鄧 璇，陳春兵，鄧 靜，劉練練，李 娟，查幸福

（西南大學 家蠶基因組生物學國家重點實驗室，重慶 400700）

桑Morus是一種重要的木本植物，具有28條染色體[1]，不僅可以作為家蠶的重要食物，還具有一定的經(jīng)濟、藥用及生態(tài)價值。但是桑葚在成熟的過程中易脫落，使得桑葚變軟變黑，影響其產(chǎn)業(yè)價值，因此，如何采用有效的手段對桑葚脫落進行調(diào)控十分重要。

果實脫落是植物正常發(fā)育過程中的一種常見現(xiàn)象，但是，在一定程度上會限制果樹的產(chǎn)量。果實脫落主要受環(huán)境因素、酶、生理代謝共同調(diào)控[2]，其中，環(huán)境因素主要包括生物脅迫(如病蟲害[3])和非生物脅迫(溫度脅迫[4]、水分脅迫[5]、光脅迫[6]等)；生理代謝則包括一些激素代謝(如脫落酸[7]、乙烯[8]等植物激素)和糖代謝[9]；由于纖維素和果膠是植物細胞壁的主要組成成分，因此纖維素酶、果膠酶、多聚半乳糖醛酸酶[10]等與果實脫落相關(guān)[11]。

目前，桑葚脫落的分子機制還未見報道。本研究以白桑Morus alba為供試材料，對其進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，探究桑葚在脫落過程中的生化成分代謝的分子機制，旨在為進一步了解桑葚果實脫落的分子機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2021年4月在西南大學家蠶基因組生物學國家重點實驗室桑樹資源種質(zhì)基地，選取無病害、健康狀況較好的白桑幼果果柄。以落果果柄 (YD) 為實驗組，取6個果柄為1份，設(shè)3個生物學重復，標記為YD1、YD2、YD3。正常果果柄 (YN) 為對照組，同樣取6個果柄為1份，設(shè)3個生物學重復，標記為YN1、YN2、YN3。取材后立即在液氮中速凍并儲存于?80 ℃冰箱保存。

1.2 冷凍切片的制作

將正常果和脫落果果柄組織清洗后用質(zhì)量分數(shù)為4%的多聚甲醛過夜固定，用包埋劑包埋材料。待包埋劑徹底凝固后進行冷凍切片。切片厚度為5 μm，將切片后的材料吸附于陽離子載玻片上，室溫干燥30 min后，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌樣品，去除包埋劑后置于顯微鏡下觀察。

1.3 RNA 提取

采用TRIzol法提取落果果柄和正常果果柄的總RNA，用分光光度計檢測RNA樣品的濃度和純度，以保證是否可以進行下一步測序分析。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測序與分析

樣品由華大基因進行測序及分析，利用華大智造測序平臺BGISEQ測序，所得的原始數(shù)據(jù)為raw reads。過濾掉低質(zhì)量、接頭污染以及未知堿基N含量過高的reads，過濾后的數(shù)據(jù)稱為clean reads。將clean reads比對到參考基因組上，再進行后續(xù)分析。

1.5 測序原始數(shù)據(jù)的公開

將測序所得原始數(shù)據(jù)提交到美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的SRA數(shù)據(jù)庫中，檢索號為:PRJNA811258。

1.6 差異表達基因的篩選和富集分析

使用DEseq2方法檢測樣品之間的差異表達基因(DEG)[12]。根據(jù)基因本體論數(shù)據(jù)庫(GO)和京都基因與基金組百科全書(KEGG)注釋結(jié)果以及官方分類，將差異基因進行功能分類，同時使用R軟件中的phyper函數(shù)進行富集分析。詳細說明見Wiki網(wǎng)站https://en.wikipedia.org/wiki/Hypergeometric_distribution。校正后的P≤0.05為顯著富集。

1.7 實時熒光定量 PCR (RT-qPCR)驗證

將桑葚幼果的落果果柄與正常果果柄RNA用 PrimesciptTMRT reagent kit with gDNA Eraser(Takara)反轉(zhuǎn)錄，在 primer premier 5.0 軟件設(shè)計定量引物 (表 1)，內(nèi)參基因為 Actin，利用 NovoStart?SYBR qPCR SuperMix Plus(novoprotein) 試劑盒進行熒光定量 PCR。反應程序為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，共 40 個循環(huán)。用 2?ΔΔCt算法處理數(shù)據(jù)，利用 GraphPad Prism 8.0.2 軟件作圖。

表1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù) RT-qPCR 驗證引物序列Table 1 Primer sequences used in RT-qPCR validation of transcriptome data

2 結(jié)果與分析

2.1 果柄離區(qū)切片觀察

桑果是帶果柄脫落，為了研究桑樹正常果柄和脫落果柄的差異，對其進行冷凍切片并觀察顯微結(jié)構(gòu)。從圖1可知：正常幼果果柄與枝干相連的區(qū)域內(nèi)細胞規(guī)則，形態(tài)一致，而脫落幼果果柄與枝干相連處細胞小且致密。

圖1 落果與正常果果柄縱切面顯微結(jié)構(gòu)圖Figure 1 Longitudinal section microscopic structures of abscised and normal surviving young fruit peduncles

2.2 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果質(zhì)量分析

基于BGISEQ對桑葚幼果的落果與正常果果柄離區(qū)進行轉(zhuǎn)錄組測序，6個樣品獲得262.92 Mb的原始序列。原始測序數(shù)據(jù)經(jīng)一系列質(zhì)量控制后，每個樣本獲得超過6.3 Gb的高質(zhì)量純凈測序數(shù)據(jù)量，每項堿基質(zhì)量大于20的堿基數(shù)量占總堿基數(shù)量的比例 (Q20) 均大于96%，每項堿基質(zhì)量大于30的堿基數(shù)量占總堿基數(shù)量的比例 (Q30) 均大于91%。將每個樣本的高質(zhì)量純凈序列與測序并組裝的桑樹基因組序列進行比對，比對率均高于59%(表2)，表明本研究轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，可用于后續(xù)的分析。

表2 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計Table 2 Statistics of sequencing data

2.3 落果與正常果果柄的差異表達基因

用每2個樣品之間的Pearson相關(guān)系數(shù)以反映樣本間基因表達的相關(guān)性(圖2)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Pearson相關(guān)系數(shù)為0.69～1.00，說明各樣本間重復性和相關(guān)性較好。

圖2 落果與正常果果柄的相關(guān)性熱圖Figure 2 Correlation heatmap of abscised and normal surviving young fruit peduncles

在桑葚幼果果柄組織中，共鑒定到25 293個基因(圖3A)。其中，共表達的基因有23 203個，占91.7%。正常果果柄特有基因為1 164個，占4.6%，落果果柄組特有基因為926個，占3.7%。由此可見，落果果柄基因較正常果果柄基因少。根據(jù)差異篩選標準，在2組中共篩選到10 481個差異表達基因(圖3B)，其中，5 239個差異表達基因上調(diào)表達，5 242個差異表達基因下調(diào)表達。

圖3 落果與正常果果柄的表達基因和差異表達基因Figure 3 Expressed genes and differentially expressed genes of abscised and normal surviving young fruit peduncles

2.4 差異表達基因的 GO 富集分析

本研究對差異表達基因進行GO功能富集分析，共發(fā)現(xiàn)37個顯著性GO條目。生物過程共富集到7 064個基因，顯著富集到19個條目，涉及生物調(diào)節(jié)、細胞過程、代謝過程、對刺激的反應等，其中富集到生物過程中最多的差異表達基因為細胞過程和代謝過程基因；細胞組分共富集到6 857個基因，顯著富集到6個條目，涉及細胞解剖實體、細胞內(nèi)、其他有機部分、含蛋白質(zhì)復合物、病毒粒子等，富集到細胞組分最多的差異表達基因為細胞解剖實體和細胞內(nèi)基因；分子功能共富集到9 842個基因，顯著富集到12個條目，涉及催化活性、轉(zhuǎn)運蛋白活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性、分子功能調(diào)節(jié)劑等，富集到分子功能最多的差異表達基因為催化活性和結(jié)合基因(圖 4)。

圖4 落果與正常果果柄的差異表達基因GO分類柱狀圖Figure 4 Histogram of GO classification of differentially expressed genes of abscised and normal surviving young fruit peduncles

GO富集分析結(jié)果顯示：大多數(shù)差異基因集中在催化活性、膜的組成成分、氧化還原酶活性、膜的內(nèi)在成分，分別為 4 623、2 774、777、1 781 個基因(圖5)。其中，具催化活性的基因最多，說明在桑葚的落果過程中可能有很多重要的酶參與，從而發(fā)生一系列的催化反應。

圖5 落果與正常果果柄的差異表達基因GO富集氣泡圖Figure 5 GO enrichment bubble chart of differentially expressed genes of abscised and normal surviving young fruit peduncles

2.5 差異表達基因的KEGG代謝通路富集分析

在本研究中，細胞過程富集的基因為380個，富集到1個條目，為運輸和分解代謝；環(huán)境信息處理共富集到653個基因，富集到2個條目，為膜運輸和信號轉(zhuǎn)導；遺傳信息處理共富集到1 558個基因，包含4個條目，為折疊分類和降解、復制和修復、轉(zhuǎn)錄、翻譯；代謝通路富集到5 315個基因，包含11個條目，為氨基酸代謝、其他次生代謝物的生物合成、碳水化合物代謝、能量代謝等；有機系統(tǒng)共富集到427個基因，含1個條目(圖6)。分析發(fā)現(xiàn)：代謝通路富集的基因最多，說明桑葚在脫落過程中代謝反應尤為明顯。

圖6 落果與正常果果柄的差異表達基因KEGG分類柱狀圖Figure 6 Histogram of KEGG classification of differentially expressed genes of abscised and normal surviving young fruit peduncles

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示：大多數(shù)差異表達基因集中在MAPK信號通路、黃酮類生物合成、檸檬酸循環(huán)、植物激素信號轉(zhuǎn)導、氨基酸的生物合成通路，分別含293、102、55、318、251個基因(圖7)。其中，植物激素信號轉(zhuǎn)導途徑的差異表達基因數(shù)量最多，說明在桑葚果實脫落過程中植物激素起到了十分重要的作用。

圖7 落果與正常果果柄的差異表達基因的KEGG富集氣泡圖Figure 7 KEGG enrichment bubble diagram of differentially expressed genes of abscised and normal surviving young fruit peduncles

在桑樹的代謝通路中，植物激素信號轉(zhuǎn)導途徑的差異表達基因數(shù)量最多，為318個基因，其中，落果果柄中有51.9% (156個)的差異表達基因的表達量高于正常果果柄(圖8A)；在黃酮類生物合成途徑中，有102個差異基因富集，其中有73.5% (75個)的差異基因在落果果柄中表達量高(圖8B)；在氨基酸生物合成通路中，共有251個差異表達基因富集，其中有59.8% (150個)的差異表達基因在落果果柄中表達量更高(圖8C)；在檸檬酸循環(huán)中，有55個差異表達基因富集，其中有74.5% (41個)的差異表達基因在落果果柄中表達量更高(圖8D)。不難發(fā)現(xiàn)，落果果柄有超過一半的差異表達基因表達量高于正常果果柄。說明植物激素、黃酮類等次生代謝物以及檸檬酸等物質(zhì)在桑葚脫落過程中發(fā)揮了重要的作用。

圖8 落果與正常果果柄的代謝途徑的差異表達基因熱圖Figure 8 Heat map of differentially expressed genes in metabolic pathways of abscised and normal surviving carpopodium

2.6 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的 RT-qPCR 驗證

由于植物激素對于落花落果以及?；ū９季哂惺种匾淖饔?，于是在植物激素信號轉(zhuǎn)導途徑中篩選4 個差異十分顯著的基因，分別為GH3.6 (XM_010096892.1)、bHLH78 (XM_010102492.2)、SAUR15 (XM_010113436.1)、PHO1 (XM_024169608.1)。將這4個基因的每千個堿基轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的碎片值(FPKM)繪制直方圖，GH3.6在落果組中的表達水平是正常果組的20多倍，bHLH78在落果組中的表達水平約為正常果組20倍，PHO1(磷轉(zhuǎn)運蛋白)在落果組中的表達水平是正常果組的30多倍，SAUR15在落果組中的表達水平是正常果組的100多倍(圖9A)。由此推測，這4個基因均參與了桑葚的果實脫落。為了驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準確性，對這4個基因進行RT-qPCR驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：4個差異表達基因的熒光定量相對表達量的變化趨勢與轉(zhuǎn)錄組表達趨勢一致，說明該轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠(圖9B)。

圖9 4 個差異表達基因的 RT-qPCR 驗證Figure 9 RT-qPCR validation of four differentially expressed genes

3 討論

近年來，為了提高果樹產(chǎn)量，越來越多果實脫落的相關(guān)研究被報道，如番茄Lycopersicon esculentum[13]、荔枝Litchi chinensis[14]、扁桃Amygdalus communis[15]等。桑樹作為一種具有重要經(jīng)濟價值的植物，其生理落果引起學者們的關(guān)注。2021年，有研究者對不同種類的長果桑Morus macroura的生理落果進行研究，發(fā)現(xiàn)高濃度的脫落酸(ABA)和乙烯(ETH)能夠促進落果，而高濃度的赤霉素(GA3)和生長素(IAA)抑制落果[16]。但是，關(guān)于桑樹果實脫落的分子機制還尚不清楚。

植物激素是植物生長發(fā)育過程中十分重要的物質(zhì)，參與植物的落花落果，與落花落果常見的相關(guān)植物激素有IAA、GA3、細胞分裂素、ETH、ABA[17]。

IAA主要是促進植物的生長發(fā)育，抑制果實的脫落，如果生長素在運輸途徑中受到阻礙則會導致植物果實的脫落[18?19]。GH3.6是吲哚乙酸酰胺合成酶的基因，能夠催化IAA氨基化，使生長素失活[20]，這與本研究的結(jié)論一致。Small auxin-up RNA(SAUR) 基因是一類生長素早期響應基因，SAUR15能夠調(diào)控植物的生長發(fā)育并參與環(huán)境脅迫響應[21]。在本研究中，SAUR15的表達水平在落果組高于正常果組100多倍，說明SAUR15基因可能參與桑葚果實脫落；ABA主要是促進果實脫落[7]，這是由于ABA能夠增加纖維素酶的活性進而促進果實脫落[22]。有學者通過研究無核荔枝ABA合成關(guān)鍵酶LcNCED與生理落果的關(guān)系，驗證了ABA對于落果的作用[14]；GA主要是通過作用于IAA影響果實脫落[23]；ETH主要促進果實的成熟、衰老、脫落，這在多種植物中被報道，如番茄[13]等；細胞分裂素能夠促進坐果，延遲果實的脫落[24]。

此外，在對落果的研究中還發(fā)現(xiàn)了大量的基因和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，如JOINTLESS[25]、LATERAL SUPPRESSOR(LS)[26]、MACROCALYX[27]主要調(diào)控離區(qū)的形成，MYB[28]、WRKY[29]、bHLH[30]、bZIP[31]等轉(zhuǎn)錄因子能參與植物的器官脫落。bHLH78屬于bHLH轉(zhuǎn)錄因子，參與植物生長和代謝[32]，調(diào)節(jié)花青素的生物合成[33]。本研究中，bHLH78的表達水平在落果組較高，說明其可能參與桑葚的脫落。此外，還有一些重要的酶及蛋白調(diào)控植物的器官脫落，如纖維素酶、果膠酶、多聚半乳糖醛酸酶、擴展蛋白等[34]。在本研究中，磷轉(zhuǎn)運蛋白(PHO1)在落果果柄組的表達水平是正常果柄組的30多倍。此前研究表明：ABA調(diào)控依賴于PHO1的表達[35]，說明PHO1基因可能參與桑葚的脫落。

4 結(jié)論

本研究GO富集分析結(jié)果顯示：有4 623個基因具有催化活性，說明在果實脫落過程中，有多種重要的酶發(fā)揮催化效應；KEGG通路富集分析結(jié)果顯示：大多數(shù)差異表達基因集中在黃酮類生物合成、檸檬酸循環(huán)、植物激素信號轉(zhuǎn)導、氨基酸的生物合成等通路中，說明在果實脫落過程中，植物激素、糖類、次生代謝物質(zhì)等發(fā)揮了重要的作用，從而調(diào)控果實的脫落。本研究篩選了4個顯著的差異表達基因，均在桑葚脫落過程中參與反應，可為今后進一步研究桑樹的果實脫落提供參考。