劉 瑾，張朝正，趙 華

（天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

鐮刀菌屬（Fusarium），世界十大植物病原真菌之一[2]，其中，尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）是引起150多種植物枯萎病和根腐病的一種土傳性病害病原菌，屬于半知菌類(lèi)鐮刀菌屬真菌[1]?；诩怄哏牭毒鷮?duì)作物有嚴(yán)重的破壞性，防控尖孢鐮刀菌，對(duì)植物枯萎病和根腐病的防治具有非常重要的意義[3]。微生物菌劑以安全綠色、抗病抗逆、改善土壤微生態(tài)、提高品質(zhì)和產(chǎn)量的優(yōu)勢(shì)成為主要的防治手段[4-7]。目前，應(yīng)用于生物防治的菌株主要為生防真菌、生防細(xì)菌、生防放線菌三大類(lèi)，例如假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、淡紫擬青霉屬（Paecilomyceslilacinus（Thom.）Samson）、叢枝根菌（Arbuscular mycorrhiza）、木霉屬（Trichodermaspp.）等。

貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）是由GARCIA R等新命名的一種生防菌[8-9]，其產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)，抑制病原菌，在飼料、醫(yī)藥、食品、植物保護(hù)、污水處理和生物防控等領(lǐng)域被廣泛研究和應(yīng)用[10-13]。作為生物防治菌株，貝萊斯芽孢桿菌分泌的某些膠原蛋白類(lèi)物質(zhì)與生物膜形成有密切關(guān)系，使菌株的拮抗效果更好，植物根際定殖是生防菌株能力的體現(xiàn)[14-17]。目前，已有關(guān)于芽孢桿菌發(fā)酵條件優(yōu)化的研究報(bào)道，但不同菌株最佳發(fā)酵條件存在較大差異。黎燕珊等[18]優(yōu)化貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）HC-8的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件，提高了該菌株的發(fā)酵產(chǎn)量，增強(qiáng)對(duì)尖孢鐮刀菌、煙草疫霉和輪狀鐮刀菌的拮抗效果。楊可等[19]利用響應(yīng)面法優(yōu)化貝萊斯芽孢桿菌TSC001的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件，提高了發(fā)酵液的抑菌活性，增強(qiáng)了對(duì)黃瓜灰霉病的拮抗效果。貝萊斯芽孢桿菌的發(fā)酵液中除了含有少量的發(fā)酵代謝物質(zhì)外，還含有大量培養(yǎng)雜質(zhì)，其抑菌活性受到培養(yǎng)基中化合物的種類(lèi)、比例及發(fā)酵培養(yǎng)條件參數(shù)的影響。因此，對(duì)貝萊斯芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基以及發(fā)酵條件的優(yōu)化決定抑菌活性物質(zhì)含量的多少，可為其鑒定活性物質(zhì)及分離提純提供研究基礎(chǔ)。

本研究以對(duì)尖孢鐮刀菌具有拮抗作用的貝萊斯芽孢桿菌P9為研究對(duì)象，以其發(fā)酵液的抑菌效果為考察指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面法對(duì)其培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為尖孢鐮刀菌的綠色防控提供理論依據(jù)，為微生物農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)提供微生物資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）：天津科技大學(xué)菌種保藏中心；貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）P9：由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 試劑

酵母浸粉、牛肉膏、胰蛋白胨、蛋白胨、氯化鈉、葡萄糖、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化錳、氯化鈣、氯化鈣、可溶性淀粉、果糖、蔗糖、麥芽糖、大豆蛋白胨、瓊脂粉、硫酸銨、硫酸銅、硫酸鋅：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。試驗(yàn)所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：酵母浸粉5.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、氯化鈉10.0 g/L，pH7.0。LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中添加瓊脂20.0 g/L，121 ℃滅菌20 min。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5.0 g/L、酵母浸粉5.0 g/L、K2HPO41.4 g/L、KH2PO40.6 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeCl20.5 g/L，pH 7.0，115 ℃滅菌30 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

H1815高速離心機(jī)：湘儀離心儀器有限公司；HPX-9162MBE電熱恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SY.45-NJB牛津杯（6 mm×8 mm×10 mm）：北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開(kāi)發(fā)公司；ME204電子天平：瑞士METTLER TOLEDO公司；DELTA320 pH計(jì)：多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；HNY-200B控溫?fù)u床：上海智能分析儀器制造有限公司；YS-40A干熱滅菌箱：天津天宇機(jī)電有限公司。

1.3 方法

1.3.1 貝萊斯芽孢桿菌P9生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

取保藏的貝萊斯芽孢桿菌P9于LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)36 h得到種子液。將貝萊斯芽孢桿菌P9種子液以3%的接種量接種于LB液體培養(yǎng)基，在30 ℃，160 r/min條件下培養(yǎng)36 h，每隔3 h取樣，測(cè)定其OD600nm值，繪制貝萊斯芽孢桿菌P9的生長(zhǎng)曲線。

1.3.2 貝萊斯芽孢桿菌P9抑菌發(fā)酵液及無(wú)菌濾液的制備

將貝萊斯芽孢桿菌P9種子液以3%的接種量接種于LB液體培養(yǎng)基，在30 ℃，160 r/min條件下培養(yǎng)72 h后，5 000 r/min離心10 min去除菌體，取上清液過(guò)一次性使用無(wú)菌濾膜0.22 μm，得無(wú)菌發(fā)酵濾液。

1.3.3 貝萊斯芽孢桿菌P9抑菌活性的測(cè)定

采用牛津杯法測(cè)定貝萊斯芽孢桿菌P9發(fā)酵液的抑菌活性，在PDA平板活化培養(yǎng)尖孢鐮刀菌，30 ℃條件下培養(yǎng)5 d，使其鋪滿(mǎn)平板，然后將滅菌牛津杯均勻擺放于平板上，吸取200 μL貝萊斯芽孢桿菌P9無(wú)菌發(fā)酵濾液加入到牛津杯內(nèi)，30 ℃條件下培養(yǎng)72 h，通過(guò)十字交叉法[20]測(cè)量抑菌圈直徑。

1.3.4 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗(yàn)

固定發(fā)酵條件為種子液接種量3%（V/V），30 ℃、160 r/min培養(yǎng)72 h。在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別對(duì)培養(yǎng)基配方的碳源種類(lèi)（葡萄糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉、麥芽糖）及最佳碳源添加量（0、5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L）、氮源種類(lèi)（牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、胰蛋白胨、硫酸銨）及最佳氮源添加量（0、5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L）、無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)（NaCl、KCl、CaCl2、MnCl2）及無(wú)機(jī)鹽添加量（0、0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L）[21]進(jìn)行優(yōu)化，并測(cè)量?jī)?yōu)化后抑菌圈直徑。

1.3.5 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以抑菌圈直徑（Y）為響應(yīng)值，選取3個(gè)影響最大的因素可溶性淀粉含量（A）、酵母浸粉含量（B）、氯化錳含量（C），采用Design-Expert10.0.8軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成[22-25]。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests design for fermentation medium optimization

1.3.6 發(fā)酵條件的優(yōu)化

固定基本發(fā)酵條件為：初始pH值為7、接種量3%、發(fā)酵溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速160 r/min、發(fā)酵時(shí)間72 h，以抑菌圈直徑為考察指標(biāo)，分別考察初始pH值（5、6、7、8、9）、接種量（1.5%、3.0%、4.5%、6.0%）、發(fā)酵時(shí)間（24 h、48 h、72 h、84 h）、轉(zhuǎn)速（80 r/min、160 r/min、240 r/min、320 r/min）、發(fā)酵溫度（25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃）對(duì)抑菌效果的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 貝萊斯芽孢桿菌P9生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

貝萊斯芽孢桿菌P9的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖1。由圖1可知，Bacillus velezensisP9在培養(yǎng)6 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在培養(yǎng)15 h時(shí)，進(jìn)入穩(wěn)定期，菌體的OD600nm值達(dá)到最大，并基本保持穩(wěn)定，培養(yǎng)26 h后菌體進(jìn)入衰亡期，OD600nm值迅速下降。因此，確定貝萊斯芽孢桿菌P9最佳轉(zhuǎn)接時(shí)間為9 h。

圖1 貝萊斯芽孢桿菌P9的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of Bacillus velezensis P9

2.2 培養(yǎng)基成分優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 碳源及最佳碳源添加量的確定

碳源對(duì)于Bacillus velezensisP9發(fā)酵液抑菌性能的影響見(jiàn)圖2。

圖2 碳源種類(lèi)（a）及可溶性淀粉添加量（b）對(duì)菌株P(guān)9發(fā)酵液抑菌性能的影響Fig.2 Effect of carbon source types(a)and soluble starch addition(b)on bacteriostatic performance of strain P9 fermentation broth

由圖2a可知，不同的碳源對(duì)貝萊斯芽孢桿菌P9所產(chǎn)的拮抗物質(zhì)均有影響，當(dāng)以蔗糖或果糖作為碳源時(shí)，分泌的拮抗物質(zhì)較少，對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制能力較低；葡萄糖、麥芽糖作為碳源時(shí)，抑菌圈直徑略有提高；而以可溶性淀粉作為碳源時(shí)，抑菌圈直徑可達(dá)到9.0 mm，究其原因可能是，可溶性淀粉作為遲效碳源，避免了葡萄糖、果糖等單糖作為碳源時(shí)所產(chǎn)生的分解代謝阻遏效應(yīng)[26-28]。因此，確定最佳碳源為可溶性淀粉。由圖2b可知，隨著可溶性淀粉添加量在0～5 g/L范圍內(nèi)的增加，抑菌圈直徑逐漸增加；當(dāng)可溶性淀粉添加量達(dá)到5 g/L時(shí)，抑菌圈直徑達(dá)到最大值，為10 mm；當(dāng)可溶性淀粉添加量＞5 g/L時(shí)，抑菌圈直徑開(kāi)始下降。因此，確定最適可溶性淀粉添加量為5 g/L。

2.2.2 氮源及最佳氮源添加量的確定

氮源對(duì)于貝萊斯芽孢桿菌P9發(fā)酵液抑菌性能的影響見(jiàn)圖3。

圖3 氮源種類(lèi)（a）及酵母浸粉添加量（b）對(duì)菌株P(guān)9發(fā)酵液抑菌性能的影響Fig.3 Effect of nitrogen source types(a)and yeast extract addition(b)on bacteriostatic performance of strain P9 fermentation broth

由圖3a可知，以硫酸銨為氮源時(shí)，菌株P(guān)9的OD600nm值較低，所產(chǎn)的拮抗物質(zhì)極少，抑菌圈直徑最?。划?dāng)以胰蛋白胨、牛肉膏、蛋白胨為氮源時(shí)，抑菌圈直徑有所增加；酵母浸粉作為氮源時(shí)，抑菌圈直徑可達(dá)最大值，為9.4 mm。因此，確定最適氮源為酵母浸粉。由圖3b可知，當(dāng)酵母浸粉添加量在0～5 g/L范圍內(nèi)增加時(shí)，幾乎無(wú)抑菌圈產(chǎn)生；當(dāng)酵母浸粉添加量＞5 g/L，抑菌圈的直徑逐漸增加；當(dāng)酵母浸粉添加量為15 g/L時(shí)，抑菌圈直徑達(dá)到最大值，為9.3 mm；當(dāng)酵母浸粉添加量＞15 g/L時(shí)，抑菌圈直徑逐漸減小。因此，確定最適酵母浸粉添加量為15 g/L。

2.2.3 無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)及最佳無(wú)機(jī)鹽添加量的確定

無(wú)機(jī)鹽對(duì)于貝萊斯芽孢桿菌P9發(fā)酵液抑菌性能的影響見(jiàn)圖4。

圖4 無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)（a）及MnCl2添加量（b）對(duì)菌株P(guān)9發(fā)酵液抑菌性能的影響Fig.4 Effect of inorganic salts types(a) and MnCl2 addition (b) on bacteriostasis of strain P9 fermentation broth

由圖4a可知，與基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基相比，添加NaCl、KCl、CaCl2、MnCl2均有抑菌效果，但MnCl2在4種無(wú)機(jī)鹽中效果最明顯，此時(shí)抑菌圈直徑達(dá)到11.59 mm。由圖4b可知，當(dāng)MnCl2添加量在1.0 g/L范圍內(nèi)增加時(shí)，抑菌圈直徑逐漸增加，表明MnCl2對(duì)菌株分泌拮抗物質(zhì)具有一定的促進(jìn)作用；當(dāng)MnCl2添加量為1.0 g/L時(shí)，抑菌圈直徑達(dá)到最大值，為15.5 mm；當(dāng)MnCl2添加量＞1.0 g/L時(shí)，抑菌圈直徑逐漸減小，這表明菌株產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)有所抑制?？赡苁怯捎诘蜐舛鹊腗nCl2刺激了Bacillus velezensisP9對(duì)碳源的利用，使得Bacillus velezensisP9分泌更多的拮抗物質(zhì)，但是氯化錳添加量過(guò)高導(dǎo)致拮抗物質(zhì)與MnCl2產(chǎn)生反應(yīng)，拮抗效果逐漸降低[29]。因此，發(fā)酵培養(yǎng)基中最佳MnCl2添加量為1.0 g/L。

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基成分優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以抑菌圈直徑（Y）為響應(yīng)值，選取3個(gè)對(duì)貝萊斯芽孢桿菌P9產(chǎn)拮抗物質(zhì)影響較大的因素可溶性淀粉含量（A）、酵母浸粉含量（B）、氯化錳（MnCl2）含量（C）進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

利用Design Expert 10.0.8軟件對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，擬合得到的模型二次多項(xiàng)式方程為：

表2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及分析Table 2 Results and analysis of Box-Behnken tests design for fermentation medium optimization

由表3可知，該二次回歸模型極顯著（P值＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P值=0.651 5＞0.05），說(shuō)明所建立的模型擬合度較好，模型的決定系數(shù)R2=0.979 6，調(diào)整決定系數(shù)R2adj=0.953 5，表明95.35%的響應(yīng)值變化能由該模型解釋?zhuān)儺愊禂?shù)（coefficient of variation，CV）為0.77%，說(shuō)明試驗(yàn)與模型建立的方程擬合度良好，能用于分析和預(yù)測(cè)發(fā)酵培養(yǎng)基成分優(yōu)化。由P值可知，一次項(xiàng)A、B、二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)抑菌圈直徑影響極顯著（P＜0.01），一次項(xiàng)C對(duì)抑菌圈直徑影響顯著（P＜0.05），其他項(xiàng)影響均不顯著（P＞0.05）。由F值可知，各因素對(duì)抑菌圈直徑影響程度為A＞B＞C。

綜合以上試驗(yàn)結(jié)果，獲得發(fā)酵培養(yǎng)基為：可溶性淀粉6.769 g/L，酵母浸粉18.088 g/L，氯化錳0.888 g/L。在此最佳發(fā)酵培養(yǎng)基條件下，抑菌圈直徑的預(yù)測(cè)值為12.79 mm。為便于實(shí)驗(yàn)操作，修正發(fā)酵培養(yǎng)基為：可溶性淀粉6.8 g/L，酵母浸粉18.1 g/L，氯化錳0.89 g/L。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得抑菌圈直徑實(shí)際值為12.43 mm，基本符合模型預(yù)測(cè)值，說(shuō)明該模型準(zhǔn)確度良好。

2.4 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株貝萊斯芽孢桿菌P9發(fā)酵液抑菌性能的影響見(jiàn)圖5。

圖5 不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株P(guān)9發(fā)酵上清液抑菌活性的影響Fig.5 Effect of different culture conditions on antibacterial performance of strain P9 fermentation supernatant

由圖5a可知，隨著初始pH值在5～7范圍內(nèi)的升高，抑菌圈直徑逐漸增加；當(dāng)初始pH值為7時(shí)，抑菌圈直徑達(dá)到最大值，為11.9 mm；當(dāng)初始pH值＞7時(shí)，抑菌圈直徑下降。究其原因可能是，過(guò)高或過(guò)低的初始pH值均對(duì)菌株產(chǎn)拮抗物質(zhì)有抑制作用，可能是由于過(guò)酸或者過(guò)堿的環(huán)境影響了菌體的生長(zhǎng)及其生命活動(dòng)。因此，確定最佳的初始pH值為7。

由圖5b可知，隨著接種量在1.5%～4.5%范圍內(nèi)的增加，抑菌圈逐漸增加；當(dāng)接種量為4.5%時(shí)，抑菌圈直徑為12.6 mm；當(dāng)接種量＞4.5%時(shí)，抑菌圈直徑趨于平緩。因此，確定最佳接種量為4.5%。

由圖5c可知，隨著發(fā)酵時(shí)間在24～48 h范圍內(nèi)的增加，發(fā)酵液中并未產(chǎn)生抑菌圈，可能是因?yàn)榫w處于富集階段，并未產(chǎn)生拮抗物質(zhì)；隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，抑菌圈直徑逐漸增加，表明發(fā)酵液中的拮抗物質(zhì)正在逐漸積累；發(fā)酵72 h后，抑菌圈直徑達(dá)到最大值，為14.7 mm，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間＞72 h，抑菌圈直徑趨于平穩(wěn)。因此，確定最佳發(fā)酵時(shí)間為72 h。

由圖5d可知，當(dāng)轉(zhuǎn)速在80～240 r/min范圍內(nèi)的增加，抑菌圈直徑逐漸增加，這是因?yàn)檗D(zhuǎn)速提高了發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧量，為菌體生命活動(dòng)提供了充足的氧氣；當(dāng)轉(zhuǎn)速為240 r/min時(shí)，抑菌圈直徑達(dá)到最大值，為14.9 mm；當(dāng)轉(zhuǎn)速＞240 r/min，抑菌圈直徑迅速減小，其原因可能是，過(guò)高的轉(zhuǎn)速影響了菌體的正常生長(zhǎng)及生命活動(dòng)，從而導(dǎo)致發(fā)酵液中拮抗物質(zhì)逐漸減少。因此，確定最佳轉(zhuǎn)速為240 r/min。

由圖5e可知，隨著發(fā)酵溫度在25～30 ℃范圍內(nèi)的增加，抑菌圈直徑逐漸增加；當(dāng)發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)，抑菌圈直徑達(dá)到最大值，為15.0 mm；當(dāng)發(fā)酵溫度＞30 ℃，抑菌圈直徑逐漸降低。因此，確定最佳發(fā)酵溫度為30 ℃。

3 結(jié)論

本研究以抗尖孢鐮刀菌貝萊斯芽孢桿菌P9為試驗(yàn)菌株，其發(fā)酵液對(duì)尖孢鐮刀菌的抑菌效果為考察指標(biāo)，對(duì)菌株P(guān)9的培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。確定其產(chǎn)拮抗物質(zhì)最適的發(fā)酵培養(yǎng)基為：可溶性淀粉6.8 g/L、酵母浸粉18.1 g/L、MnCl20.89 g/L、FeCl20.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L,K2HPO41.4 g/L,KH2PO40.6 g/L，pH 7.0；最佳發(fā)酵條件如下：接種量為4.5%，發(fā)酵溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速240 r/min，發(fā)酵時(shí)間72 h。在此優(yōu)化條件下，抑菌圈直徑可達(dá)到15.0 mm左右，比初始抑菌圈直徑（9.0 mm）擴(kuò)大了1.7倍，為尖孢鐮刀菌的生物防治提供理論基礎(chǔ)。