輸,將細胞壁和質(zhì)膜成分運送到出芽點,從而控制細胞極性、細胞形狀和細胞周期進程[25],協(xié)調(diào)細胞生長和分化的多種活動。煙曲霉和構(gòu)巢曲霉cdc42同源基因均稱為modA,類似于酵母菌中的細胞分裂控制蛋白42,促進細胞質(zhì)分裂過程中不同事件的發(fā)生[26],調(diào)節(jié)真菌的極性生長和細胞完整性。

在構(gòu)巢曲霉已證實它是孢子萌發(fā)至菌絲極性建立的關鍵調(diào)節(jié)因子。Si等[27]研究了構(gòu)巢曲霉Cdc24(Cdc42的一種GEF)和 Rga1(Cdc42的一種GAP)同源物的功能特征,發(fā)現(xiàn)Cdc24定位于菌絲尖端,是建立菌絲極性必需,Anrga1突變體中幾丁質(zhì)沉積在菌絲的基部,而野生型主要沉積于菌絲尖端, 表明Rga1與Cdc42相互作用使細胞壁在菌絲尖端沉積,調(diào)節(jié)無性發(fā)育。Virag等[28]觀察發(fā)現(xiàn)Ancdc42定位于菌絲尖端,與側(cè)支形成密切相關,Ancdc42突變株只有4%的菌絲產(chǎn)生分枝,cdc42和rac1具有使菌絲生長主軸建立的重疊功能,都能夠激活極性生長部位細胞骨架組織的下游效應通路,但cdc42在菌絲形態(tài)發(fā)生中起主要作用,rac1并不是必需的。

3.2 毒力

在煙曲霉中,Oda等[29]雙色雜交分析發(fā)現(xiàn)cdc42和cdc24兩個基因在休眠被打破后立即上升,然后在早期時間點下降,但是在各向同性到極性轉(zhuǎn)換期間相對穩(wěn)定表達。煙曲霉產(chǎn)生的膠霉毒素能夠誘導絲切蛋白(Cofilin)磷酸化,并調(diào)節(jié)肺上皮細胞中肌動蛋白細胞骨架的動態(tài)變化,免疫熒光結(jié)果顯示Cdc42抑制劑和 Rho1 抑制劑都明顯阻礙了膠質(zhì)毒素誘導的 Cofilin 及LIM 激酶1(LIMK1)的磷酸化,從而表明Cdc42和Rho1 都通過 LIMK1-Cofilin 信號通路參與膠質(zhì)毒素誘導的肌動蛋白細胞骨架重排,促進煙曲霉內(nèi)化到肺上皮細胞中維持其侵襲力[30],說明cdc42可影響煙曲霉致病力。

cdc42在菌絲極性生長、側(cè)支形成和發(fā)病機制等多種細胞活動中起重要作用,但協(xié)調(diào)多種功能的具體信號轉(zhuǎn)導通路以及在曲霉中的功能研究將成為未來的挑戰(zhàn)之一。

4 總結(jié)與展望

IA的發(fā)生率在過去的13年中增加了4倍[31], 然而全球高達20%的曲霉分離株對常用的抗真菌藥物表現(xiàn)出耐藥性[32],因此迫切需要研發(fā)安全高效的抗真菌藥物。 Rho-GTPases基因在煙曲霉和構(gòu)巢曲霉中具有很大的功能同源性,涉及細胞壁的生物合成、菌絲形態(tài)、隔膜形成等,目前在煙曲霉中的研究較多,而cdc42在構(gòu)巢曲霉中是菌絲極性建立的關鍵因子,這在煙曲霉中還未得到驗證。因此探討Rho-GTPases基因在這兩種曲霉的功能將互為補充和啟發(fā),有助于更全面認識該家族基因在曲霉屬中的作用,更有利于了解曲霉形態(tài)學與毒力之間的關系,為降低致病性、減少耐藥和研發(fā)新藥提供新見解。如棘白菌素耐藥性是真菌感染治療中一個日漸嚴重的問題,在兩種曲霉中均證實rho4是隔膜形成必不可少的基因,Spence等[33]在構(gòu)巢曲霉的研究發(fā)現(xiàn)隔膜在使米卡芬凈產(chǎn)生耐藥性方面發(fā)揮重要作用,這與Dichtl等[8]得出的結(jié)論一致,即在棘白菌素存在的情況下,隔膜是曲霉存活和生長的先決條件,因此抑制隔膜形成可能是減輕耐藥和提高棘白菌素治療效果的一種手段,那么掌握rho4參與隔膜形成的信號轉(zhuǎn)導機制,將使耐藥性下降成為可能。未來也可從Rho-GTPases基因上游調(diào)控因子GEF或GAP著手,探索下游效應物,更深入了解曲霉的生長發(fā)育和致病機制,開發(fā)阻斷rho、cdc42和rac基因相關通路靶點的新型抗真菌藥物,減少曲霉感染患者的死亡率。