崔家康 高青杰 馬俊福 孟慶良

1河南省中醫(yī)院風濕病科（鄭州 450002）；2河南中醫(yī)藥大學骨傷學院（鄭州 450046）

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以滑膜炎、關節(jié)骨與軟骨破壞為主要特征的慢性、全身性自身免疫性疾病。其以滑膜細胞增生、炎癥細胞浸潤、關節(jié)軟骨和骨破壞等為主要病理變化，最終導致關節(jié)結構破壞、畸形和功能喪［1-2］。在RA 發(fā)病過程中，激活的RA 滑膜成纖維細胞（RA-FLS）表現(xiàn)出與腫瘤細胞相似的增殖和侵襲性，是導致關節(jié)骨和軟骨破壞的重要因素［3-4］。因此，尋找抑制RA-FLS 增殖與侵襲的途徑和靶點具有重要的研究意義。環(huán)狀RNA（circRNA）是閉環(huán)非編碼RNA 分子，其可與miRNA 結合以降低miRNA 活性［5］。circRNA 差異表達導致RA-FLS 侵襲和炎癥因子的產生均發(fā)生改變，并可能在促進免疫、炎癥、滑膜病變和關節(jié)破壞等方面發(fā)揮作用，參與RA 疾病的進展［6］。研究［7］發(fā)現(xiàn)，circ_0005276在上皮性卵巢癌（EOC）中表達上調，其水平與EOC 患者淋巴轉移率和遠處轉移率呈正相關。circ_0005276 的高表達還參與調控前列腺癌細胞的增殖、上皮間質轉化和遷移［8］。在前期的大鼠實驗中，生物信息學分析顯示circ_000527 在正常組與模型組大鼠滑膜組織之間的表達有顯著差異，miR-557 與circ_0005276 存在結合位點，但circ_0005276 在RA-FLS 調控中的作用尚不明確。因此，本研究探討circ_0005276 靶向miR-557 對RA-FLS 增殖、遷移和侵襲的影響，旨在為未來RA臨床治療提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料實驗動物：SPF級雌性Wistar大鼠20只，7 周齡，體質量（200 ± 20）g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，動物合格證號：SCXK（魯）20190003。實驗期間喂養(yǎng)于河南省中醫(yī)院動物實驗中心，室溫（22 ± 2）℃，可自由進食和飲水。

實驗試劑：免疫源性牛Ⅱ型膠原（Chondrex）、完全弗氏佐劑（Chondrex）、TRIzol 試劑、Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（美國Invitrogen），Lipo2000、M-MLV 逆轉錄酶購自美國Invitrogen 公司；2×SYBR Green PCR Master mix、CCK-8 試劑盒購自北京索萊寶生物公司；si-circ_0005276、miR-557 模擬物、anti-miR-557、pcDNAcirc_0005276 及各自的對照購自南京金斯瑞生物公司；兔源Ki-67 多抗（WL01384a）、兔源N 鈣黏蛋白（N-cadherin）多抗（WL01047）購自沈陽萬類生物公司；羊抗兔IgG、兔源E-cadherin 多抗（ab15148）、兔源磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）多抗（ab9485）、兔源增殖細胞核抗原（PCNA）多抗（ab18197）購自上海艾博抗生物公司；Transwell 室購自美國Millipore 公司。

1.2 模型制備將大鼠隨機分為正常組、模型組，每組10 只。在超凈臺無菌環(huán)境中，將牛Ⅱ型膠原和完全弗氏佐劑按1∶1 比例在冰浴下混勻。在大鼠適應環(huán)境3 d 后造模，模型組尾根部皮下注射0.15 mL 膠原乳劑，正常對照組尾根部注射0.15 mL生理鹽水。在首次免疫7 d 后于對側尾根部皮下注射0.1 mL 膠原乳劑加強免疫［9］。在首次免疫10 d后選擇雙后肢關節(jié)腫脹大鼠為取材對象。

1.3 RA-FLS 分離和培養(yǎng)在加強免疫3 d 后取材，剝離大鼠踝關節(jié)組織，取出滑膜組織，在無菌條件下立即切成片，用0.25%胰蛋白酶在37 ℃下消化滑膜組織2 h，然后離心得到RA-FLS［10］。取第3 ～8 代RA-FLS 進行實驗。RA-FLS 采用含1%青-鏈霉素、10%胎牛血清的DMEM在溫度為37 ℃、CO2體積分數(shù)5%的培養(yǎng)箱孵育。

1.4 RT-qPCR檢測circ_0005276和miR-557表達通過TRIzol 法從滑膜組織中提取總RNA，用MMLV 逆轉錄酶將總RNA 反轉錄為cDNA，用SYBR Green PCR Master mix擴增cDNA以檢測circ_0005276和miR-557 表達。其相對表達水平通過2-ΔΔCt公式計算。circ_0005276 引物序列5′-GCTAAATGGTATCCAGGGTGC-3′（上游），5′-CCCTCCTCCACAGTGAAAGC-3′（下游）；GAPDH 引物序列5′-GCTTTCTTTCCTTTCGCGCT-3′（上游），5′-TTTGCGGTGGAAATGTCCTT-3′（下游）；miR-557 引物序列5′-GTTTGCACGGGTGGGC-3′（上游），5′-GAACATGTCTGCGTATCTC-3′（下游）；U6 引物序列5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′（上游），5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′（下游）。circ_0005276的序列中含有miR-557 的連續(xù)結合位點，見圖1。

圖1 circ_0005276 的序列中含有與miR-557 互補的核苷酸序列Fig.1 The sequence of circ_0005276 contains nucleotide sequences complementary to miR-557

1.5 實驗分組轉染前1 d，在24 孔板中以1 ×104個/孔接種RA-FLS。轉染當天，將Lipo2000 與opti-MEM 培養(yǎng)基混合，室溫孵育5 min，記為A 液；將質?；蚬押塑账崤copti-MEM 培養(yǎng)基混合，室溫孵育5 min，記為B 液。將A 液與B 液混合，室溫孵育5 min 后加入60%匯合度細胞中。收集轉染48 h RA-FLS 以備后續(xù)實驗。根據(jù)轉染質粒或寡核苷酸不同RA-FLS 共分為si-NC 組、si-circ_0005276組、miR-NC 組、miR-557 組、si-circ_0005276 +antimiR-NC 組、si-circ_0005276 +anti-miR-557 組、pcDNA 組、pcDNA-circ_0005276 組。

1.6 CCK-8 法檢測RA-FLS 活力在96 孔板中以3 × 103個/孔接種轉染細胞，孵育48 h 更換為90 μL的DMEM 培養(yǎng)液和10 μL CCK-8 繼續(xù)孵育2 h，用酶標儀檢測450 nm 處的吸光度（OD）來確定細胞活力。

1.7 Western blot 檢測Ki-67、PCNA、E-cadherin和N-cadherin 蛋白水平RIPA 法裂解RA-FLS，SDS-PAGE 分離細胞蛋白，隨后在濕法轉膜儀中完成轉膜。將膜在5%脫脂牛奶中封閉2 h，然后將膜依次與一抗、二抗在25 ℃反應2 h。滴加化學發(fā)光試劑使條帶顯色，Image J 軟件分析其相對灰度值。

1.8 劃痕愈合實驗檢測RA-FLS 遷移在6 孔板中以5 × 104個/孔接種轉染細胞，37 ℃孵育至90%匯合度時，用100 μL 槍頭垂直于6 孔板底劃傷單層細胞，PBS 清洗細胞碎片，加入無血清培養(yǎng)基37 ℃孵育24 h。顯微鏡下拍照，測定培養(yǎng)0 h和24 h劃痕寬度。劃痕愈合率（%）=（1-0 h 劃痕寬度/24 h劃痕寬度）×100%。

1.9 Transwell 實驗檢測RA-FLS 侵襲采用包被基質膠Transwell 室評估RA-FLS 侵襲能力。用無血清培養(yǎng)基重懸轉染細胞，取200 μL 接種于上腔室，將500 μL 完全培養(yǎng)基加入下腔室。孵育24 h后，穿膜細胞用4%多聚甲醛固定，并用結晶紫染色。顯微鏡下拍照，每個Transwell 室選擇5 個視野計數(shù)，取均值表示侵襲數(shù)。

1.10 雙熒光素酶報告實驗根據(jù)Circular RNA Interactome 預測結果將circ_0005276 野生（WT）片段克隆到pLG3 載體中，將該重組載體命名為WTcirc_0005276。將circ_0005276突變（MUT）片段克隆到pLG3 載體中構建重組載體MUT-circ_0005276。將WT-circ_0005276、MUT-circ_0005276分別與miR-557 模擬物或miR-NC 共轉染RA-FLS 中48 h，裂解細胞，測定相對熒光素酶活性以反映circ_0005276與miR-557 之間的關系。

1.11 統(tǒng)計學方法所有實驗重復3 次，每次3 個復孔，實驗數(shù)據(jù)以（）表示。采用SPSS 20.0 進行統(tǒng)計分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析和獨立樣本t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 circ_0005276 和miR-557 在CIA 大鼠滑膜組織中的表達CIA 大鼠滑膜組織中circ_0005276表達水平顯著高于正?；そM織（P＜0.05），miR-557 表達水平顯著低于正?；そM織（P＜0.05），見表1。

表1 circ_0005276 和miR-557 在CIA 大鼠滑膜組織中的表達Tab.1 Expression of circ_0005276 and miR-557 in synovium of CIA rats±s

表1 circ_0005276 和miR-557 在CIA 大鼠滑膜組織中的表達Tab.1 Expression of circ_0005276 and miR-557 in synovium of CIA rats±s

組別正常組滑膜組織CIA 大鼠滑膜組織t 值P 值circ_0005276 1.00 ± 0.09 4.57 ± 0.46 22.849＜0.001 miR-557 1.00 ± 0.12 0.33 ± 0.04 15.890＜0.001

2.2 干擾circ_0005276 表達對RA-FLS 增殖的影響與si-NC 組比較，si-circ_0005276 組RA-FLS 中circ_0005276 表達水平、細胞OD 值以及Ki-67 和PCNA 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），見圖2 和表2。

圖2 干擾circ_0005276 表達對RA-FLS 增殖相關蛋白表達的影響Fig.2 Effect of circ_0005276 interference on the expression of proliferation-related proteins in RA-FLS

表2 干擾circ_0005276 表達對RA-FLS 增殖的影響Tab.2 Effects of circ_0005276 expression interference on proliferation of RA-FLS ±s

表2 干擾circ_0005276 表達對RA-FLS 增殖的影響Tab.2 Effects of circ_0005276 expression interference on proliferation of RA-FLS ±s

組別si-NC 組si-circ_0005276 組t 值P 值circ_0005276 1.00± 0.00 0.23± 0.03 77.000＜0.001 OD 值（450 nm）0.88± 0.06 0.43± 0.04 18.721＜0.001 Ki-67 蛋白0.63± 0.05 0.25± 0.03 19.551＜0.001 PCNA 蛋白0.84± 0.06 0.32± 0.04 21.633＜0.001

2.3 干擾circ_0005276表達對RA-FLS遷移侵襲的影響與si-NC 組比較，si-circ_0005276 組RA-FLS劃痕愈合率、N-cadherin 蛋白水平、侵襲數(shù)顯著降低（P＜0.05），E-cadherin 蛋白水平顯著升高（P＜0.05），見圖3 和表3。

表3 干擾circ_0005276 表達對RA-FLS 遷移侵襲的影響Tab.3 Effects of circ_0005276 expression interference on RA-FLS migration and invasion ±s

表3 干擾circ_0005276 表達對RA-FLS 遷移侵襲的影響Tab.3 Effects of circ_0005276 expression interference on RA-FLS migration and invasion ±s

組別si-NC 組si-circ_0005276 組t 值P 值劃痕愈合率（%）67.67 ± 5.82 25.06 ± 2.76 19.845＜0.001侵襲細胞數(shù)（個）110.71 ± 11.65 46.77 ± 4.56 15.333＜0.001 E-cadherin 蛋白0.15 ± 0.02 0.57 ± 0.05 23.398＜0.001 N-cadherin 蛋白0.74 ± 0.06 0.28 ± 0.03 20.572＜0.001

圖3 干擾circ_0005276 表達對RA-FLS 遷移侵襲相關蛋白表達的影響Fig.3 Effect of circ_0005276 interference on the expression of RA-FLS migration and invasion related proteins

2.4 circ_0005276 靶向調控miR-557 的表達在與WT-circ_0005276 共轉染實驗中，轉染miR-557模擬物與轉染miR-NC 相比導致RA-FLS 的相對熒光素酶活性顯著下降（P＜0.05），見表4。si-circ_0005276 組細胞miR-557 表達水平顯著高于si-NC組（P＜0.05）；pcDNA-circ_0005276 組細胞miR-557表達水平顯著低于pcDNA 組（P＜0.05），見表5。

表4 雙熒光素酶報告實驗Tab.4 Double luciferase report experiment ±s

表4 雙熒光素酶報告實驗Tab.4 Double luciferase report experiment ±s

組別miR-NC 組miR-557 組t 值P 值WT-circ_0005276 0.97 ± 0.06 0.34 ± 0.03*28.174＜0.001 MUT-circ_0005276 0.98 ± 0.07 0.96 ± 0.06 0.651 0.524

表5 circ_0005276 調控miR-557 的表達Tab.5 circ_0005276 regulates the expression of Mir-557 ±s

表5 circ_0005276 調控miR-557 的表達Tab.5 circ_0005276 regulates the expression of Mir-557 ±s

注：與pcDNA 組比較，*P ＜0.05；與si-NC 組比較，#P ＜0.05

組別pcDNA 組pcDNA-circ_0005276 組si-NC 組si-circ_0005276 組F 值P 值miR-557 1.00 ± 0.00 0.43 ± 0.05*1.03 ± 0.06 2.92 ± 0.23#719.207＜0.001

2.5 miR-557 過表達對RA-FLS 增殖、遷移侵襲的影響與miR-NC 組比較，miR-557 組RA-FLS 中miR-557 表達水平、E-cadherin 蛋白水平顯著升高（P＜0.05），劃痕愈合率、侵襲數(shù)以及Ki-67、PCNA和N-cadherin 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），見圖4和表6。

圖4 miR-557 過表達對RA-FLS 增殖、遷移侵襲相關蛋白表達的影響Fig.4 Effects of miR-557 overexpression on the expression of proteins related to proliferation，migration and invasion of RA-FLS

表6 miR-557 過表達對RA-FLS 增殖、遷移侵襲的影響Tab.6 Effects of miR-557 overexpression on proliferation, migration and invasion of RA-FLS ±s

表6 miR-557 過表達對RA-FLS 增殖、遷移侵襲的影響Tab.6 Effects of miR-557 overexpression on proliferation, migration and invasion of RA-FLS ±s

組別miR-NC 組miR-557 組t 值P 值miR-557 1.00 ± 0.00 3.26 ± 0.28 24.214＜0.001 OD 值（450nm）0.89 ± 0.07 0.51 ± 0.05 13.252＜0.001劃痕愈合率（%）69.65 ± 5.37 31.58 ± 4.57 16.193＜0.001侵襲細胞數(shù)（個）114.24 ± 12.48 50.87 ± 4.08 14.479＜0.001 Ki-67 蛋白0.64 ± 0.05 0.32 ± 0.03 16.464＜0.001 PCNA 蛋白0.86 ± 0.07 0.40 ± 0.04 17.117＜0.001 E-cadherin 蛋白0.13 ± 0.02 0.51 ± 0.05 21.169＜0.001 N-cadherin 蛋白0.77 ± 0.04 0.35 ± 0.03 25.200＜0.001

2.6 下調miR-557 表達逆轉了干擾circ_0005276表達對RA-FLS 增殖、遷移侵襲的作用與si-circ_0005276+anti-miR-NC 組比較，si-circ_0005276+antimiR-557 組RA-FLS 中miR-557 表達水平、E-cadherin 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），劃痕愈合率、侵襲數(shù)以及Ki-67、PCNA 和N-cadherin 蛋白水平顯著升高（P＜0.05），見圖5 和表7。

表7 下調miR-557 表達逆轉了干擾circ_0005276 表達對RA-FLS 增殖、遷移侵襲的作用Tab.7 Downregulation of miR-557 expression reversed the effects of cirC_0005276 expression interference on the proliferation，migration and invasion of RA-FLS±s

表7 下調miR-557 表達逆轉了干擾circ_0005276 表達對RA-FLS 增殖、遷移侵襲的作用Tab.7 Downregulation of miR-557 expression reversed the effects of cirC_0005276 expression interference on the proliferation，migration and invasion of RA-FLS±s

組別si-circ_0005276+anti-miR-NC組si-circ_0005276+anti-miR-557組t值P值miR-557 1.00±0.00 0.44±0.04 42.000＜0.001 OD值（450 nm）0.41±0.04 0.79±0.05 17.804＜0.001劃痕愈合率（%）23.49±2.15 56.34±4.99 18.138＜0.001侵襲細胞數(shù)（個）44.52±4.87 96.41±7.69 17.102＜0.001 Ki-67蛋白0.24±0.02 0.51±0.04 18.112＜0.001 PCNA蛋白0.30±0.03 0.72±0.06 18.783＜0.001 E-cadherin蛋白0.58±0.04 0.26±0.02 21.466＜0.001 N-cadherin蛋白0.27±0.03 0.62±0.06 15.652＜0.001

圖5 下調miR-557 表達逆轉了干擾circ_0005276 表達對RA-FLS 增殖、遷移侵襲相關蛋白表達的作用Fig.5 Down-regulation of miR-557 expression reversed the effect of circ_0005276 expression interference on the expression of proteins related to proliferation，migration and invasion of RA-FLS

3 討論

RA 作為一種自身免疫性疾病，滑膜細胞的增殖和侵襲是導致RA 骨和軟骨破壞的關鍵因素，最終導致患者肢體功能受限［11-12］。因此，明確RAFLS 侵襲的分子機制在RA 的治療中具有重要意義。研究顯示，circRNA 與RA 進展的多個環(huán)節(jié)相關，circ_AFF2 促進RA 中RA-FLS 的增殖和炎癥反應［13］；circ_0088194 和circ_0088036 高表達誘導RAFLS 遷移和侵襲［14-15］。外周血單個核細胞中circ_0000175 和circ_0008410 的表達水平與RA 病情活動度和嚴重程度相關［16］。本研究顯示CIA 大鼠滑膜組織中circ_0005276 顯著上調，提示RA 發(fā)展可能與circ_0005276 失調有關。為分析circ_0005276在RA 中的功能，本研究轉染si-circ_0005276 至RA-FLS 并分析其增殖、侵襲的作用途徑。PCNA和Ki-67 是兩種與增殖相關的蛋白，已被證實與RA-FLS 的增殖活性呈正相關［17-18］。本研究中干擾circ_0005276 表達后RA-FLS 活力以及PCNA、Ki-67蛋白水平降低，提示干擾circ_0005276 表達可抑制RA-FLS 增殖，這與之前研究表明干擾circ_0005276表達對前列腺癌細胞的抗增殖作用一致。上皮細胞-間充質轉化（EMT）是腫瘤侵襲轉移的關鍵步驟，RA-FLS 對關節(jié)軟骨的高度侵蝕性與腫瘤細胞病理特征類似，提示RA-FLS 遷移和侵襲中也可能存在EMT［19］。EMT 的標志是N-cadherin 表達上調和E-cadherin 表達下調，有研究［20］表明下調Smad1基因可影響N-cadherin和E-cadherin表達，阻礙EMT的發(fā)生，抑制RA-FLS 遷移和侵襲。本研究中，干擾circ_0005276 表達導致RA-FLS 的遷移和侵襲能力降低，并伴隨著N-cadherin 下調和E-cadherin 上調，證實干擾circ_0005276 表達對RA-FLS 的遷移和侵襲抑制作用。以上研究表明，干擾circ_0005276 表達可能是RA 治療的重要干預措施。

circRNA 可靶向miRNA 調控RA 進展，circ_09505 通過下調miR-6089 加重CIA 小鼠的炎癥和關節(jié)損傷［21］；circASH2L 通過miR-129-5p/HIPK2 軸促進RA-FLS 的腫瘤樣生物學行為和炎癥反應［22］。本研究結果顯示miR-557 與circ_0005276 存在直接相互作用，且在RA-FLS 中miR-557 表達受到circ_0005276 的負性調控。既往研究［23］發(fā)現(xiàn)，miR-557 在骨肉瘤中低表達，miR-557 的上調抑制了骨肉瘤細胞的增殖和EMT 過程。miR-557 通過靶向EFNB2 抑制胰腺導管癌進展［24］。此外，沉默circEIF6 對胰腺癌細胞的凋亡誘導和侵襲抑制作用也與上調miR-557 表達有關［25］。本研究檢測到CIA 大鼠滑膜組織中miR-557 表達降低，miR-557過表達導致RA-FLS 活力下降，PCNA、Ki-67、Ncadherin 表達降低，遷移和侵襲能力降低，以及Ecadherin 表達升高，證實miR-557 對RA-FLS 腫瘤樣侵襲行為的抑制作用。研究顯示，下調miR-557表達在一定程度上逆轉了干擾circ_0005276 表達對RA-FLS 增殖、遷移侵襲的抑制作用，表明circ_0005276 通過靶向miR-557 促進RA-FLS 增殖、遷移和侵襲行為。因此，靶向抑制circ_0005276/ miR-557 途徑可能是RA 的潛在治療策略。

【Author contributions】CUI Jiakang：conceptualization，methodology，writing-original draft；GAO Qingjie：investigation；ma junfu：formal analysis，validation；MENG Qingliang：supervision，writing-review editing. All authors read and approved the final manuscript as submitted.