孔志華，郭俊，王月麗，李小燕，張曉萍，陳麗

馬凡綜合征由法國(guó)醫(yī)師Antonie Marfan 于1896年首次報(bào)道，是一種常染色體顯性遺傳??；無(wú)種族特異性[1]。其可累及心血管、眼部及骨骼等多個(gè)系統(tǒng)。主要臨床表現(xiàn)為蜘蛛指/趾、脊柱側(cè)彎、主動(dòng)脈病變、瓣膜病變、晶狀體脫位等[2]。人原纖維蛋白1基因（FBN1）是目前已經(jīng)明確的馬凡綜合征的致病基因，包含66 個(gè)外顯子，位于染色體15q21.1 區(qū)，編碼原纖維蛋白-1[3]。原纖維蛋白-1 通過(guò)參與形成微纖維，在維持細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)定性中起著重要作用[4]。目 前 為 止，ClinVar（https://www.clinicalgenome.org/data-sharing/clinvar/）數(shù)據(jù)庫(kù)中包含超過(guò)2 000 種馬凡綜合征相關(guān)的FBN1突變，研究表明FBN1突變無(wú)明顯熱點(diǎn)突變[5-6]。近期研究顯示，患者攜帶的突變類(lèi)型與臨床表型有一定關(guān)聯(lián)，通過(guò)分析馬凡綜合征患者的FBN1基因突變，有助于輔助臨床診斷及治療決策；《遺傳性胸主動(dòng)脈瘤/夾層基因檢測(cè)及臨床診療專家共識(shí)》闡述了基因檢測(cè)在遺傳性胸主動(dòng)脈病診斷及篩查中的作用，并明確針對(duì)各種類(lèi)型胸主動(dòng)脈病患者提出醫(yī)療和生活方式管理方面的建議，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)高危人群的早診斷及早預(yù)防[7]。本研究通過(guò)對(duì)1 例臨床表現(xiàn)為主動(dòng)脈夾層的馬凡綜合征患者進(jìn)行全外顯子測(cè)序，經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析，鑒定出一疑似致病突變，并在家系內(nèi)對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，探討了該馬凡綜合征家系的致病基因及致病突變，并為該家系相關(guān)成員的臨床診斷及進(jìn)一步診療提供了理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2019 年6 月因主動(dòng)脈夾層于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院心外科就診的1 例26 歲女性馬凡綜合征患者（先證者）及其家屬為研究對(duì)象，患者家系圖見(jiàn)圖1。經(jīng)影像學(xué)檢查（超聲心動(dòng)圖、主動(dòng)脈CT 血管造影、正位X 線胸片及彩色多普勒血管超聲）及相關(guān)輔助檢查，并依據(jù)2017 年中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)心血管外科分會(huì)發(fā)布的主動(dòng)脈夾層診斷與治療規(guī)范中國(guó)專家共識(shí)[8]和歐洲心臟病學(xué)會(huì)發(fā)布的2014 年主動(dòng)脈疾病診療指南診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]，該患者臨床診斷為馬凡綜合征。本研究遵循《赫爾辛基宣言》，通過(guò)了首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)函編號(hào)：2016017），患者及家系成員均簽署了知情同意書(shū)。

圖1 患者家系圖

1.2 方法

1.2.1基因組DNA 提取

采集先證者及所有入組家系成員外周血各2 ml[乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝]；每個(gè)樣本取200 μl 血樣使用全血DNA 提取試劑盒（康為世紀(jì)，江蘇泰州）提取基因組DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)DNA 提取質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2全外顯子測(cè)序

基因組DNA 經(jīng)過(guò)質(zhì)控后，取1 μg 用于文庫(kù)構(gòu)建；文庫(kù)構(gòu)建使用NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina（NEB 公司，美國(guó)），外顯子區(qū)域富集使用Agilent SureSelect Human All Exon V6 試劑盒（安捷倫公司，美國(guó)），文庫(kù)構(gòu)建完成后，先使用Qubit 2.0 進(jìn)行初步定量，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量，以保證文庫(kù)質(zhì)量。使用Novaseq 進(jìn)行高通量測(cè)序，將通過(guò)質(zhì)控的測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)至人類(lèi)參考基因組（GRCh37/hg19），平均測(cè)序深度大于200 Ⅹ，檢測(cè)樣本的變異信息。利用ANNOVAR 對(duì)變異信息進(jìn)行注釋，包括在dbSNP 數(shù)據(jù)庫(kù)、千人基因組、本團(tuán)隊(duì)內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù)等數(shù)據(jù)庫(kù)的頻率信息，同時(shí)對(duì)變異的位置信息、類(lèi)型、保守性等進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.3Sanger 測(cè)序驗(yàn)證

利用ABI 3730xl 測(cè)序儀（Applied Biosystems 公司，美國(guó)）對(duì)高通量測(cè)序得到的候選位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。PCR擴(kuò)增使用引物如下：正向：GGGCAATGGTCAATTCTA，反向：GTGTCTATTTCTGATGGCTTAT，測(cè)序使用正向引物。

1.2.4功能預(yù)測(cè)及變異的臨床注釋

使用ANNOVAR 軟件包Mutation taster（http://www.mutationtaster.org/）、phyloP46way_placenta、Swiss-model（https://swissmodel.expasy.org）等對(duì)變異位點(diǎn)進(jìn)行功能及保守性分析；根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（ACMG）遺傳變異分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)與指南及中國(guó)2017 版《遺傳變異分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)與指南》對(duì)基因變異進(jìn)行分類(lèi)[10]。

2 結(jié)果

2.1 臨床特點(diǎn)

先證者（Ⅲ-2）為26 歲女性，主訴“體檢發(fā)現(xiàn)降主動(dòng)脈夾層2 個(gè)月”，無(wú)明顯胸、背及腹部疼痛，于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院診斷為主動(dòng)脈夾層。入院查體：脈搏70 次/min，血壓125/85 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），呼吸15 次/min，體溫37 ℃，身高170 cm，體重53 kg，身材瘦長(zhǎng)、蜘蛛指、漏斗胸、關(guān)節(jié)活動(dòng)度大、高度近視并伴有皮紋等馬凡綜合征相關(guān)體征與癥狀[1]。其母親（Ⅱ-2）及姨媽（Ⅱ-1）因急性主動(dòng)脈夾層去世，姨媽（Ⅱ-3）因主動(dòng)脈夾層（A 型）/動(dòng)脈瘤行主動(dòng)脈置換術(shù)；姐姐（Ⅲ-1）及表弟（Ⅲ-4）超聲心動(dòng)圖結(jié)果提示主動(dòng)脈根部增寬；其余家族成員超聲心動(dòng)圖未見(jiàn)明顯異常。

先證者超聲心動(dòng)圖提示主動(dòng)脈竇部增寬39 mm，三尖瓣少量反流，各心腔內(nèi)徑處于正常范圍，各室壁厚度及運(yùn)動(dòng)正常（圖2）。主動(dòng)脈CT 血管造影提示主動(dòng)脈夾層，累及右側(cè)腎動(dòng)脈及髂總動(dòng)脈（圖3、4）。診斷為主動(dòng)脈夾層形成、胸主動(dòng)脈瘤。

圖2 先證者超聲心動(dòng)圖結(jié)果

圖3 先證者主動(dòng)脈CT 成像圖

圖4 先證者主動(dòng)脈CT 二維成像圖

患者后期接受全胸、腹主動(dòng)脈置換術(shù)，預(yù)后較好。

2.2 全外顯子測(cè)序結(jié)果

先證者全外顯子測(cè)序共得到13.83 GB 有效測(cè)序數(shù)據(jù)，與參考基因組比對(duì)后得到14 909 個(gè)插入/缺失多態(tài)性，126 539 個(gè)單核苷酸多態(tài)性；依據(jù)《遺傳性胸主動(dòng)脈瘤/夾層基因檢測(cè)及臨床診療專家共識(shí)》建議，篩選與綜合征型胸主動(dòng)脈瘤/夾層相關(guān)的FBN1、TGFBR1、TGFBR2、SMAD3、TGFB2、TGFB3、SMAD2共7 個(gè)基因的變異位點(diǎn)[7]，檢測(cè)到FBN1基因一雜合變異：FBN1，NM_000138.5：c.7412delC，位于基因第60 號(hào)外顯子上，為移碼突變（圖5）。其余6 個(gè)主動(dòng)脈疾病相關(guān)基因未檢出變異位點(diǎn)。

圖5 變異位點(diǎn)c.7412delC 在FBN1 基因上位置示意圖

2.3 Sanger 測(cè)序結(jié)果

先證者的姨媽（Ⅱ-3）、姐姐（Ⅲ-1）、表弟（Ⅲ-4）均檢測(cè)出與先證者（Ⅲ-2）相同的移碼突變（FBN1，c.7412delC），而該家系中無(wú)臨床表型的健康者，包括先證者姨媽（Ⅱ-4）、弟弟（Ⅲ-3）、兩位表弟（Ⅲ-5、Ⅲ-7）、表妹（Ⅲ-6）及先證者之子（Ⅳ-2）及其姐姐之女（Ⅳ-1）均未攜帶該變異位點(diǎn)（圖6）。

圖6 Sanger 測(cè)序結(jié)果

2.4 變異位點(diǎn)功能預(yù)測(cè)及臨床注釋結(jié)果

該位點(diǎn)在dbSNP、ExAC、ESP6500 等數(shù)據(jù)庫(kù)中均未見(jiàn)頻率報(bào)道，在正常人群中發(fā)生的概率極低，提示該變異不是常見(jiàn)良性變異。生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該位點(diǎn)為第60 號(hào)外顯子區(qū)域單個(gè)堿基的缺失，該變異導(dǎo)致第2 471 位以后的氨基酸發(fā)生了移碼變異，造成翻譯的提前終止，組成蛋白質(zhì)的氨基酸為2 681 個(gè)（野生型的蛋白質(zhì)由2 871 個(gè)氨基酸組成），進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的功能；多序列比對(duì)結(jié)果顯示，F(xiàn)BN1 蛋白第2 471 位點(diǎn)脯氨酸在人、黑猩猩、恒河猴、鼠中高度保守，提示該變異可能具有致病性；在該家系中，該位點(diǎn)與臨床表型共分離。在ClinVar 數(shù)據(jù)庫(kù)中，有一例來(lái)源于馬凡綜合征患者的該位點(diǎn)的報(bào)道，對(duì)該位點(diǎn)的注釋為致病變異。依據(jù)ACMG 指南，該位點(diǎn)為致病變異[致病變異分類(lèi)非常強(qiáng)（PVS1）+中等證據(jù)2（PM2）+輔助證據(jù)1（PP1）]。

3 討論

馬凡綜合征是一種常染色體顯性遺傳病，F(xiàn)BN1基因是唯一的致病基因[11]。馬凡綜合征的診斷標(biāo)準(zhǔn)一直在演進(jìn)，1988 年柏林方案主要根據(jù)臨床表現(xiàn)，到1996 年Ghent 方案，直至最新的2010 年修訂版Ghent 方案，F(xiàn)BN1基因突變?cè)诩膊〉脑\斷中越來(lái)越重要。修訂版Ghent 方案提出，無(wú)家族史患者若主動(dòng)脈根部直徑Z 值≥2，并且合并晶狀體脫位及FBN1基因突變，系統(tǒng)評(píng)分＞7 等三項(xiàng)中的一項(xiàng)；或晶狀體脫位合并FBN1基因突變并主動(dòng)脈病變，即可臨床診斷為馬凡綜合征[12]。本研究先證者體征包括身高過(guò)高、蜘蛛指、漏斗胸及關(guān)節(jié)活動(dòng)過(guò)度；超聲心動(dòng)圖提示主動(dòng)脈根部增寬，A 型主動(dòng)脈夾層，具有多項(xiàng)馬凡綜合征的臨床表現(xiàn)，臨床診斷為馬凡綜合征患者，家族中多位成員有胸主動(dòng)脈夾層史并伴有馬凡綜合征體征，遂利用基因檢測(cè)技術(shù)探索該家系的致病原因。

FBN1基因位于15q21.1，包含66 個(gè)外顯子，編碼2 871 個(gè)氨基酸。目前已經(jīng)報(bào)道的與馬凡綜合征患者相關(guān)的FBN1突變已超過(guò)2 000 種[6]。FBN1基因無(wú)明顯熱點(diǎn)突變，據(jù)報(bào)道約12%的突變位點(diǎn)重復(fù)出現(xiàn)；編碼區(qū)突變約占總突變的80%，非編碼區(qū)突變約占總突變的20%。常見(jiàn)編碼區(qū)突變有移碼突變、錯(cuò)義突變和無(wú)義突變，移碼突變占FBN1突變的18%左右[5]。近年來(lái)有多項(xiàng)研究在逐步勾勒馬凡綜合征基因型與表型的關(guān)系。Faivre 等[13]發(fā)現(xiàn)半胱氨酸錯(cuò)義突變與晶狀體異位有關(guān)；Aoyama 等[11]在1995 年的一項(xiàng)研究中已經(jīng)證明，導(dǎo)致原纖維蛋白-1蛋白單倍劑量不足的突變（HI-FBN1）與無(wú)事件生存期縮短和更嚴(yán)重的心血管并發(fā)癥有關(guān)。此外，發(fā)生心血管事件的馬凡綜合征患者攜帶HI-FBN1突變頻率更高[14]。Franken 等[15]證實(shí)，相比于DNFBN1（顯性負(fù)效應(yīng)）的患者，攜帶HI-FBN1突變的患者主動(dòng)脈夾層和死亡的風(fēng)險(xiǎn)更高。2019 年，貢?shū)Q等[16]對(duì)300 例中國(guó)馬凡綜合征患者的基因型與表型進(jìn)行關(guān)聯(lián)研究，發(fā)現(xiàn)主動(dòng)脈夾層患者相較于主動(dòng)脈根部瘤患者，攜帶移碼突變頻率更高（17% vs.4%，P=0.017）。隨著越來(lái)越多基因型與臨床表型之間的關(guān)系被揭示，利用基因檢測(cè)技術(shù)在高危人群癥狀完全表現(xiàn)之前進(jìn)行早期篩查，有助于疾病的早期診斷，對(duì)治療方案制定有指導(dǎo)作用。

本研究通過(guò)對(duì)疑似馬凡綜合征的家系行基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)先證者及家系內(nèi)存在相似臨床表現(xiàn)者FBN1基因均存在相同移碼突變（c.7412delC），該移碼突變可能會(huì)造成編碼蛋白的結(jié)構(gòu)及功能改變，從而導(dǎo)致疾病發(fā)生。通過(guò)檢索公共數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)ClinVar 數(shù)據(jù)庫(kù)中存在該變異位點(diǎn)的報(bào)道；dbSNP、ExAC、ESP6500、GnomAD 以及本團(tuán)隊(duì)內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù)（800 例孤立性主動(dòng)脈瘤患者全外顯子測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)）均無(wú)該變異位點(diǎn)的頻率報(bào)道；同時(shí)該變異存在家系共分離特點(diǎn)。依據(jù)ACMG 指南，該變異分級(jí)為致病變異。因此，根據(jù)該家系的臨床表現(xiàn)及FBN1變異特點(diǎn)，并依據(jù)2010 年的新Ghent 診斷標(biāo)準(zhǔn)，先證者及其家系內(nèi)攜帶該變異的成員均可確診為馬凡綜合征；既往文獻(xiàn)報(bào)道，攜帶移碼變異的患者，更容易發(fā)生主動(dòng)脈夾層，該先證者及家系內(nèi)多位成年患者均發(fā)生主動(dòng)脈夾層，提示該家系主動(dòng)脈夾層高發(fā)，與以往研究報(bào)道一致。依據(jù)本研究的分子檢測(cè)結(jié)果及相關(guān)家族史，可幫助臨床醫(yī)師對(duì)家系相關(guān)成員尤其是未成年患者進(jìn)行隨訪，并合理選擇治療時(shí)機(jī)和方法。對(duì)攜帶變異的家系成員血壓、血脂、血糖等心血管疾病危險(xiǎn)因素的管理，有助于延緩急性事件的發(fā)生并改善預(yù)后[17]。樣本的組織學(xué)檢測(cè)對(duì)于疾病的病理特征分析有重要意義，本研究未獲得相應(yīng)的組織學(xué)樣本并進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)，有所缺陷，后續(xù)相關(guān)研究應(yīng)重視組織學(xué)樣本的收集。

本研究為該馬凡綜合征家系提供了分子診斷，為臨床診斷和后續(xù)治療選擇提供了遺傳學(xué)依據(jù)，進(jìn)一步豐富了中國(guó)人群的馬凡綜合征遺傳圖譜。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突