梁曉冬，談桂其，李春紅，鄧新華 ，梁景耀，張錫寶

細(xì)胞間隙連接通訊(gap junctional intercellular communication，GJIC)是多細(xì)胞生物中常見(jiàn)的通訊方式。GJIC通過(guò)連接蛋白 (connexins，Cx) 組成的間隙連接 (gap junction，GJ) 通道，以實(shí)現(xiàn)連接相鄰細(xì)胞作用[1]。最近的研究表明，Cx43 參與了生物體內(nèi)由細(xì)胞外囊泡、納米管或 GJ 介導(dǎo)的細(xì)胞交流過(guò)程[2]。

全反式維A酸(all-trans retinoic acid，RA)的作用包括調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和免疫系統(tǒng)、抗皮脂分泌、抗炎等，對(duì)銀屑病患者具有重要作用[3]。有學(xué)者[4]發(fā)現(xiàn)維A酸類藥物作為抗腫瘤藥物起抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力，可以增強(qiáng)GJIC的功能， 但RA 作為GJIC 的一種典型增強(qiáng)劑對(duì)銀屑病的作用和機(jī)制并未引起太多關(guān)注。本課題組最近的研究表明，IL-22 通過(guò)激活 JNK 信號(hào)通路，顯著下調(diào) Cx43 表達(dá)并降低 HaCaT 細(xì)胞的 GJIC 功能[5]。本研究旨在通過(guò)探討 RA 是否影響 HaCaT 細(xì)胞中 IL-22 誘導(dǎo)的 Cx43 表達(dá)下調(diào)和 GJIC 降低過(guò)程，以及是否通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 信號(hào)通路介導(dǎo)，從而更好地了解 RA 對(duì)銀屑病的分子機(jī)制過(guò)程。

1 材料與方法

1.1HaCaT 細(xì)胞培養(yǎng)和處理 HaCaT 細(xì)胞(Sigma,Shanghai,China)用 Dulbecco′s 改良 Eagle′s 培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為 37°C 和 5% CO2的加濕培養(yǎng)箱。第一部分：對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件HaCaT 細(xì)胞，用 50 μg/L IL-22 (PeproTech Inc., Rocky Hill, NJ, USA) 誘導(dǎo)處理，再用 10 μmol/L RA(Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，USA)處理 24 h[5]。第二部分： 分別通過(guò)用 5 μmol/L MK-2206(Selleckchem, Houston, TX, USA)和10 μmol/L RA，或 1 μmol/L SCH772984(MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA)和10 μmol/L RA處理細(xì)胞24 h，來(lái)抑制 AKT 或 ERK1/2 信號(hào)通路 。

1.3蛋白印跡法(Western blot) 經(jīng)各組處理后，從 HaCaT 細(xì)胞中提取總蛋白后裂解，并測(cè)量每個(gè)裂解物樣品中總蛋白的濃度。將等量的蛋白質(zhì)加載到 10% SDS-PAGE 凝膠中，并在電泳后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜 (Invitrogen, CA, USA)，室溫封閉 2 h，然后與以下一抗， Cx43、JNK、p-JNK、AKT、p-AKT、ERK1/2、p-ERK1/2(Cell Signaling Technology，MA，USA)、p38(Boster Biological Technology，武漢，中國(guó))、p-p38(Santa Cruz，CA，USA)、 GAPDH(Transgene，Paris，F(xiàn)rance)孵育過(guò)夜。GAPDH 作為對(duì)照控制。將膜與 HRP 偶聯(lián)的二抗(Santa Cruz，CA，USA)孵育。使用 ECL 化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(Amersham Pharmacia Biotech，NJ，USA)開(kāi)發(fā)免疫反應(yīng)性印跡。所有結(jié)果代表3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。最后通過(guò) ImageJ 軟件 (NIH, MD, USA) 進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

2.1RA 可抑制IL-22 誘導(dǎo)的 HaCaT 細(xì)胞GJIC功能降低過(guò)程 在用不同濃度的 RA(0、1、5、10、20 μmol/L)處理 24 h后， SLDT測(cè)定顯示 RA 以濃度依賴的方式逐漸增強(qiáng) HaCaT 細(xì)胞中的 GJIC功能(圖1)。用 10 μmol/L RA 預(yù)處理 24 h，有效地抑制了 IL-22 誘導(dǎo)的 HaCaT 細(xì)胞中 Cx43 表達(dá)降低過(guò)程，這表明 GJIC 可能受到相同趨勢(shì)的影響(圖1)。

Nore:**P <0.01, ***P <0.001, compared with untreated HaCaT cells, Scale bar= 31.25 mm.Images show GJIC by the scrape-loading dye-transfer method in HaCaT cells treated with various concentrations of RA (0, 1, 5, 10, or 20 μmol/L) for 24 h; The histograms show a quantitative analysis of the distance in Fig.1a圖1 RA 對(duì) HaCaT 細(xì)胞中 GJIC 的影響Fig.1 The effect of RA on GJIC in HaCaT cells

2.2RA可恢復(fù) IL-22 誘導(dǎo)的 HaCaT 細(xì)胞中 Cx43 表達(dá)的降低，如圖2所示，Western blot顯示RA有效地恢復(fù)了HaCaT中IL-22誘導(dǎo)的Cx43弱表達(dá)水平。然而，RA 并未降低 由IL-22 誘導(dǎo)的 p-JNK 表達(dá)增加。這些結(jié)果表明，RA 可減少IL-22 誘導(dǎo)的 HaCaT 細(xì)胞中 Cx43 表達(dá)的降低，但與抑制 IL-22 激活的 JNK 信號(hào)通路無(wú)關(guān)。

Note:**P <0.01. Western blot shows the protein expression levels of Cx43 and p-JNK in HaCaT cells pretreated with 10 μmol/L RA 24 h before stimulation with 50 μg/L IL-22; The histograms show a quantitative analysis of protein expression levels in Fig.2a圖2 RA 對(duì)IL-22 誘導(dǎo)的HaCaT 細(xì)胞中Cx43 和 p-JNK 表達(dá)的影響Fig.2 Effects of RA on expression of Cx43 and p-JNK in IL-22-induced HaCaT cells

如圖3所示，在用 IL-22 處理后，Cx43、p-AKT 和 p-ERK1/2的表達(dá)顯著降低， p-p38的表達(dá)無(wú)顯著改變。RA 預(yù)處理部分恢復(fù)了 IL-22 誘導(dǎo)的 Cx43、p-AKT 和 p-ERK1/2 表達(dá)的降低，表明 RA 可能通過(guò)激活 AKT 和 ERK1/2 信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)恢復(fù) IL-22 誘導(dǎo)的 Cx43 表達(dá)下調(diào)。

Note:**P<0.01, ***P<0.001.Western blot shows the protein expression levels of Cx43, p-AKT, p-ERK1/2 and p-p38 are shown in HaCaT cells treated with 10 μmol/L RA 24 h and/or before stimulation with 50 μg/L IL-22;The histograms show a quantitative analysis of protein expression levels in Fig.3a圖3 RA對(duì)IL-22誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞AKT、ERK1/2和p38信號(hào)通路的影響Fig.3 Effects of RA on the IL-22-induced AKT, ERK1/2 and p38 signaling pathways in HaCaT cells

2.3RA 通過(guò)激活 AKT 和 ERK1/2 信號(hào)通路恢復(fù) IL-22 誘導(dǎo)的 Cx43 表達(dá)下調(diào)和 GJIC 功能降低 用AKT 特異性抑制劑MK-2206預(yù)處理細(xì)胞后，顯著阻斷了RA恢復(fù)IL-22誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞中p-AKT和Cx43表達(dá)上調(diào)的影響。類似地，用ERK1/2 特異性抑制劑SCH772984預(yù)處理細(xì)胞后，顯著阻斷了RA抑制IL-22誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞中p-ERK1/2和Cx43表達(dá)上調(diào)的影響。此外，用 MK-2206 和 SCH772984 預(yù)處理分別有效地降低了 RA 恢復(fù) IL-22 誘導(dǎo)的 HaCaT 細(xì)胞中 GJIC 增加的影響。這些結(jié)果表明RA可以通過(guò)激活A(yù)KT和ERK1 / 2信號(hào)通路，以抑制IL-22誘導(dǎo)引起的Cx43表達(dá)下調(diào)和GJIC功能降低過(guò)程,見(jiàn)圖4～5。

Note:**P<0.01, ***P<0.001， Scale bar=31.25 mm.Western blot shows the protein expression levels of Cx43 and p-AKT in HaCaT cells treated with 10 μmol/L RA, or RA and 5 μmol/L MK-2206 before stimulation with 50 μg/L IL-22;～ The histograms show a quantitative analysis of protein expression levels in Fig.4a; Images show GJIC in HaCaT cells treated with 10 μmol/L RA, or RA and 5 μmol/L MK-2206 before stimulation with 50 μg/L IL-22;The histograms show a quantitative analysis of the distance in Fig.4d圖4 RA 對(duì)IL-22 誘導(dǎo)的HaCaT 細(xì)胞中Cx43、p-AKT 表達(dá)和 GJIC 的影響Fig.4 Effects of RA on IL-22-induced Cx43, p-AKT expression and GJIC in HaCaT cells

Note:*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001， Scale bar= 31.25 mm. Western blot shows the protein expression levels of Cx43 and p-ERK1/2 in HaCaT cells treated with 10 μmol/L RA, or RA and 1 μmol/L SCH772984 before stimulation with 50 μg/L IL-22;～ The histograms show a quantitative analysis of protein expression levels in 5a; Images show GJIC in HaCaT cells treated with 10 μmol/L RA, or RA and 1 μmol/L SCH772984 before stimulation with 50 μg/L IL-22; The histograms show a quantitative analysis of the distance in Fig.5d圖5 RA 對(duì) IL-22 誘導(dǎo)的HaCaT 細(xì)胞中Cx43、p-ERK1/2 表達(dá)和 GJIC 的影響Fig.5 Effects of RA on IL-22-induced Cx43, p-ERK1/2 expression and GJIC in HaCaT cells

3 討論

銀屑病是一種常見(jiàn)的慢性炎癥性皮膚病[6]。角化細(xì)胞的分化和免疫系統(tǒng)的激活是銀屑病的特征[7]。IL-22可被先天或后天免疫系統(tǒng)激活，IL-22通常在T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的疾病中表達(dá)升高，如銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和間質(zhì)性肺病等[8]。IL-22參與多種信號(hào)通路，在銀屑病的發(fā)病、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮重要作用[9-10]。

IL-22 傳統(tǒng)上被認(rèn)為是 Th17 的細(xì)胞因子。然而，淋巴細(xì)胞能夠分泌 IL-22，例如 Th22、Th1、γδ T和自然殺傷細(xì)胞[11]。IL-22是一種重要的細(xì)胞因子，介導(dǎo)白細(xì)胞和上皮細(xì)胞之間的聯(lián)系，并參與多種免疫介導(dǎo)的炎癥性疾病的病理生理過(guò)程，如銀屑病、腸道炎癥和癌癥[8]。有研究[12]表明，銀屑病患者皮損中IL-22的表達(dá)水平明顯高于健康個(gè)體。在同一銀屑病患者中，從病變皮損中分離的 T 細(xì)胞產(chǎn)生的 IL-22 水平高于從外周血中分離T 細(xì)胞產(chǎn)生的水平[13]。血漿中 IL-22 濃度與斑塊型銀屑病的疾病活動(dòng)度呈顯著正相關(guān)。 IL-22 主要作用于角質(zhì)形成細(xì)胞，以介導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖并抑制其終末分化，導(dǎo)致棘層肥厚、顆粒不足和角化過(guò)度特征的銀屑病樣外觀[14]。筆者先前的研究表明[5]，IL-22 在 HaCaT 細(xì)胞中下調(diào) Cx43表達(dá)并降低 GJIC功能，并通過(guò)激活 JNK 信號(hào)通路在小鼠模型中誘導(dǎo)銀屑病樣變化。本研究中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)RA 通過(guò)激活 AKT 和 ERK1/2 信號(hào)通路來(lái)恢復(fù) IL-22 誘導(dǎo)的 HaCaT 細(xì)胞中 Cx43 表達(dá)下調(diào)和 GJIC降低，而與 JNK 和 p38 信號(hào)通路無(wú)關(guān)。

RA 已被證明可以上調(diào)多種不同細(xì)胞類型[15-16]中的 Cx43 表達(dá)和 GJIC功能，與筆者在 HaCaT 細(xì)胞中的研究一致，盡管在 NTera2/克隆 D1 細(xì)胞[17]和 p19 胚胎癌細(xì)胞中存在一些矛盾的結(jié)果[18]。除了增加 Cx43 表達(dá)水平外，RA 通過(guò)增強(qiáng)蛋白磷酸酶 2A 和 Cx43 之間的相互作用促進(jìn) Cx43 的去磷酸化，從而導(dǎo)致原代人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中 GJIC 功能的增加[4]。特定位點(diǎn)的磷酸化[16]以及 Cx43 的泛素化[19]已被發(fā)現(xiàn)可降低 GJIC功能。盡管RA 對(duì) Cx43 泛素化的直接影響尚未被報(bào)道，但在原發(fā)性急性早幼粒細(xì)胞白血病中，RA 治療會(huì)增加泛素樣修飾激活酶 3 的降解，該酶控制著細(xì)胞周期進(jìn)程中許多重要蛋白質(zhì)的降解[20]。目前RA已被充分證明不僅能抑制細(xì)胞增殖和遷移，而且在通過(guò) Cx43 介導(dǎo)的 GJIC 增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)抗癌治療的敏感性方面發(fā)揮重要作用[21-22]。

眾所周知，IL-22 通過(guò)磷酸化 AKT、p38、JNK、ERK1/2、STAT1、STAT 3 和 STAT 5 中的絲氨酸和酪氨酸殘基并與 IL-22 受體 (IL-22R，由 IL-10Rβ1 和 IL-22R1 鏈組成) 結(jié)合來(lái)觸發(fā)多個(gè)細(xì)胞內(nèi)途徑[23]。RA 強(qiáng)烈誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞亞群中IL -22 結(jié)合蛋白 (IL-22BP) 的表達(dá)，其可在體外和體內(nèi)特異性抑制和結(jié)合 IL-22[8]。之前與 IL-22 的類似研究表明，RA 的治療可激活多種信號(hào)通路，包括 AKT 和 MAPK[24]。RA通過(guò)RARα介導(dǎo)的PI3K/AKT和ERK信號(hào)通路，顯著降低血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移[25]。在本研究中，IL-22 通過(guò)激活HaCaT 細(xì)胞中的JNK 和抑制AKT 和 ERK 信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)下調(diào) Cx43 的表達(dá)并降低 GJIC功能。相反，RA 通過(guò)激活 AKT 和 ERK 信號(hào)通路而不抑制 JNK 信號(hào)通路來(lái)逆轉(zhuǎn)這種調(diào)節(jié)。Tacheau等[26]發(fā)現(xiàn) p38 和 PI3K/AKT 通路的激活協(xié)同介導(dǎo) TGF-β1，可誘導(dǎo)的正常鼠乳腺上皮細(xì)胞中 Cx43 表達(dá)和 GJIC 的增加。激活的 PI3K/AKT信號(hào)通路增加了 β-連環(huán)蛋白的核積累和 β-連環(huán)蛋白與 Cx43 啟動(dòng)子的結(jié)合活性，進(jìn)而上調(diào)了骨細(xì)胞中 Cx43 的表達(dá)和 GJIC功能[27]。PI3K 催化亞基的組成型活性形式的表達(dá)，增加了大鼠肝上皮 T51B 細(xì)胞中的 GJIC功能，而成骨細(xì)胞系中PI3K 信號(hào)傳導(dǎo)的藥理學(xué)抑制，不僅消除了細(xì)胞通訊[28]并顯著降低了 Cx43 mRNA 和蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)表達(dá)[29]。此外，振蕩引起的 GJIC 增加取決于骨細(xì)胞中AKT 信號(hào)的激活，但與 Cx43 mRNA 或蛋白質(zhì)水平的改變無(wú)關(guān)[30]。然而Zhou等[31]的一項(xiàng)研究表明，激活 PI3K/AKT 信號(hào)可顯著降低大鼠海馬腦缺血再灌注損傷后的 Cx43蛋白表達(dá)和 GJIC功能。AKT信號(hào) 激活對(duì)于破壞 TNF-α 刺激細(xì)胞中的 GJIC 至關(guān)重要[32]。同樣一些研究表明，ERK 信號(hào)通路是否參與 GJIC 的調(diào)節(jié)是有爭(zhēng)議的。先前的結(jié)果表明，通過(guò)用沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯治療可以防止人內(nèi)皮細(xì)胞中血清剝奪導(dǎo)致的Cx43間隙連接和GJIC的下調(diào)，它激活ERK MAP激酶，但與PI3K/AKT、p38和JNK信號(hào)傳導(dǎo)的激活無(wú)關(guān)[33]。在血管平滑肌細(xì)胞中，ERK介導(dǎo)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的Cx43表達(dá)增加和Ser262和GJIC磷酸化，而ERK-siRNA消除了血管緊張素Ⅱ的作用[34]。相反地， ERK信號(hào)通路的激活與大鼠肝上皮細(xì)胞中過(guò)氧化氫引起的Cx43過(guò)度磷酸化和GJIC抑制有關(guān)[35-36]?？傊?，以上這些結(jié)果表明 PI3k/AKT 和 ERK 信號(hào)通路可能對(duì)不同細(xì)胞和疾病模型中的 Cx43 蛋白表達(dá)和 GJIC 功能產(chǎn)生不同的影響。

總之，這項(xiàng)研究有力表明了 RA 通過(guò)激活 AKT 和 ERK1/2 信號(hào)通路來(lái)抑制 IL-22 處理的 HaCaT 細(xì)胞中 Cx43 表達(dá)和 GJIC 的下調(diào)。 這些發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)了對(duì)維A酸在 GJIC 中作用的理解，并可能為銀屑病的治療提供新的靶點(diǎn)。