郄曉娟 李清開 劉穎 馮雪妍 霍修林 張秀寧 霍佳 李志華 于海磊 徐貫杰

河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院1麻醉科，2骨病科（石家莊 050051）；3 河北醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院（石家莊 050011）

圍術(shù)期神經(jīng)認(rèn)知紊亂（perioperative neurocognitive disorders，PND）是老年患者術(shù)后常見的中樞系統(tǒng)并發(fā)癥之一，嚴(yán)重影響患者的恢復(fù)和生存質(zhì)量［1］。七氟烷是目前常用的吸入性麻醉藥，文獻(xiàn)表明七氟烷可引起老齡大鼠持續(xù)的工作記憶障礙［2］。工作記憶作為一種高級(jí)的認(rèn)知功能，依賴于神經(jīng)元突觸間的復(fù)雜聯(lián)系，突觸連接是腦功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，其發(fā)生著持續(xù)、動(dòng)態(tài)的變化，表現(xiàn)為在發(fā)育、應(yīng)激、學(xué)習(xí)等過程中的可塑性［3-4］。突觸可塑性改變與七氟烷造成的認(rèn)知能力下降有關(guān)［5］，但七氟烷造成突觸可塑性改變及工作記憶下降的機(jī)制尚不清楚。

補(bǔ)體系統(tǒng)是體內(nèi)重要的免疫效應(yīng)系統(tǒng)，由活化級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的血漿蛋白、膜調(diào)節(jié)蛋白和受體蛋白組成。大量證據(jù)表明補(bǔ)體系統(tǒng)在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及功能調(diào)節(jié)方面有重要作用［6］。補(bǔ)體分子C3 是補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的核心蛋白。海馬補(bǔ)體C3 信號(hào)通路的上調(diào)與手術(shù)后小鼠的認(rèn)知功能受損相關(guān)［7］。研究發(fā)現(xiàn)C3 的激活與TGFβ1/smad 通路表達(dá)上調(diào)有關(guān)。TGFβ1/smad 通路表達(dá)上調(diào)，在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中參與了認(rèn)知功能的下降過程［8］。關(guān)于補(bǔ)體C3 介導(dǎo)TGFβ1/Smad 信號(hào)通路調(diào)控七氟烷引起小鼠認(rèn)知功能下降的作用尚未明確，因此本研究旨在評(píng)估補(bǔ)體C3 及TGFβ1/Smad 信號(hào)通路在七氟烷麻醉對(duì)老齡小鼠突觸可塑性及工作記憶力損傷中的作用，為明確其機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)雄性C57BL/6 小鼠90 只，16 ～18月齡，體質(zhì)量27 ～30 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司［許可證編號(hào)SCXK（京）：2021-0006］。室溫22 ～28 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，晝夜循環(huán)，自由進(jìn)食水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后開展實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)得到我院的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理號(hào)：KSD2022-042-1）。

1.1.2 主要試劑Trizol 購自美國英杰生命技術(shù)有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國伯樂公司，SYBR Green qPCR Master Mix 試劑盒購自寶生生物技術(shù)有限公司。RIPA 裂解液、BCA 試劑盒購自北京索萊寶公司，TGFβ1 抗體購自美國Abcam 公司，Smad3 抗體購自美國Abcam 公司，GAPDH 抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，二抗兔IgG 購自武漢愛博泰克生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組將90 只C57BL/6 小鼠隨機(jī)分為3 組，對(duì)照組（C 組）、七氟烷麻醉組（S 組）和七氟烷麻醉+補(bǔ)體分子C3 抑制劑組（S+antiC3 組），每組30 只。

S 組和S+antiC3 組參照參考文獻(xiàn)［9］和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果制備七氟烷麻醉致小鼠工作記憶障礙模型。小鼠置于麻醉箱中，出氣端連接5350 型麻醉氣體監(jiān)測(cè)儀監(jiān)測(cè)七氟烷、氧氣和二氧化碳濃度，進(jìn)氣端以純氧為載體連接七氟烷揮發(fā)罐（Drager 公司，德國）。箱底鋪墊少量鈉石灰防止二氧化碳蓄積。S組和S+antiC 3組吸入2%七氟烷（批號(hào)：21070531，上海恒瑞醫(yī)藥有限公司）2 h，C 組吸入純氧2 h。S+antiC 3 組參照文獻(xiàn)和課題組前期實(shí)驗(yàn)在吸入七氟烷前30 min 腹腔注射0.25 mg CR2-Crry（靶向補(bǔ)體C3 抑制劑）。吸入七氟烷結(jié)束后，待其完全蘇醒后放回籠中。

1.2.2 Y 迷宮行為學(xué)測(cè)試正式實(shí)驗(yàn)開始前4 d進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，將小鼠放入迷宮中央?yún)^(qū)任其自由活動(dòng)8 min，連續(xù)3 d，每只小鼠活動(dòng)結(jié)束后用75%消毒酒精噴灑迷宮以消除小鼠氣味。在麻醉前1 d、麻醉后3 d 和7 d 每組取10 只進(jìn)行Y 迷宮行為學(xué)測(cè)試。正式實(shí)驗(yàn)時(shí)，將小鼠頭部朝向起始臂末端擋板，將其放入起始臂自由探索8 min，同時(shí)記錄進(jìn)臂總次數(shù)；計(jì)算小鼠正確自發(fā)交替率，小鼠身體完全進(jìn)入宮臂記為有效進(jìn)臂次數(shù)，連續(xù)3 次進(jìn)入不同的臂則記為一次正確的自發(fā)交替，自發(fā)交替率=［正確進(jìn)臂次數(shù)/總進(jìn)臂次數(shù)-2）］×100% 。

1.2.3 長時(shí)程增強(qiáng)（long-term potentiation，LTP）將每組中隨機(jī)選取5 只小鼠，給予1%戊巴比妥鈉100 mg/kg 麻醉后固定在立體定向裝置中，局部注射2%利多卡因，安置刺激電極和記錄電極。刺激電極位于：bregma 后1.5 mm，中線右側(cè)旁開2 mm，記錄電極位于：bregma 后2.2 mm，中線右側(cè)旁開1.2 mm。給予0.033 Hz，0.1 ms 的電刺激，調(diào)試刺激強(qiáng)度直至得到最大幅度的群體峰電位（population spike，PS）幅度，波形穩(wěn)定后逐步下調(diào)刺激強(qiáng)度使PS 振幅降至最大PS 的50%左右，持續(xù)記錄30 min為基線。然后給予高頻刺激（high frequency stimulation，HFS）（200 Hz 的20 個(gè)脈沖刺激），每隔5 min記錄PS 振幅，共記錄60 min。用PS 增幅作為評(píng)測(cè)LTP 的指標(biāo)，PS 增幅=［（HFS 后PS 幅度-HFS 前PS幅度）/HFS 前PS 幅度］×100%。

1.2.4 RT-PCR每組隨機(jī)選取5 只小鼠處死取海馬組織。使用引物見表1。采用Trizol 法提取RNA，PCR 儀上42 ℃加熱2 min，冰浴1 min。加入反應(yīng)液置于37 ℃，15 min；85 ℃，5 s，取出反應(yīng)液作為熒光定量的模板。單個(gè)RT-PCR 反應(yīng)體系由5 μL SYBR Green Mix、1 μL 引物、1 μL cDNA 和3 μL DEPC水組成。擴(kuò)增條件如下：95 ℃變性10 min，95 ℃10 s，60 ℃20 s，72 ℃25 s，40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后獲取循環(huán)閾值（Ct 值），使用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

表1 RT-PCR 引物序列Tab.1 RT-PCR Primer sequences

1.2.5 Western blot行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)選取5 只小鼠處死取海馬組織。加入RIPA 裂解液提取組織蛋白，BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白濃度定量，上樣，SDS-PAGE 電泳轉(zhuǎn)到PVDF 膜后，脫脂牛奶封閉。加入TGFβ1（1∶1 000，批號(hào)GR3412442-14）、Smad3（1∶1 000，批號(hào)GR169548-7）、GAPDH 抗體（1∶10 000，批號(hào)10494-1-AP），4 ℃冰箱過夜，次日取出，TBST 洗滌后加入二抗兔IgG（1∶3 000，批號(hào)10312942），室溫下放置2 h，使用凝膠成像系統(tǒng)掃描，Image J 軟件分析掃描結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用IBM SPSS 27.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組內(nèi)比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，組間比較應(yīng)用單因素方差分析，兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠的工作記憶能力指標(biāo)的變化在麻醉前1 d、麻醉后3 d 和麻醉后7 d，3 組間進(jìn)臂總次數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與麻醉前1 d 比較，S 組麻醉后各時(shí)間點(diǎn)的自發(fā)交替率下降（P＜0.001）；與C 組比較，S 組麻醉后各時(shí)間點(diǎn)自發(fā)交替率下降（P＜0.001）；與S 組比較，S+antiC3 組麻醉后各時(shí)間點(diǎn)自發(fā)交替率增加（P＜0.001）。見表2。

表2 3 組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)Y 迷宮實(shí)驗(yàn)指標(biāo)比較Tab.2 Comparison of Y maze text indexes at different time points of mice in three groups±s

表2 3 組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)Y 迷宮實(shí)驗(yàn)指標(biāo)比較Tab.2 Comparison of Y maze text indexes at different time points of mice in three groups±s

組別C 組S 組S+antiC3 組F 值P 值進(jìn)臂總次數(shù)（次）自發(fā)交替率（%）麻醉前1 d 33.42 ± 2.71 31.35 ± 2.21 32.98 ± 2.22 3.119 0.055麻醉后3 d 32.42 ± 2.53 34.12 ± 2.66 33.26 ± 2.78 0.769 0.470麻醉后7 d 32.52 ± 2.76 33.62 ± 2.61 32.48 ± 2.59 0.891 0.418麻醉前1 d 0.73 ± 0.13 0.74 ± 0.16 0.72 ± 0.15 0.0923 0.912麻醉后3 d 0.72 ± 0.12 0.47 ± 0.06 0.68 ± 0.13 23.252＜0.001麻醉后7 d 0.73 ± 0.14 0.55 ± 0.13 0.71 ± 0.11 9.012＜0.001

2.2 3 組小鼠海馬PS 增幅百分比的變化在麻醉后7 d 行LTP 水平檢測(cè)（根據(jù)參考文獻(xiàn)［10］和前期實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選擇此時(shí)間點(diǎn)），發(fā)現(xiàn)給予HFS 后，5 ～60 min 記錄顯示，S 組和S+antiC3 組PS 增幅低于C 組，其中第60分鐘（HFS后30 min）時(shí)，C 組、S組和S+antiC3 組PS 增幅分別為（175.18 ± 8.62）%、（112.62±5.79）%和（162.60±6.73）%（F=109.567，P＜0.001），S組的PS增幅顯著低于C組（t=13.451，P＜0.001），S+antiC3 組的PS 增幅明顯高于S 組（t= 12.616，P＜0.001）。見圖1。

圖1 3 組小鼠海馬區(qū)LTP 水平的比較Fig.1 Comparison of LTP levels in hippocampal of mice in three groups

2.3 3 組小鼠海馬補(bǔ)體分子C1q 和C3 的mRNA的變化與麻醉前1 d 比較，S 組和S+antiC3 組的麻醉后各時(shí)間的C1q 和C3 的mRNA 明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；與C 組比較，S 組麻醉后各時(shí)間點(diǎn)C1q 和C3 的mRNA 升高（P＜0.05），與S 組比較，S+antiC3 組麻醉后各時(shí)間點(diǎn)C1q 和C3的mRNA 降低（P＜0.001）。見表3。

表3 3 組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)補(bǔ)體C1q 和C3 的mRNA 表達(dá)量比較Tab.3 Comparison of complement C1q and C3 mRNA expression at different time points of mice in three groups ±s

表3 3 組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)補(bǔ)體C1q 和C3 的mRNA 表達(dá)量比較Tab.3 Comparison of complement C1q and C3 mRNA expression at different time points of mice in three groups ±s

組別C 組S 組S+antiC3 組F 值P 值C1q C3麻醉前1 d 1.01 ± 0.12 1.13 ± 0.17 1.09 ± 0.16 0.813 0.469麻醉后3 d 1.21 ± 0.20 1.69 ± 0.31 1.29 ± 0.23 5.429＜0.05麻醉后7 d 1.12 ± 0.17 2.36 ± 0.43 1.34 ± 0.23 24.619＜0.001麻醉前1 d 1.24 ± 0.16 1.33 ± 0.17 1.36 ± 0.19 0.646 0.542麻醉后3 d 1.26 ± 0.19 2.05 ± 0.34 1.62 ± 0.23 11.680＜0.05麻醉后7 d 1.28 ± 0.18 4.45 ± 0.52 2.07 ± 0.29 105.566＜0.001

2.4 3 組小鼠海馬TGFβ1、Smad3 蛋白的變化在麻醉后7 d 行TGFβ1/Smad3 通路蛋白水平檢測(cè)（根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)［11］和參考文獻(xiàn)，選擇此時(shí)間點(diǎn)）。與C 組比較，S 組和S+antiC3 組的TGFβ1 和Smad3蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；與S 組比較，S+antiC3 組TGFβ1 和Smad3 蛋白表達(dá)明顯下降（P＜0.001）。見表4 和圖2。

圖2 3 組小鼠TGFβ1/Smad3 通路的變化Fig.2 Changes in TGFβ1/Smad3 pathway of mice in three groups

表4 3 組小鼠TGFβ1/Smad3 通路蛋白表達(dá)的比較Tab.4 Comparison of TGFβ1/Smad3 pathway protein expression of mice in three groups±s

表4 3 組小鼠TGFβ1/Smad3 通路蛋白表達(dá)的比較Tab.4 Comparison of TGFβ1/Smad3 pathway protein expression of mice in three groups±s

組別C 組S 組S+antiC3 組F 值P 值TGFβ1 0.61 ± 0.07 2.56 ± 0.23 1.13 ± 0.12 211.835＜0.001 Smad3 0.78 ± 0.09 2.45 ± 0.22 0.98 ± 0.11 181.844＜0.001

3 討論

本研究中采用2%的七氟烷麻醉2 h 制備小鼠認(rèn)知功能障礙模型，發(fā)現(xiàn)采用Y 迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)嚙齒類動(dòng)物工作記憶，自發(fā)交替率越低，說明工作記憶能力下降，進(jìn)臂總次數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，排除小鼠體力及視力對(duì)小鼠探索迷宮的影響，結(jié)果顯示，各組與C 組比較，S 組麻醉后各時(shí)間點(diǎn)自發(fā)交替率增加同時(shí)進(jìn)臂總次數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示老齡小鼠認(rèn)知功能障礙模型制備成功。在七氟烷麻醉影響小鼠認(rèn)知功能的文獻(xiàn)中［2］，對(duì)老齡小鼠使用2% ～3%七氟烷麻醉后1、3、7 d 出現(xiàn)持續(xù)的工作記憶下降，與上述研究結(jié)果一致。

吸入麻醉藥廣泛用于臨床麻醉，與PND 的發(fā)生有關(guān)［12］。海馬作為學(xué)習(xí)記憶的重要中樞，其突觸可塑性與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)［13］。LTP 是評(píng)估海馬區(qū)突觸可塑性的關(guān)鍵指標(biāo)，HFS 后PS 的增高幅度越大說明突觸可塑性越好［14］。LTP 在腦損害模型中呈遲發(fā)性抑制［10］，與其研究結(jié)果一致，在前期研究發(fā)現(xiàn)PS 增幅在七氟烷麻醉后1 d 抑制不明顯，故本研究選擇麻醉后7 d 的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行LTP 試驗(yàn)。本研究發(fā)現(xiàn)與C 組比較，S 組的PS 增幅顯著低于C 組，提示七氟醚引起海馬LTP 下降，海馬突觸可塑性減退。

大量的臨床研究結(jié)果表明，補(bǔ)體級(jí)聯(lián)通路的激活是中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥［15］、突觸功能障礙［16］、抑郁、認(rèn)知功能障礙［17］等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基礎(chǔ)。C1q 是補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的第一個(gè)分子，起到“識(shí)別”的作用［18］。C3 是下游的補(bǔ)體蛋白，是補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的核心蛋白［19］。在神經(jīng)炎癥的阿爾茨海默病患者中，我們發(fā)現(xiàn)腦組織、腦脊液和血漿中的C1q 表達(dá)增高［20］。在本研究中結(jié)果顯示，與C 組比較，S 組C1q 和C3 的mRNA 升高，提示七氟烷引起了海馬區(qū)補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活。補(bǔ)體C3是補(bǔ)體級(jí)聯(lián)通路的關(guān)鍵蛋白，抑制C3 可緩解冠狀病毒肺炎［21］、治療牙周炎［22］和陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿［23］等。在阿爾茨海默病中補(bǔ)體C3 的缺失可減少tau 病變，緩解神經(jīng)炎癥、突觸缺陷和神經(jīng)變性［24］。CR2-Crry 是改良的靶向補(bǔ)體C3 的抑制劑，在多種疾病中起治療作用［9］。研究表明，與S組比較，S+antiC3 組海馬C1q 和C3 的mRNA 降低、PS 增幅明顯增高和麻醉后各時(shí)間點(diǎn)自發(fā)交替率增加，提示七氟烷通過補(bǔ)體C3 通路致海馬突觸可塑性下降進(jìn)而導(dǎo)致工作記憶水平下降。在小鼠脛骨骨折手術(shù)后海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中C3水平表達(dá)明顯升高、突觸數(shù)量減少，引起認(rèn)知功能下降，給外源性C3 加重了術(shù)后認(rèn)知能力的下降，阻斷C3 可明顯改善海馬依賴的認(rèn)知功能［7］，與本研究結(jié)果一致。

TGFβ1/smad 通路是細(xì)胞內(nèi)多種病理過程中的共同信號(hào)通路，認(rèn)為其過度激活參與了神經(jīng)膠質(zhì)瘤［25］和腦積水［26］等腦部疾病的發(fā)生。研究［27］表明TGFβ1 可誘導(dǎo)糖尿病腦病，抑制C3 可減少TGFβ1/smad 通路激活，緩解糖尿病小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡、突觸丟失以及認(rèn)知功能下降的發(fā)生發(fā)展。由于補(bǔ)體C3 調(diào)控TGFβ1 通路，且PCR 實(shí)驗(yàn)中，與C組比較，S 組在七氟烷麻醉后1 d，C1q 和C3 mRNA升高（P＜0.05）；在7 d，C1q 和C3 的mRNA 明顯升高（P＜0.001），故選取七氟烷麻醉后7 d 時(shí)間點(diǎn)行Western blot 實(shí)驗(yàn)。本研究發(fā)現(xiàn)，與C 組比較，S 組的TGFβ1 和Smad3 蛋白表達(dá)明顯升高；與S 組比較，S+antiC3 組TGFβ1 和Smad3 蛋白表達(dá)明顯下降，提示七氟烷通過補(bǔ)體C3 介導(dǎo)的TGFβ1/samd 信號(hào)通路導(dǎo)致老年小鼠突觸可塑性和工作記憶水平的下降。

本研究尚存在不足之處在于：（1）僅做了補(bǔ)體C3 抑制的相關(guān)研究，未做補(bǔ)體C3 過表達(dá)的研究；（2）補(bǔ)體C3 介導(dǎo)TGFβ1/samd 信號(hào)通路的具體分子生物學(xué)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，七氟烷麻醉可導(dǎo)致老齡小鼠工作記憶水平下降，其機(jī)制可能與補(bǔ)體C3 介導(dǎo)TGFβ1/smad 信號(hào)通路導(dǎo)致突觸可塑性下降有關(guān)。

【Author contributions】QIE Xiaojuan performed the experiments and wrote the article; LI Qingkai,LIU Ying,FENG Xueyan and HUO Xiulin collected and analyzed data and critically reviewed the intellectual content of articles; HUO Jia,YU Hailei,ZHANG Xiuning and LI Zhihua designed and performed the experiments, collected and analyzed data; XU Guanjie designed the study and reviewed the article, obtained research funding. All authors read and approved the final manuscript as submitted.