張金蘭，魏 巍，楊 云，魯 緋

（1.北京市營(yíng)養(yǎng)源研究所有限公司，北京 100069；2.北京市科學(xué)技術(shù)研究院，北京 100089；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

枸杞（Lycium chinense）屬于茄科植物，通常分布在亞洲，尤其是中國(guó)的西北地區(qū)。枸杞的果實(shí)，通常被稱為枸杞或枸杞子。我國(guó)的商品枸杞主要產(chǎn)自寧夏、新疆、甘肅、青海和內(nèi)蒙古，每年生產(chǎn)干果25 000～30 000 t[1]。枸杞具有極高的食用價(jià)值，因其抗氧化、抗衰老、抗糖尿病、抗癌、調(diào)節(jié)免疫等功能而成為超級(jí)食物[2]。枸杞被廣泛用于中餐烹飪和草藥茶中，并被用于生產(chǎn)果汁、糖果、果酒等。在各種枸杞產(chǎn)品中，枸杞果汁是最受歡迎的產(chǎn)品之一，既能保持高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，又能延長(zhǎng)保質(zhì)期。枸杞果汁的部分感官特征，如糖酸比過(guò)高導(dǎo)致甜味不協(xié)調(diào)，降低了消費(fèi)者的購(gòu)買意愿[3]。有必要采用新的加工技術(shù)來(lái)優(yōu)化枸杞果汁的品質(zhì)，豐富其產(chǎn)品種類并提高健康功效[4]。

乳酸菌作為益生菌或功能發(fā)酵劑廣泛應(yīng)用于食品飲料行業(yè)。乳酸菌發(fā)酵可以保持和/或改善原料的營(yíng)養(yǎng)和感官特性，并延長(zhǎng)產(chǎn)品的貨架期[5]。近年來(lái)，由于素食主義、乳糖不耐受、牛奶蛋白過(guò)敏和高膽固醇風(fēng)險(xiǎn)等消費(fèi)者的增加，對(duì)非乳制品發(fā)酵產(chǎn)品的需求急劇上升[6]。水果富含糖、有機(jī)酸和酚類、纖維素等成分，是乳酸菌發(fā)酵的理想基質(zhì)。研究表明，發(fā)酵果汁表現(xiàn)出更強(qiáng)的功能特性。鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）GG和植物乳桿菌（L.plantarum）-1發(fā)酵的藍(lán)莓果渣可以提高其抗氧化活性和膽固醇清除率[7]。植物乳桿菌Lp-115TM發(fā)酵的桑椹汁可顯著提高自由基清除能力，花青素和黃酮醇與2,2'-聯(lián)氮雙（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS）清除能力提高相關(guān)，酚酸和黃酮醇與1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）清除能力和還原力提高相關(guān)[8]。植物乳桿菌（L.plantarum）NCU116發(fā)酵胡蘿卜汁具有血糖、血脂與氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)能力，同時(shí)提高了結(jié)腸中短鏈脂肪酸水平，具有緩解糖尿病癥狀的功能[9]。ZHOU C等[10]通過(guò)植物乳桿菌（L.plantarum）C17和戊糖乳桿菌Lp-B（L.pentosus）Lp-B共發(fā)酵得到富含γ-氨基丁酸的柿子汁，具有潛在的抗宿醉和降血壓功能特性。CATALDO P等[11]用短乳桿菌（L.brevis）CRL 2013作為發(fā)酵劑發(fā)酵草莓汁獲得高活性的發(fā)酵果汁，在Toll樣受體4（toll-like receptors 4，TLR4）激活的情況下，發(fā)酵草莓汁可調(diào)節(jié)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激的RAW264.7巨噬細(xì)胞中環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，Cox-2）表達(dá)，并在體內(nèi)發(fā)揮顯著的抗炎作用。與未發(fā)酵的石榴汁相比，AKTER R等[12]證實(shí)，來(lái)源于大胡蜂消化道的乳桿菌（L.vespulae）DCY75發(fā)酵后石榴汁劑量依賴性地減少一氧化氮（NO）生成和抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inductible nitric oxide synthase，iNOS），具有更好的抗炎活性。

不同的乳酸菌菌株對(duì)不同的食物基質(zhì)具有菌株特異性。本研究前期從商業(yè)直投式發(fā)酵劑中篩選得到適合枸杞果汁發(fā)酵的發(fā)酵劑-鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）LGG。在此基礎(chǔ)上，采用DPPH·、ABTS·+和鐵離子還原法（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）法研究枸杞果汁在發(fā)酵后的體外抗氧化活性、過(guò)氧化氫（H2O2）損傷的結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2評(píng)價(jià)抗氧化活性、LPS處理的巨噬細(xì)胞RAW264.7評(píng)價(jià)抗炎活性，為發(fā)酵枸杞果汁的功能特性提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，有助于枸杞在食品工業(yè)中得到更廣泛的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

枸杞果汁（可溶性固形物21.1%，總糖（以葡萄糖計(jì)）5.9%，總酸（以檸檬酸計(jì)）0.68%）：青海康普生物科技股份有限公司。

1.1.2 菌株與細(xì)胞

鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus）LGG直投式發(fā)酵劑：科·漢森有限公司；巨噬細(xì)胞RAW264.7、結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2：中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。

1.1.3 試劑

氫氧化鈉、無(wú)水乙醇、過(guò)氧化氫、甲醇、醋酸鈉、冰乙酸、鹽酸、氯化鐵（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DPPH、2,4,6-三（2-吡啶）-1,3,5-三嗪（2,4,6-tripyridin-2-yl-1,3,5-triazine，TPTZ）、脂多糖（LPS）（均為分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；ABTS+自由基清除能力測(cè)定試劑盒、6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox）：美國(guó)Sigma公司；胎牛血清、胰蛋白酶、雙抗：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（pH 7.2）、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit 8 CCK-8）、細(xì)胞因子測(cè)定試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.1.4 培養(yǎng)基

Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco's modification of Eagle's medium，DMEM）、洛斯維·帕克紀(jì)念研究所1640培養(yǎng)基（Roswell Park Memorial Institute medium 1640，RMPI 1640）：默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FE28臺(tái)式pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；MCO-15M二氧化碳培養(yǎng)箱：三洋電機(jī)株式會(huì)社；iMark酶標(biāo)儀：美國(guó)BIO-RAD公司；HH-2恒溫水浴鍋：上海力辰邦西儀器科技有限公司；E-5298A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；3K15冷凍離心機(jī)：美國(guó)Sigma公司；HWS-250Y電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 枸杞果汁發(fā)酵

在無(wú)菌條件下，將枸杞果汁（300 mL）裝入500 mL螺旋蓋透明玻璃瓶中。在無(wú)菌室中進(jìn)行接種試驗(yàn)，所用菌種是鼠李糖乳桿菌LGG直投式發(fā)酵劑，根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)感官評(píng)價(jià)結(jié)果，確定發(fā)酵條件為：接種量0.05%，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時(shí)間8 h，發(fā)酵結(jié)束后置于-20 ℃保存待用。以未發(fā)酵的枸杞果汁相同處理作為對(duì)照。

1.3.2 枸杞果汁和枸杞發(fā)酵果汁提取物制備

枸杞果汁和枸杞發(fā)酵果汁水提物的制備[13]：50 mL枸杞果汁或枸杞發(fā)酵果汁加入NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，在70 ℃水浴中加熱提取2 h，然后將枸杞果汁離心（4 ℃、3 000×g，15 min），取上清液，提取過(guò)程重復(fù)3次，55 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至50 mL，用0.45 μm的膜過(guò)濾，保存于-20 ℃?zhèn)溆?，枸杞果汁樣品?biāo)記為C-GOJI，發(fā)酵枸杞果汁樣品標(biāo)記為F-GOJI。

1.3.3 體外抗氧化活性的測(cè)定

體外抗氧化活性的測(cè)定采用Trolox等效抗氧化能力（trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC）測(cè)定法。

DPPH自由基清除能力的測(cè)定[14]：將2 mL樣品加入4 mL DPPH甲醇溶液（0.045 mg/mL）中。將混合物在黑暗中保持30 min，然后將0.2 mL的混合物迅速轉(zhuǎn)移到96孔的酶標(biāo)板上，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)量吸光度值。

ABTS+自由基清除能力的測(cè)定[15]：根據(jù)試劑盒說(shuō)明書，在96孔酶標(biāo)板上，每孔反應(yīng)體系中加入10 μL樣品（或標(biāo)準(zhǔn)品）和20 μL肌紅蛋白工作液，再加入150 μL ABTS工作液（每10 mL ABTS工作液含有25 μL 3%的過(guò)氧化氫），混勻后反應(yīng)5 min，加入100 μL 終止液，波長(zhǎng)405 nm處測(cè)量吸光度值。

鐵還原抗氧化能力（FRAP）的測(cè)定[16]：將0.3 mol/L醋酸鹽緩沖液（pH 3.6）、10 mmol/L TPTZ和20 mmol/L氯化鐵按10∶1∶1的比例混合，混合溶液在37 ℃孵育30 min，得到FRAP溶液。將10 μL樣品加入190 μLFRAP溶液中，室溫下暗處孵育3～5 min，波長(zhǎng)593 nm處測(cè)定吸光度值。

分別采用濃度為0、0.015 mmol/L、0.045 mmol/L、0.105 mmol/L、0.21 mmol/L、0.42 mmol/L的Trolox（水溶性維生素E 類似物）溶液作為樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)回歸方程將樣品的抗氧化能力換算成當(dāng)量mmol/L的Trolox，結(jié)果表示為mmol/L Trolox當(dāng)量（Trolox equivalent，TE）/L）。

1.3.4 細(xì)胞毒性

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞或RAW264.7細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞板中，Caco-2細(xì)胞在DMEM（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、青霉素G 100 IU/mL、鏈霉素100 IU/mL）中進(jìn)行培養(yǎng)，RAW264.7 細(xì)胞在RMPI 1640（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、青霉素G 100 IU/mL、鏈霉素100 IU/mL）中進(jìn)行培養(yǎng)。Caco-2細(xì)胞接種密度為5.0×104cells/mL，RAW264.7細(xì)胞接種密度為1.0×105cells/mL，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。棄去原培養(yǎng)基，加入100 μL含樣品（不同稀釋度的樣品）的培養(yǎng)液，對(duì)照組只加100 μL的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

使用CCK-8試劑盒檢測(cè)不同樣品處理后細(xì)胞的存活率：移去培養(yǎng)基，用PBS清洗一次，加入新鮮培養(yǎng)基，每孔加入10 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定在波長(zhǎng)450 nm 處的吸光度值。細(xì)胞活力在90%以上表示樣品無(wú)細(xì)胞毒性。細(xì)胞活力計(jì)算數(shù)學(xué)式如下：

式中：A樣品為樣品孔的吸光度值；A空白為僅含CCK-8溶液的培養(yǎng)基的空白孔吸光度值；A對(duì)照為含有細(xì)胞、CCK-8溶液的培養(yǎng)基的對(duì)照孔吸光度值。

1.3.5 枸杞提取物對(duì)細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

細(xì)胞氧化損傷模型的建立：接種密度為5.0×104cells/mL的Caco-2細(xì)胞于96 孔板中，分別設(shè)置空白組和模型組。細(xì)胞在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，模型組分別加入終濃度為100 μmol/L、200 μmol/L、300 μmol/L、400 μmol/L、500 μmol/L的H2O2，繼續(xù)孵育24 h后，CCK-8法測(cè)定細(xì)胞存活率，當(dāng)細(xì)胞存活率約為50%時(shí)，對(duì)應(yīng)的H2O2濃度即為建立Caco-2細(xì)胞氧化損傷模型的濃度。

對(duì)H2O2氧化損傷的細(xì)胞的保護(hù)作用：將密度為5.0×104cells/mL的Caco-2細(xì)胞接種于96 孔板中，分別設(shè)置對(duì)照組、模型組和干預(yù)組。細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)基，干預(yù)組加入含10 μL不同樣品的培養(yǎng)基，同時(shí)模型組和對(duì)照組僅加入培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育24 h，干預(yù)組和模型組加入最佳損傷濃度的H2O2溶液，繼續(xù)孵育12 h后，CCK-8法測(cè)定細(xì)胞存活率。

1.3.6 枸杞提取物對(duì)細(xì)胞炎癥因子的影響[17]

將密度為1.0×105cells/mL的RAW264.7細(xì)胞接種于培養(yǎng)板，分別設(shè)置對(duì)照組、模型組和干預(yù)組。細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)基，干預(yù)組加入100 μL含樣品的培養(yǎng)液，對(duì)照組和模型組加入100 μL的培養(yǎng)液，預(yù)處理4 h。隨后除對(duì)照組外均加入LPS至終質(zhì)量濃度為1 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用于測(cè)定細(xì)胞因子的含量。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書，測(cè)定不同組別的RAW264.7細(xì)胞分泌細(xì)胞因子：腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin 6，IL-6）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、白細(xì)胞介素-10（interleukin 10，IL-10）的含量。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每個(gè)數(shù)據(jù)均為3次測(cè)定的平均值，使用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析（analysis of variance，ANOVA）（P＜0.05表示差異顯著）。數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用Origin 9.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞果汁的體外抗氧化活性

Trolox等效抗氧化能力（TEAC）測(cè)定法已廣泛應(yīng)用于食品樣品的測(cè)定。不同的抗氧化成分可能通過(guò)不同的機(jī)制起作用，因此，采用三種抗氧化評(píng)價(jià)方法研究枸杞樣品提取物的抗氧化能力，結(jié)果見圖1。由圖1可知，未發(fā)酵枸杞果汁提取物的DPPH·、ABTS+·、FRAP的Trolox等效抗氧化能力（TEAC）值分別為12.46 mmol/L、30.25 mmol/L和15.43mmol/L。與未發(fā)酵枸杞果汁提取物相比，經(jīng)鼠李糖乳桿菌LGG發(fā)酵后，枸杞發(fā)酵果汁提取物抗氧化活性顯著增加，DPPH·、ABTS+·、FRAP的TEAC值分別達(dá)到17.53 mmol/L、42.72 mmol/L和21.12 mmol/L。

圖1 基于ABTS+、DPPH和FRAP方法發(fā)酵前后枸杞果汁提取物的抗氧化活性Fig.1 Antioxidant activities of Goji berry juice extract before and after fermentation based on ABTS+,DPPH,and FRAP methods

DPPH·和ABTS+·是測(cè)定樣品通過(guò)電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)清除自由基的能力，主要?dú)w因于樣品中羥基的總數(shù)和反應(yīng)性。FRAP自由基清除活性取決于樣品在TPTZ存在下將Fe（III）還原為Fe（II）的能力，用于測(cè)量樣品的還原力。多糖、類胡蘿卜素、萜類和酚類化合物（酚酸、類黃酮和單寧）是枸杞中發(fā)現(xiàn)的主要生物活性化合物，這些成分與DPPH·、ABTS+·和FRAP之間存在正相關(guān)關(guān)系[18]。在本研究中，發(fā)酵后的提取物具有更高的抗氧化活性，這與其他發(fā)酵果汁的研究結(jié)果一致，如石榴汁的發(fā)酵提高了基于DPPH和ABTS+測(cè)定的抗氧化活性[19]、植物乳桿菌發(fā)酵桑椹汁具有較強(qiáng)的還原能力[20]、經(jīng)瑞士乳桿菌發(fā)酵的紅棗汁抗氧化能力有顯著提升[21]。這可能是由于乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中的酶（如β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶等）將高分子質(zhì)量的酚類化合物轉(zhuǎn)化為游離酚類物質(zhì)，以及高分子質(zhì)量的多糖降解而暴露出更多的活性基團(tuán)。

2.2 枸杞果汁對(duì)Caco-2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

采用蒸餾水稀釋枸杞果汁提取物的含量分別為0、100 μL/mL、200 μL/mL、400 μL/mL、600 μL/mL、800 μL/mL、1 000 μL/mL，考察枸杞提取物含量對(duì)Caco-2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，結(jié)果見圖2。由圖2可知，樣品中0～600μL/mL的果汁提取物含量對(duì)Caco-2細(xì)胞存活率無(wú)顯著影響（P＞0.05）。樣品中果汁提取物含量800 μL/mL和1 000 μL/mL使Caco-2細(xì)胞存活率顯著下降（P＜0.05）。因此，選用果汁提取物含量600 μL/mL進(jìn)行Caco-2細(xì)胞的下一步實(shí)驗(yàn)。

圖2 發(fā)酵前后枸杞果汁提取物含量對(duì)Caco-2細(xì)胞存活率的影響Fig.2 Effects of Goji berry juice extract addition before and after fermentation on the viability of Caco-2 cell

為建立H2O2誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞氧化損傷模型，首先研究了不同H2O2濃度對(duì)Caco-2細(xì)胞活力的影響，選用100μmol/L、200 μmol/L、300 μmol/L、400 μmol/L和500 μmol/L的H2O2濃度作用Caco-2細(xì)胞，結(jié)果見圖3。由圖3可知，H2O2濃度范圍100～500 μmol/L細(xì)胞活力隨濃度的增加也顯著降低（P＜0.05），其中200 μmol/L H2O2濃度使得細(xì)胞達(dá)到約半數(shù)致死量，該結(jié)果與之前對(duì)H2O2誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞的研究結(jié)果一致[22]。因此，選擇200 μmol/LH2O2建立氧化損傷模型。

圖3 不同濃度的H2O2對(duì)Caco-2細(xì)胞存活率的影響Fig.3 Effects of different H2O2 concentration on the viability of Caco-2 cell

H2O2常常被用作氧化劑，可直接損傷DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等大分子，引起細(xì)胞氧化損傷，導(dǎo)致細(xì)胞損傷或死亡。細(xì)胞抗氧化活性考慮了細(xì)胞內(nèi)的吸收、代謝和分布等多個(gè)方面，能較好地預(yù)測(cè)物質(zhì)在體內(nèi)的抗氧化能力?？疾扈坭教崛∥飳?duì)H2O2誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞氧化損傷的細(xì)胞存活率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 發(fā)酵前后枸杞果汁提取物對(duì)H2O2誘導(dǎo)Caco-2氧化損傷細(xì)胞存活率的影響Fig.4 Effects of Goji berry juice extract before and after fermentation on the viability of oxidative damage cell induced by H2O2

由圖4可知，H2O2處理的模型對(duì)照組細(xì)胞存活率（50.2%）約為空白對(duì)照組的一半，經(jīng)過(guò)未發(fā)酵枸杞果汁和發(fā)酵枸杞果汁提取物處理后，細(xì)胞存活率分別達(dá)到65.0%和79.4%，細(xì)胞存活率分別較未經(jīng)處理的模型細(xì)胞存活率增高1.29倍和1.58倍。LI Z X等[14]用植物乳桿菌（L.plantarum）ATCC14917發(fā)酵蘋果汁的細(xì)胞抗氧化值約為未發(fā)酵蘋果汁的2倍；ZHANG Y等[23]用植物乳桿菌（L.plantarum）J26發(fā)酵提高了藍(lán)莓汁的細(xì)胞抗氧化活性。馮琳[24]用多菌種混合發(fā)酵枸杞汁，以Hep G2細(xì)胞為評(píng)價(jià)模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵枸杞汁可以明顯緩解細(xì)胞內(nèi)氧化損傷。細(xì)胞抗氧化活性的增強(qiáng)同樣是由于乳酸菌代謝會(huì)耗盡酚類等功能化合物的葡萄糖分子，產(chǎn)生羥基數(shù)量更多的游離苷元，或者轉(zhuǎn)換成空間位阻更低的羥基[14]，從而促進(jìn)在枸杞汁發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生一些抗氧化活性更高的代謝物。

2.3 枸杞果汁對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥的抗炎活性

炎癥是宿主對(duì)刺激、損傷和感染的一種正常的保護(hù)性反應(yīng)，是維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)所必需的。過(guò)度的炎癥與慢性疾病相關(guān)，包括癌癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和血管疾病、肥胖、糖尿病等[25]。巨噬細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中起到關(guān)鍵作用，抑制巨噬細(xì)胞活化是一種潛在的改善炎性疾病的方法[26]。脂多糖（LPS）來(lái)源于革蘭氏陰性菌，可與細(xì)胞膜表面toll樣受體（TLR）4結(jié)合，刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，是常見的炎癥誘導(dǎo)因子之一。LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7模型常被用來(lái)模擬炎癥組織，評(píng)價(jià)樣品的體外抗炎活性[27]。

采用蒸餾水稀釋枸杞果汁提取物的含量分別為0、100 μL/mL、200 μL/mL、400 μL/mL、600 μL/mL、800 μL/mL、1 000μL/mL，考察枸杞果汁提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞存活率的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可知，樣品中0～600 μL/mL的果汁提取物含量對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率無(wú)顯著抑制作用（P＞0.05）。樣品中800 μL/mL和1 000 μL/mL果汁提取物含量使RAW264.7細(xì)胞存活率顯著下降（P＜0.05）。因此，選用果汁提取物含量為600 μL/mL進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖5 發(fā)酵前后枸杞果汁提取物含量對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響Fig.5 Effects of Goji berry juice extract content before and after fermentation on the viability of RAW264.7 cell

枸杞果汁提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6、NO及IL-10的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 發(fā)酵前后枸杞果汁提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-α（A）、IL-6（B）、NO（C）及IL-10（D）的影響Fig.6 Effects of Goji berry juice extract before and after fermentation on LPS-induced RAW264.7 cells secreting TNF-α(A),IL-6(B),NO(C)and IL-10(D)

TNF-α和IL-6是活化的巨噬細(xì)胞釋放的主要促炎細(xì)胞因子[28]。TNF-α通過(guò)介導(dǎo)急性炎癥反應(yīng)和慢性炎癥而啟動(dòng)或參與疾病病理。由圖6A可知，與空白對(duì)照組（0.50 ng/mL）相比，LPS處理導(dǎo)致細(xì)胞釋放TNF-α顯著增加（30.12 ng/mL）（P＜0.05）。與模型對(duì)照組相比，C-GOJI和F-GOJI可顯著降低TNF-α的釋放量（分別為26.21 ng/mL、23.14 ng/mL）（P＜0.05），其中F-GOJI組顯著低于C-GOJI組（P＜0.05）。

IL-6是急性期炎癥反應(yīng)的強(qiáng)激活劑，引發(fā)全身和局部炎癥反應(yīng)，過(guò)量的IL-6可誘發(fā)多種慢性炎癥疾病。由圖6B可知，與空白對(duì)照組相比，LPS刺激下模型對(duì)照組IL-6的釋放量顯著增加（P＜0.05）。給予枸杞果汁提取物干預(yù)后，與模型對(duì)照組（610 pg/mL）相比，C-GOJI和F-GOJI可顯著降低IL-6的釋放量（分別為520 pg/mL、450 pg/mL）（P＜0.05），其中F-GOJI組顯著低于C-GOJI組（P＜0.05）。結(jié)果表明，枸杞果汁提取物可以通過(guò)降低TNF-α和IL-6分泌量發(fā)揮抗炎特性，發(fā)酵枸杞果汁提取物的效果高于未發(fā)酵枸杞果汁提取物。

NO是炎癥反應(yīng)的標(biāo)志。它由誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）等通過(guò)L-精氨酸途徑合成。病理?xiàng)l件下，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量的NO，并在慢性感染、炎癥中發(fā)揮雙重作用。減少NO的產(chǎn)生是治療多種炎癥性疾病的有效策略。由圖6C可知，與空白對(duì)照組（1.53 μmol/L）相比，LPS處理顯著增加了NO的產(chǎn)生（15.57 μmol/L）（P＜0.05），這可能是因?yàn)長(zhǎng)PS激活巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)局部炎癥和抗體的產(chǎn)生，并影響體內(nèi)iNOS的表達(dá)，從而影響NO的產(chǎn)生。當(dāng)細(xì)胞用C-GOJI和F-GOJI處理時(shí)LPS誘導(dǎo)的NO生成的增加被顯著抑制（分別為12.41 μmol/L、10.72 μmol/L）（P＜0.05），且F-GOJI的抑制效果更好。結(jié)果表明，枸杞果汁提取物能夠通過(guò)抑制NO分泌發(fā)揮抗炎作用，發(fā)酵后的枸杞果汁作用效果高于未發(fā)酵的枸杞果汁。

RAW264.7細(xì)胞在不同的狀態(tài)下具有不同的功能。第一種是促炎（通常是激活的巨噬細(xì)胞）功能（M1型），第二種是抗炎（交替激活的巨噬細(xì)胞）功能（M2型）。M1型巨噬細(xì)胞產(chǎn)生高水平的促炎介質(zhì)，包括IL-6和TNF-α，而M2型巨噬細(xì)胞產(chǎn)生高水平的抗炎介質(zhì)，如IL-10。IL-10是一種有效的抗炎因子，它通過(guò)抑制各種促炎介質(zhì)來(lái)控制炎癥過(guò)程[29]。由圖6D可知，與空白對(duì)照組相比，LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞上清中IL-10水平顯著增加，表明細(xì)胞有M2型巨噬細(xì)胞特征。與模型組相比，各組樣品對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌IL-10沒有促進(jìn)作用，說(shuō)明枸杞果汁和發(fā)酵枸杞果汁均不能通過(guò)促進(jìn)IL-10的分泌發(fā)揮抗炎作用。

許多研究表明，益生菌及其活性產(chǎn)物具有抗炎作用。LGG減輕LPS誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29炎癥反應(yīng)[30]，LGG分泌的可溶性蛋白P40下調(diào)了參與先天免疫的促炎細(xì)胞因子，包括巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α和IL-6[31]。大腸桿菌（Escherichia coli）Nissle 1917分泌的胞外囊泡刺激RAW264.7細(xì)胞使IL-10的產(chǎn)生增加到更高的水平，IL-10可強(qiáng)烈抑制細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[32]。漿果或漿果化合物的抗炎特性已被證實(shí)，一些研究中發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵漿果能更有效的抑制炎癥。KANG Y F等[33]將枸杞汁與植物乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、嗜熱鏈球菌共發(fā)酵，發(fā)酵后的枸杞汁中多糖、氨基酸、游離酚和類黃酮含量增加，抗炎作用提升。YOUNU J等[34]從諾麗果發(fā)酵果汁中分離得到新的化合物2和7顯示出抗炎活性。藍(lán)莓和黑莓發(fā)酵飲料中的花青素和原花青素通過(guò)NF-κB介導(dǎo)途徑降低了LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)[35]。在RAW264.7細(xì)胞模型中，枸杞中的一些酚酸酰胺對(duì)NO的產(chǎn)生表現(xiàn)出顯著的抑制作用，特別是咖啡酸衍生物，具有良好的抗炎性能和功能成分[36]。東莨菪素是枸杞中的一種香豆素，在自身免疫性腦脊髓炎小鼠模型中，東莨菪素治療可顯著減少中樞的炎癥。益生菌發(fā)酵將促進(jìn)枸杞中復(fù)雜的植物化學(xué)分子降解為更小的生物活性成分，有利于抑制炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而抑制炎癥反應(yīng)[37-38]。

3 結(jié)論

本研究選用鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）LGG對(duì)枸杞果汁進(jìn)行發(fā)酵，探討發(fā)酵對(duì)枸杞果汁體外抗氧化、抗炎活性的影響。研究表明，枸杞果汁經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后抗氧化和抗炎特性有顯著提升。發(fā)酵后的枸杞果汁具有更強(qiáng)的清除DPPH、ABTS+自由基的作用和鐵離子還原能力、改善氧化損傷細(xì)胞存活力的特性。與未發(fā)酵枸杞果汁相比，發(fā)酵枸杞果汁可以通過(guò)更強(qiáng)的抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞RAW264.7分泌TNF-α、IL-6和NO來(lái)發(fā)揮抗炎功效，表明發(fā)酵枸杞果汁在預(yù)防或減輕氧化應(yīng)激和炎癥方面具有更好的潛力。本研究可為枸杞的抗氧化和抗炎活性帶來(lái)了一些科學(xué)見解，拓展枸杞的加工利用方式，為枸杞開發(fā)健康新產(chǎn)品提供依據(jù)。