董國慶 黃秒 陸喜燕

南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳婦幼保健院兒童內(nèi)分泌科（廣東深圳 518028）

糖尿病是兒童時(shí)期第三常見的慢性疾病，是因環(huán)境及遺傳等多種因素導(dǎo)致的一種代謝紊亂，主要有1 型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）、2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）和其它類型糖尿病［1］。單基因型糖尿病作為其它類型糖尿病中的重要組成部分，包括新生兒糖尿?。╪eonatal diabetes mellitus，NDM）、青少年成人型糖尿?。╩aturity-onset diabetes of the young，MODY）、線粒體糖尿?。╩itochondria diabetes mellitus，MDM）和綜合征相關(guān)糖尿病等，約占兒童糖尿病的1% ～6%［2-3］。然而，由于臨床表型異質(zhì)性和缺乏糖尿病家族史，有一部分單基因糖尿病被誤診。近年來，隨著二代測序技術(shù)（next-generation sequencing，NGS）及全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wide association studies，GWAS）的開展，糖尿病的遺傳學(xué)基礎(chǔ)越來越清楚。本文對兒童糖尿病基因檢測相關(guān)內(nèi)容做如下綜述。

1 各類兒童糖尿病的遺傳學(xué)進(jìn)展

1.1 T1DMT1DM 有關(guān)的遺傳變異不斷被發(fā)現(xiàn)，但其機(jī)制如何，待進(jìn)一步研究［4］。GWAS 已經(jīng)確定了50 多個(gè)導(dǎo)致T1DM 發(fā)病機(jī)制的遺傳風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域，超過60% 的變異影響胰島β 細(xì)胞表達(dá)，表明這些基因可能在T1DM 發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用［5］。最近研究表明，T1DM 遺傳風(fēng)險(xiǎn)評分（the type 1 diabetes genetic risk score，T1D-GRS）可篩查T1DM 遺傳風(fēng)險(xiǎn)，適用于新生兒［6-7］、成人糖尿病的分類和胰島自身免疫性疾?。?］。

1.2 T2DM2 型糖尿病是一種復(fù)雜的疾病，是遺傳、表觀遺傳和環(huán)境因素之間相互作用的結(jié)果［9］。自2007年開始進(jìn)行T2DM-GWAS 研究后已發(fā)現(xiàn)約250 個(gè)基因組區(qū)域與T2DM 易感性相關(guān)［10］，其中幾個(gè)區(qū)域出現(xiàn)了基因突變和疾病的因果證據(jù)［11］。例如：KCNJ11、WFS1、HNF1A、HNF1B、ABCC8、GLIS3。長鏈非編碼RNA 在T2DM 患者中與胰島功能相關(guān)，并可促進(jìn)胰島β 細(xì)胞的凋亡［12］。有關(guān)多基因結(jié)構(gòu)與T2DM 研究取得了快速進(jìn)展，但在疾病預(yù)測或預(yù)防的臨床應(yīng)用很少［10］。

1.3 單基因糖尿病

1.3.1 MODY是指青少年發(fā)病的成年型糖尿病，代表了一組臨床異質(zhì)性常染色體顯性遺傳疾病，由參與β 細(xì)胞發(fā)育和胰島素分泌的基因突變引起，是最常見的單基因糖尿病形式［1，13］。目前明確導(dǎo)致MODY 致病基因有14 個(gè)，其中GCK、HNF1A及HNF4A 突變在MODY 最常見［14］。MODY 在兒童人群中發(fā)病率因國家和地區(qū)而異，但以上基因致病突變約占所有MODY 病例的85% ～90%［15］。GCK 基因突變在中國MODY 患者中最為常見，其次是PAX4、FOXM1［16-18］。注意的是，具有MODY樣表型的患者中未發(fā)現(xiàn)在已知的MODY 基因突變，需考慮是否有其他基因致病突變導(dǎo)致。最近的研究將RFX6 確定為一種新的MODY 基因［19］，WFS1、PPARG 和GLIS3 可作為這些罕見MODY 形式的潛在候選基因［20］。

1.3.2 NDM是指出生后6 個(gè)月內(nèi)發(fā)病的糖尿病，非常罕見疾病，發(fā)病率為1/10 萬～1/40 萬，目前發(fā)現(xiàn)至少有26 個(gè)致病基因［21］，其中編碼鉀ATP 通道亞單位的基因（KCNJ11、ABCC8），INS 基因與暫時(shí)性和永久性NDM 有關(guān)，而GCK 基因中的突變主要表現(xiàn)為永久性NDM。

1.3.3 MDM是指線粒體基因突變型和核基因突變型導(dǎo)致的特殊類型糖尿病，占糖尿病總數(shù)的3%。到目前為止，總共發(fā)現(xiàn)了54 個(gè)與不同類型糖尿病相關(guān)的mtDNA 突變［22］，其中m.3243A＞G 突變是MDM 中最常見的突變位點(diǎn)，約占所有MDM 的85%，m.3243A＞G 突變攜帶率高達(dá)1∶400。MDM 在兒童期發(fā)病較少，主要在成年發(fā)現(xiàn)。若兒童期先出現(xiàn)耳聾和發(fā)育遲緩（包括智力殘疾、自閉癥、矮小），后有糖尿病，要注意MDM。特別是在家系內(nèi)發(fā)現(xiàn)糖尿病的傳遞符合母系遺傳，是高度需注意除外MDM［23］。

2 臨床基因檢測方法選擇及應(yīng)用指征

2.1 臨床基因檢測方法選擇NGS 技術(shù)正迅速成為臨床實(shí)驗(yàn)室對疑似遺傳疾病患者的常規(guī)臨床診斷工具。首選全外顯子測序（whole exome sequencing，WES），現(xiàn)在市面上提供的臨床外顯子測序大部分可檢測點(diǎn)突變外，還檢測染色體微缺失、編碼區(qū)的大片段缺失、部分線粒體基因。注意的是，臨床醫(yī)師在選擇基因檢測前，需結(jié)合臨床表型篩選感興趣的基因，并與檢測實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)感興趣基因已充分覆蓋。經(jīng)濟(jì)條件允許，可以做家系全外，可以提高致病基因新發(fā)突變的幾率。還有一些用全外測序不能檢出，例如6q24 暫時(shí)性新生兒糖尿?。═NDM）是一類罕見的單基因糖尿病，與染色體6q24 區(qū)基因印跡異常有關(guān)，需用甲基化特異性多重連接依賴性探針擴(kuò)增法（methylation-specific multiplex ligation-dependent probe amplification，MSMLPA）［24］。對于MDM 臨床疑診患者時(shí)，首先篩查m.3243 位點(diǎn)，國內(nèi)部分基因檢測公司開展m.3243位點(diǎn)口腔唾液篩查，必要時(shí)首取選皮膚組織（皮膚成纖維細(xì)胞），其次為血液（淋巴細(xì)胞）進(jìn)行線粒體基因包檢測。目前用于mtDNA 突變分析的方法包括WES、線粒體基因包和全基因組測序（wholegenome sequencing，WGS）［25］。WGS 主要用于識(shí)別核突變的情況下很有用，但它的檢測效率和準(zhǔn)確性需要提高［26］。

在進(jìn)行基因檢測前，臨床醫(yī)師需收集完整的臨床信息，如人類表型本體（human phenotype ontology，HPO）規(guī)范表達(dá)，完整的家族史［27］。進(jìn)行任何基因檢測前均需向受檢者簽署知情同意書，告知詳細(xì)閱讀理解。檢測都不能保證100%找到致病原因，基于現(xiàn)有的研究及認(rèn)識(shí)、受送檢樣本的真實(shí)性、檢測局限性等因素限制。檢測只是輔助臨床診斷，不能替代臨床診斷。高精度的檢測方法仍然面臨可能發(fā)現(xiàn)一些臨床意義未明的結(jié)果，做好思想準(zhǔn)備。

2.2 臨床應(yīng)用指征對于以下幾類糖尿病患兒，建議進(jìn)行分子遺傳學(xué)檢測［1，13，28］：（1）6 個(gè)月齡前發(fā)?。唬?）6 ～12 個(gè)月齡起病，自身抗體陰性；（3）合并胰腺外病變；（4）家族多代（三代以上）高血糖或糖尿病史；（5）診斷T1DM 5年后，胰島素需要量低，血清及尿C 肽在正常范圍或稍偏低；（6）穩(wěn)定、輕度的空腹血糖升高（5.5 ～8.5 mmol/ L），糖化血紅蛋白穩(wěn)定在5.6% ～7.6%之間，特別是非肥胖患者；（7）新生兒期高胰島素性低血糖癥；（8）與肥胖程度不符合的顯著黑棘皮病表現(xiàn)，可伴有高甘油三酯等脂代謝異常表現(xiàn)；（9）中心型肥胖。（10）有明確的糖尿病家族史。多項(xiàng)研究顯示［2，29-30］自身抗體陰性是MODY 的最強(qiáng)預(yù)測因子，另外兩個(gè)關(guān)鍵因素是診斷時(shí)糖化血紅蛋白＜7.5%和父母有糖尿病史。

1 歲至青春期前的兒童糖尿病主要是T1DM，在青春期前后，更多考慮T2DM 和單基因糖尿病，但T1DM 仍是一個(gè)考慮因素。診斷單基因糖尿病和T2DM 時(shí)，陽性家族史是重要的參考因素。因此必須要詢問每個(gè)兒童糖尿病的家庭成員的具體細(xì)節(jié)，包括糖尿病診斷時(shí)的年齡、診斷時(shí)的身體狀況和治療，以獲得有價(jià)值的家族史。

筆者給1 名生后有持續(xù)高血糖新生兒，予NGS測序基發(fā)現(xiàn)KCNJ11 c.679G/A p.（Glu227Lys）變異，家系驗(yàn)證提示父母均未見此突變。先證者為孕39+4周，女孩，出生體質(zhì)量2.12 Kg，生后因“足月小于胎齡兒，孕母妊娠期糖尿病兒”在新生兒科住院期間持續(xù)高血糖，血糖波動(dòng)在8.8 ～17.4 mmol/L，基因確診后給予口服格列本脲［0.05 ～01 mg/（kg·d），Tid 或Biol］治療1 周后血糖逐漸恢復(fù)正常，在1 歲時(shí)?？诜幬?，現(xiàn)3 歲10月血糖定期監(jiān)測正常。此患兒表現(xiàn)為暫時(shí)性新生兒糖尿病，借助分子診斷技術(shù)實(shí)現(xiàn)了精準(zhǔn)治療。

3 基因報(bào)告臨床解讀

兒童糖尿病第二代測序發(fā)現(xiàn)的、或者臨床未證實(shí)的可疑致病突變均可依照美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)會(huì)以及美國分子病理學(xué)會(huì)遺傳變異標(biāo)準(zhǔn)分類與指南進(jìn)行判別［31］。具體的遺傳變異分析流程（圖1）可參照美國國立衛(wèi)生研究院臨床基因組資源基因注解工作組制定的標(biāo)準(zhǔn)操作流程（https：//clinicalgenome.org/，ClinGen），用于基因功能判斷的各種數(shù)據(jù)可從臨床相關(guān)變異數(shù)據(jù)庫（https//www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/，ClinVar）、人類基因突變數(shù)據(jù)庫（HGMD?）中獲取。對于功能數(shù)據(jù)缺乏的遺傳變異，可用生物信息學(xué)預(yù)測法對其進(jìn)行評估。

圖1 基因測序致病性的判斷流程圖Fig.1 Flow chart for determining the pathogenicity of gene sequencing

基因報(bào)告中經(jīng)常出現(xiàn)的意義未明突變（VUS）使得情況更加復(fù)雜，確定VUS 是否與患者的臨床表現(xiàn)有關(guān)是糖尿病基因診斷中最具挑戰(zhàn)性的方面之一［32］。目前，國內(nèi)大部分醫(yī)療機(jī)構(gòu)無專門的遺傳咨詢師為遺傳病提供遺傳咨詢，因此，在建立臨床診斷后，臨床醫(yī)師需承擔(dān)為患者及家屬提供遺傳咨詢。臨床醫(yī)師收到基因報(bào)告后，可以參照中國2020年發(fā)表的《遺傳病二代測序臨床檢測全流程規(guī)范化共識(shí)探討》［33］中有關(guān)檢測報(bào)告解讀和遺傳咨詢部分進(jìn)行臨床解讀?？赡軙?huì)出現(xiàn)以下幾種情況：（1）檢出與先證者表型相關(guān)且符合遺傳規(guī)律的致病/疑似致病變異：臨床醫(yī)師應(yīng)該查閱相關(guān)文獻(xiàn)，結(jié)合臨床表現(xiàn)與基因檢測結(jié)果謹(jǐn)慎的對先證者確診。通常遺傳報(bào)告不提供臨床指導(dǎo)，在建立了基因診斷后也需查閱相關(guān)文獻(xiàn)，對臨床管理進(jìn)行適當(dāng)?shù)母淖?。例如：GCK 基因突變致MODY 無需降糖治療，HNF1A 基因突變致MODY可能對磺脲類藥物治療更敏感。筆者用定制糖尿病基因包檢測一位反復(fù)空腹高血糖10 歲8月女孩，發(fā)現(xiàn)HNF1A 基因c.599G＞A（p.R200Q）雜合突變，診斷MODY3，家系驗(yàn)證變異來源于母親，母親也存在空腹血糖異常，予飲食控制可正常，同胞弟弟也存在同一位點(diǎn)的突變，但未進(jìn)行血糖檢測。但本例先證者進(jìn)行飲食控制后血糖控制理想，因此我們還應(yīng)該注意到并非推薦MODY 最佳的治療方案適合所有患者，注意個(gè)體化治療。特別注意的是糖尿病線粒體DNA 突變分析，因MDM 常見致病m.3243A＞G 人群攜帶率高，有較低的臨床外顯率，且有明顯的臨床異質(zhì)性，需謹(jǐn)慎對待。識(shí)別MDM 具有挑戰(zhàn)性，線粒體突變相關(guān)的致病表型取決于攜帶突變的mtDNA 拷貝的比例，并有組織特異性。另外T1DM 和T2DM 也存在線粒體功能障礙，線粒體糖尿病的表型也可能具有與T1DM 和T2DM 共同臨床表現(xiàn)。因此，臨床上注意區(qū)分由原發(fā)性線粒體疾病導(dǎo)致癥狀性糖尿病與原發(fā)性糖尿病對線粒體的繼發(fā)性影響非常重要。（2）檢出與先證者表型相關(guān)但不符合遺傳規(guī)律的致病/疑似致病變異：這種情況常見于染色體隱性遺傳性糖尿病檢測出一個(gè)致病雜合突變。若先證者臨床表型高度符合該基因相關(guān)疾病臨床表現(xiàn)，建議聯(lián)系基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)室做進(jìn)一步評估、分析。（3）檢出VUS：若VUS 與先證者表型高度相關(guān)且遺傳模式符合，此類變異有可能構(gòu)成糖尿病病因，建議結(jié)合先證者表型和家系驗(yàn)證情況進(jìn)一步分析，必要時(shí)組織遺傳糖尿病專家、基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)室、遺傳學(xué)等進(jìn)行多學(xué)科討論，必要時(shí)做功能驗(yàn)證。若檢出與先證者表型相關(guān)但不符合遺傳規(guī)律VUS，先證者臨床表型高度符合該基因相關(guān)疾病臨床表現(xiàn)，可考慮選擇其它檢測方法或者擴(kuò)大檢測范圍，尋找該基因的另一個(gè)致病變異。

4 功能驗(yàn)證

對于新發(fā)致病突變或者有臨床意義的VUS，有條件的可進(jìn)行變異功能驗(yàn)證。首先需建立合適的糖尿病疾病模型。近年來，利用人類干細(xì)胞建立疾病模型成為研究熱點(diǎn)。人類胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cell lines，hESCs）及患者特異性誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）的整體分化模型為研究遺傳疾病對人類胰腺中β 細(xì)胞發(fā)育以及人類胰腺本身的胚胎發(fā)育的影響提供了有用的工具［34］。許多研究已成功地使用CRISPR/Cas9 工具通過單個(gè)遺傳變異對β 細(xì)胞分化和功能的影響［35］。因T1DM 和T2DM 患者受自身免疫、環(huán)境以及多遺傳因素影響，利用人類干細(xì)胞分化模型對T1DM 和T2DM 建立疾病模型具有挑戰(zhàn)性［36］，但是對于MODY 或PNDM 糖尿病表型糖尿病是一個(gè)理想的選擇［37］。

5 總結(jié)

在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時(shí)代，基因檢測已被證明是鑒定糖尿病遺傳原因重要工具。被診斷的遺傳性糖尿病，受益于精準(zhǔn)的臨床管理、遺傳咨詢、新的治療藥物。不斷報(bào)道的已知基因的新突變和新基因，有助于糖尿病發(fā)病機(jī)制的了解。在這樣的背景下，應(yīng)該重視遺傳因素在兒童糖尿病的致病作用，積極查閱相關(guān)文獻(xiàn)，做好與基因檢測方、患者溝通，對基因檢測的選擇與基因報(bào)告的臨床解釋需謹(jǐn)慎。

【Author contribution】DONG Guoqing and HUANG Miao designed，wrote and revised the article. DONG Guoqing，HUANG Miao and LU Xiyan Reviewed the literatures. All authors read and approved the final manuscript as sub-mitted.