莊 微，李言明，王 磊

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)病人在全球范圍內(nèi)的人數(shù)逐年增加，T2DM越來越受到專家、學(xué)者的重視[1]。糖尿病(diabetes mellitus，DM)病人致死致殘的主要病因是糖尿病并發(fā)癥，尤其是心血管并發(fā)癥[2]，研究糖尿病心血管并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制及有效防治方法具有重要意義。有研究顯示，波動性高糖可能比持續(xù)性高糖心血管并發(fā)癥發(fā)生率更高，風(fēng)險(xiǎn)更大[3-4]。T2DM的臨床表現(xiàn)與中醫(yī)學(xué)“消渴”相似，《名醫(yī)別錄》曰：“黃連主五臟冷熱……止消渴[5-7]”。黃連素(berberine，BBR)是中藥黃連中提取的一種生物堿，多項(xiàng)研究提示黃連素對糖尿病及其并發(fā)癥具有良好的保護(hù)作用。本研究觀察人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞(HCAECs)在波動性高糖環(huán)境下的炎癥反應(yīng)，探討黃連素對波動性高糖導(dǎo)致的HCAECs炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 HCAECs細(xì)胞株購自美國ScienCell公司；RPMI1640培養(yǎng)液購自美國Hyclone公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen Life公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、人單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1) 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程公司；Taq DNA高保真聚合酶PCR Mix試劑、限制性內(nèi)切酶EcoR I購自日本Takara公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 HCAECs在含胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中接種，放置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的HCAECs分為5組：①正常血糖組(5.5 mmol/L濃度葡萄糖，NG組)；②持續(xù)性高糖組(25 mmol/L濃度葡萄糖，PHG組)；③波動性高糖組(5.5 mmol/L濃度和25 mmol/L濃度葡萄糖24 h波動1次，IHG組)；④對照組(OC組，5.5 mmol/L濃度和25 mmol/L濃度甘露醇24 h波動1次，為波動性高滲環(huán)境)；⑤波動性高糖+黃連素組(5.5 mmol/L濃度和25 mmol/L濃度葡萄糖+50 μmol/L黃連素24 h波動1次，IHG+BBR組)，培養(yǎng)7 d。

1.3 IL-1β、TNF-α、MCP-1、IL-10蛋白測定 ELISA法測定IL-1β、TNF-α、MCP-1、IL-10等炎性因子的蛋白水平，具體檢測方法見南京建成生物工程公司試劑盒說明書。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)測定IL-1β、TNF-α、MCP-1、IL-10的mRNA表達(dá) 依據(jù)qRT-PCR法收集相應(yīng)RNA樣品。將RNA樣品反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR，具體引物如下，IL-10正向引物：TGAGAACCAAGACCCAGAC，IL-10反向引物：TTCACAGGGAAGAAATCG；IL-1β正向引物：CTCGCCAGTGAAATGAT，IL-1β反向引物：AAGCCCTTGCTGTAGTG；TNF-α 正向引物：CCACCACGCTCTTCTGC，TNF-α 反向引物：GCTTGAGGGTTTGCTACAAC；MCP-1正向引物：AGAATCACCAGCAGCAAG，MCP-1反向引物：GGAATCCTGAACCCACTT。內(nèi)參基因β-actin正向引物：CCCGAGCCGTGTTTCCT，β-actin反向引物：GTCCCAGTTGGTGACGATGC。反應(yīng)條件為95 ℃、5 min預(yù)變性，95 ℃、15 s，58 ℃、30 s，72 ℃、30 s，40個循環(huán)。每個樣品檢測3次，qRT-PCR儀測定熒光信號變化。收集數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組HCAECs的IL-10表達(dá)比較 HCAECs在不同環(huán)境中培養(yǎng)7 d后，用ELISA法測定IL-10蛋白表達(dá)水平，qRT-PCR法測定IL-10 mRNA表達(dá)水平。與NG組及OC組相比，PHG組IL-10蛋白及mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)，IHG組IL-10蛋白及mRNA表達(dá)水平較PHG組降低(P<0.05)；IHG+BBR組IL-10蛋白及mRNA表達(dá)水平較IHG組升高(P<0.05)。詳見圖1、圖2。

與NG組、OC組比較，＊ P<0.05；與PHG組比較，# P<0.05；與IHG組比較，△ P<0.05。

與NG組、OC組比較，＊ P<0.05；與PHG組比較，# P<0.05；與IHG組比較，△ P<0.05。

2.2 各組HCAECs的IL-1β表達(dá)比較 與NG組和OC組比較，PHG組IL-1β蛋白和mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)。與PHG組比較，IHG組IL-1β蛋白及mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)。但I(xiàn)HG+BBR組IL-1β蛋白及mRNA表達(dá)水平較IHG組降低(P<0.05)。詳見圖3、圖4。

與NG組、OC組比較，＊ P<0.05；與PHG組比較，# P<0.05；與IHG組比較，△ P<0.05。

與NG組、OC組比較，＊ P<0.05；與PHG組比較，# P<0.05；與IHG組比較，△ P<0.05。

2.3 各組HCAECs的TNF-α表達(dá)比較 與NG組和OC組比較，PHG組TNF-α蛋白及mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，IHG組TNF-α蛋白及mRNA較PHG組升高(P<0.05)。與IHG組比較，IHG+BBR組TNF-α蛋白及mRNA表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)。詳見圖5、圖6。

與NG組、OC組比較，＊ P<0.05；與PHG組比較，# P<0.05；與IHG組比較，△ P<0.05。

與NG組、OC組比較，＊ P<0.05；與PHG組比較，# P<0.05；與IHG組比較，△ P<0.05。

2.4 各組HCAECs的MCP-1表達(dá)情況比較 PHG組MCP-1蛋白和mRNA表達(dá)較NG組和OC組升高(P<0.05)，IHG組MCP-1蛋白和mRNA表達(dá)水平較PHG組升高(P<0.05)。IHG+BBR組MCP-1蛋白和mRNA表達(dá)較IHG組明顯降低(P<0.05)。詳見圖7、圖8。

與NG組、OC組比較，＊ P<0.05；與PHG組比較，# P<0.05；與IHG組比較，△ P<0.05。

與NG組、OC組比較，＊ P<0.05；與PHG組比較，# P<0.05；與IHG組比較，△ P<0.05。

3 討 論

目前，關(guān)于波動性高糖誘導(dǎo)HCAECs炎癥反應(yīng)的報(bào)道較少，是否有藥物可有效抑制波動性高糖對HCAECs的炎癥反應(yīng)，從而減緩冠狀動脈硬化進(jìn)程的報(bào)道更鮮見。本研究觀察黃連素對波動性高糖導(dǎo)致的HCAECs炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用。既往研究大多關(guān)注持續(xù)性高糖對機(jī)體的影響[8]，然而波動性高糖可能比持續(xù)性高糖對糖尿病病人的影響更大。本研究發(fā)現(xiàn)，波動性高糖比持續(xù)性高糖更易引起HCAECs的炎癥反應(yīng)，用黃連素對波動性高糖環(huán)境中的HCAECs進(jìn)行干預(yù)，可減弱HCAECs的炎癥反應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)具有重要的臨床意義，有助于加深對糖尿病血管并發(fā)癥的認(rèn)識。

波動性高糖導(dǎo)致心血管并發(fā)癥的原因很多，可能涉及炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、內(nèi)皮功能紊亂、凝血機(jī)制激活等多個因素[9-10]。IL-1β和TNF-α是經(jīng)典的炎性因子，MCP-1是單核細(xì)胞趨化和激活因子，有文獻(xiàn)報(bào)道MCP-1在誘導(dǎo)細(xì)胞的趨化作用時(shí)，常伴隨著炎癥反應(yīng)[11-12]。本研究選擇IL-1β、TNF-α、MCP-1和IL-10作為評價(jià)炎癥反應(yīng)的標(biāo)志物，觀察到HCAECs在波動性高糖環(huán)境下比持續(xù)性高糖環(huán)境下IL-1β、TNF-α、MCP-1表達(dá)更強(qiáng)烈。IL-10是炎癥抑制因子，IL-10實(shí)驗(yàn)結(jié)果與IL-1β、TNF-α、MCP-1結(jié)果相反。與持續(xù)性高糖相比，波動性高糖環(huán)境下IL-10表達(dá)水平更低。上述結(jié)果提示波動性高糖可能比持續(xù)性高糖更易引起HCAECs的炎癥反應(yīng)。

黃連素是中藥黃連中最豐富的生物活性成分，被認(rèn)為具有多種體內(nèi)、體外藥理活性。本研究發(fā)現(xiàn)，黃連素可顯著抑制波動性高糖誘導(dǎo)的HCAECs炎性因子的生成，提示黃連素對波動性高糖導(dǎo)致的HCAECs的炎癥反應(yīng)具有較好的保護(hù)作用。上述結(jié)果為黃連素在糖尿病及其心血管并發(fā)癥防治中的作用提供了一些理論依據(jù)。

綜上所述，黃連素可有效降低波動性高糖誘導(dǎo)的HCAECs的炎癥反應(yīng)，是一種有效改善糖尿病內(nèi)皮細(xì)胞功能的藥物，可為糖尿病并發(fā)癥的防治提供重要的理論基礎(chǔ)。在未來工作中，仍需更多的動物實(shí)驗(yàn)及大規(guī)模臨床試驗(yàn)來評估黃連素對糖尿病及其并發(fā)癥的長期療效和安全性。