黃國(guó)帥 袁和興 劉浩然 劉昊鵬

蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，江蘇蘇州 215006

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤，在惡性腫瘤中位列第10位，男性膀胱癌的發(fā)病率和病死率大約是女性的4倍[1]。膀胱癌分為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌（non muscle invasive bladder cancer，NMIBC）和肌層浸潤(rùn)性膀胱癌（muscle invasive bladder cancer，MIBC），NMIBC占絕大多數(shù)，大約為75%，而MIBC約占剩下的25%[2-3]。NMIBC復(fù)發(fā)率較高，5年復(fù)發(fā)率近50%[4]，給家庭和社會(huì)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，需要開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)單、廉價(jià)、無(wú)創(chuàng)的癌癥檢測(cè)方法來(lái)診斷與監(jiān)測(cè)膀胱癌。液體活檢具有樣本易得、創(chuàng)傷小甚至無(wú)創(chuàng)等優(yōu)點(diǎn)，液體活檢的樣本通常有血液、尿液、唾液及乳液等[5]。尿液由于可進(jìn)行無(wú)創(chuàng)收集，收取尿量的限制相對(duì)較小，認(rèn)為是液體活檢的理想體液。尿液中常見(jiàn)的生物分子包括細(xì)胞DNA、游離DNA、不同種類的RNA、蛋白質(zhì)和外泌體。尿液上清液與腫瘤組織的標(biāo)本一致性強(qiáng)于尿沉渣，尿液游離DNA（urinary cellfree DNA，ucfDNA）可能是尿液沉積物更敏感的替代品[6]。ucfDNA的應(yīng)用較為廣泛，不僅可以用于膀胱癌的診斷，而且在區(qū)分不同階段的膀胱癌、監(jiān)測(cè)術(shù)后復(fù)發(fā)中起積極作用。

1 尿液游離DNA的起源與特征

ucfDNA按來(lái)源可分為三類：尿路細(xì)胞DNA、經(jīng)腎DNA以及來(lái)源泌尿系感染的細(xì)菌與病毒DNA。尿路細(xì)胞DNA是從泌尿生殖道進(jìn)入尿液的細(xì)胞產(chǎn)生的DNA[7-8]，而經(jīng)腎DNA是指循環(huán)中經(jīng)腎小球?yàn)V過(guò)進(jìn)入尿液的無(wú)細(xì)胞DNA。泌尿系統(tǒng)腫瘤可將癌變細(xì)胞釋放到尿液中?；诮?jīng)腎DNA的假設(shè)，多項(xiàng)研究證明非泌尿系統(tǒng)的疾?。ńY(jié)直腸癌、肺癌等[9-10]）可以使用尿液游離DNA進(jìn)行診斷。根據(jù)ucfDNA片段大小可進(jìn)一步分為兩類：高分子量ucfDNA和低分子量ucfDNA。高分子量ucfDNA片段長(zhǎng)于1 kbp，它們主要來(lái)自泌尿生殖道上的壞死細(xì)胞或通常存在于尿液中的淋巴細(xì)胞。低分子量ucfDNA片段通常來(lái)自循環(huán)或與尿液接觸的凋亡細(xì)胞，其片段長(zhǎng)度的主要范圍在10～400 bp[11]。正常細(xì)胞凋亡的DNA呈高度片段化，而來(lái)自壞死癌細(xì)胞的DNA能保持其完整性[12]。泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤中ucfDNA的來(lái)源可能是泌尿道細(xì)胞和經(jīng)腎cfDNA。在泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤中，ucfDNA的研究甚為廣泛，其中關(guān)于膀胱癌的研究較多，有希望成為膀胱癌的診斷、分期、預(yù)后、監(jiān)測(cè)進(jìn)展的新興標(biāo)志物。

2 尿液的收集與儲(chǔ)存

由于夜間會(huì)有更多的泌尿系統(tǒng)的細(xì)胞和細(xì)胞碎片脫落到尿液中，第一次晨尿中具有更高的DNA產(chǎn)量，絕大多數(shù)研究會(huì)收集第一次晨尿。有學(xué)者建議選擇第二次晨尿（第一次晨尿后2～3 h）進(jìn)行研究[13]，有兩方面原因：①可以標(biāo)準(zhǔn)化尿液在膀胱中停留時(shí)間；②選擇第二次晨尿可以避免高濃度和高水平的細(xì)胞溶解。由于尿液中核酸酶活性高且種類復(fù)雜，尿中ucfDNA容易降解，收集到的尿液進(jìn)行合理儲(chǔ)存也很重要。Li等[14]開(kāi)發(fā)了標(biāo)準(zhǔn)化的尿液收集管，尿液可以在環(huán)境溫度下完整保存長(zhǎng)達(dá)7 d，保持尿細(xì)胞的原始形態(tài)，確保了ucfDNA的原始比例和完整性。但尿液的收集與保存的方法仍需要繼續(xù)探究，效果較好且各實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)一的尿液收集、保存方法是為接下來(lái)的ucfDNA的提取、分析提供保障。

3 尿液游離DNA的分離、定量方法

ucfDNA的分離和定量對(duì)于研究ucfDNA在膀胱癌中的臨床價(jià)值具有至關(guān)重要的意義。ucfDNA臨床應(yīng)用的可靠性在很大程度上取決于ucfDNA分離和檢測(cè)過(guò)程中檢測(cè)方法的靈敏度和重現(xiàn)性，技術(shù)的發(fā)展主要集中在提高尿液中短DNA片段的分離和檢測(cè)靈敏度[15]，這是因?yàn)槟蛞褐衏fDNA的濃度相對(duì)較低，且ucfDNA的片段大多較短[16]。

尿液游離DNA來(lái)自尿液上清液，需要從中分離游離DNA，DNA提取方案的選擇應(yīng)盡可能的獲取充足和高質(zhì)量的DNA?？梢愿鶕?jù)要處理的尿量進(jìn)行選擇，對(duì)于＞3 ml的尿液，Quick-DNA尿液試劑盒是最佳選擇，而對(duì)于1 ml或更少的尿液，可以使用其他方法（如Qiagen的DNA Mini試劑盒）。由于ucfDNA的濃度較低，1 ml的尿液可能不足以進(jìn)行下游分析（如基因拷貝數(shù)分析和基因突變）[13]。未來(lái)的研究需要確定獲得標(biāo)準(zhǔn)化、可重復(fù)的ucfDNA提取方法。ucfDNA的定量方法通常使用分光光度法、熒光法以及擴(kuò)增法，有研究證實(shí)各個(gè)熒光法得出的結(jié)果較為類似，如研究需要進(jìn)行精確的定量，不推薦使用分光光度法[13，17]?？傊?，ucfDNA定量方法需要進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)與研究。

4 膀胱癌的臨床應(yīng)用

尿液作為診斷生物標(biāo)志物理想來(lái)源具有巨大潛力，其中ucfDNA應(yīng)用價(jià)值研究越來(lái)越受歡迎，大量研究表明ucfDNA可以用來(lái)診斷膀胱癌，大體可從兩個(gè)層面研究：①分子水平上主要從ucfDNA的濃度及完整性上來(lái)判斷患者是否患有膀胱癌；②遺傳水平上主要從DNA的表達(dá)、突變和甲基化進(jìn)行分析。ucfDNA除了可以鑒別是否為膀胱癌，還可以用于膀胱癌的早期診斷和復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)等，ucfDNA在膀胱癌中應(yīng)用值得關(guān)注。

4.1 從分子水平上研究

4.1.1 尿液中游離DNA濃度 最早的研究發(fā)現(xiàn)膀胱癌患者尿液中游離DNA的濃度比健康受試者更高[18]，是否能夠區(qū)分膀胱癌，此團(tuán)隊(duì)繼續(xù)擴(kuò)大樣本進(jìn)一步進(jìn)行研究，而研究結(jié)果表明，ucfDNA在膀胱癌患者和健康個(gè)體之間沒(méi)有顯著差異[19]，因此得出ucfDNA濃度不能夠診斷膀胱癌。而B(niǎo)risuda等[20]使用ucfDNA濃度乘以尿量的體積（即ucfDNA總量）進(jìn)行研究，不但可以區(qū)分出膀胱癌的患者，而且在腫瘤低分期與高分期之間有顯著差異。作者認(rèn)為ucfDNA總量有希望區(qū)分不同分期的膀胱癌。

由于尿液生化物質(zhì)的值廣泛受到尿肌酐（Ucr）值的影響，因此，有學(xué)者嘗試通過(guò)將ucfDNA除以Ucr濃度（ucfDNA/Ucr）來(lái)確定相對(duì)ucfDNA濃度，結(jié)果表明ucfDNA/Ucr可用作膀胱癌的潛在腫瘤標(biāo)志物，尤其是用于檢測(cè)更長(zhǎng)的DNA片段[21]。上述各項(xiàng)研究表明ucfDNA在診斷膀胱癌方面結(jié)果較為滿意，而ucfDNA濃度來(lái)診斷膀胱癌的結(jié)果不一致可能與使用各種非標(biāo)準(zhǔn)化方法有關(guān)。

4.1.2 尿液中游離DNA完整性 凋亡細(xì)胞產(chǎn)生的DNA片段較為均勻，而腫瘤細(xì)胞由于壞死，會(huì)產(chǎn)生較長(zhǎng)的DNA片段。Chang等[21]基于400 bp實(shí)時(shí)PCR的檢測(cè)方法進(jìn)行研究，結(jié)果對(duì)膀胱癌的診斷更加準(zhǔn)確、可靠，證明了ucfDNA完整性是可以用于診斷膀胱癌。有學(xué)者通過(guò)ucfDNA的長(zhǎng)度超過(guò)250 bp（c-MYC、BCAS1和HER2）的序列完整性成功診斷出膀胱癌[12]。與脫落細(xì)胞學(xué)檢查相比，其在區(qū)分低級(jí)別和早期膀胱癌中展現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)，而此三者基因序列的值相加更能準(zhǔn)確診斷出膀胱癌。因此，通過(guò)檢測(cè)尿液中游離DNA完整性來(lái)診斷膀胱腫瘤是可靠的，甚至可以用于膀胱腫瘤的早期檢測(cè)。

4.2 從遺傳水平上研究

4.2.1 尿液中游離DNA序列改變 除了分子水平外，ucfDNA在遺傳水平上具有較大的診斷價(jià)值。一直以來(lái)，檢測(cè)ucfDNA基因組改變的方法主要是基于PCR的檢測(cè)方法。一項(xiàng)新型的低頻突變液體活檢檢測(cè)技術(shù)降低了ucfDNA液體活檢的PCR偏差[22]。最近，新型分子檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展，如微滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）技術(shù)和二代測(cè)序（next-generation sequencing，NGS），極大地提高了ucfDNA檢測(cè)的靈敏度[23]。這些新開(kāi)發(fā)的檢測(cè)方法已被證明可以更深入地了解ucfDNA在癌癥中的臨床效用[24]。

在ucfDNA和尿沉淀DNA中，TERT突變等位基因頻率（mutation allele frequencies，MAF）高度相關(guān)，來(lái)自富含白細(xì)胞的尿液中的MAF在ucfDNA中高于尿沉淀DNA，這表明ucfDNA在此類尿液中具有診斷優(yōu)勢(shì)[25]。由此可見(jiàn)，尿液游離DNA受其他細(xì)胞DNA的影響較小。在膀胱癌組織中TERT啟動(dòng)子和FGFR3突變較為常見(jiàn)，同樣ucfDNA中TERT啟動(dòng)子和FGFR3突變不僅可以準(zhǔn)確地診斷膀胱癌，而且在監(jiān)測(cè)術(shù)后復(fù)發(fā)方面也具有價(jià)值。有研究利用TERT突變等位基因頻率進(jìn)行術(shù)后復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)，突變陽(yáng)性患者具有明顯的復(fù)發(fā)傾向[23]，ucfDNA在監(jiān)測(cè)膀胱癌復(fù)發(fā)方面具有積極作用。為進(jìn)一步提高膀胱癌診斷的準(zhǔn)確性，多基因聯(lián)合診斷膀胱癌也被應(yīng)用于ucfDNA上，尿液上清液的五個(gè)基因[26]（TERT、FGFR3、TP53、PIK3CA和KRAS）膀胱癌診斷模型不僅可以準(zhǔn)確識(shí)別血尿人群中膀胱癌患者，而且在無(wú)血尿患者的膀胱癌篩查中具有巨大潛力。

有學(xué)者對(duì)ucfDNA進(jìn)行低深度全基因組測(cè)序（shallow whole-genome sequencing，sWGS），評(píng)估基因拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV），利用支持向量機(jī)開(kāi)發(fā)了一個(gè)基于CNV配置文件的診斷分類器[6]，檢測(cè)尿路上皮癌準(zhǔn)確度高。值得注意的是，該分類器可用于監(jiān)測(cè)膀胱癌的復(fù)發(fā)和評(píng)估治療效果。但研究的樣本量相對(duì)較少，需要更多的案例來(lái)捕捉CNV異質(zhì)性并提高該方法的準(zhǔn)確性。Cheng等[27]通過(guò)尿液cfDNA的低深度全基因組亞硫酸氫鹽測(cè)序進(jìn)行甲基化和拷貝數(shù)分析，使用甲基化去卷積、全局低甲基化和CNVs三個(gè)獨(dú)立參數(shù)來(lái)檢測(cè)膀胱癌。甲基組學(xué)和拷貝數(shù)方法協(xié)同結(jié)合檢測(cè)膀胱癌，大大提高了檢測(cè)NMIBC的敏感度。通過(guò)高通量的測(cè)序方法獲取ucfDNA甲基化和拷貝數(shù)等參數(shù)可以檢測(cè)出早期膀胱癌，也可應(yīng)用于評(píng)估手術(shù)殘留及監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)方面。

4.2.2 尿液中游離DNA表達(dá)改變 關(guān)于ucfDNA的表達(dá)方面的研究，Xu等[28]通過(guò)ucfDNA中IQGAP3/BMP4和IQGAP3/FAM107A比率開(kāi)發(fā)判別評(píng)分指數(shù)區(qū)分膀胱癌和其他血尿疾患。此評(píng)分系統(tǒng)不僅可以將膀胱癌與其他血尿疾患相區(qū)分，而且能區(qū)別出NMIBC與MIBC。進(jìn)一步的研究得知ucfDNA中IQGAP3/BMP4的過(guò)度表達(dá)與復(fù)發(fā)和進(jìn)展有關(guān)，IQGAP3/BMP4比值是NMIBC中無(wú)復(fù)發(fā)生存率和無(wú)進(jìn)展生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[29]。

5 不足與展望

利用ucfDNA作為生物標(biāo)志物來(lái)檢測(cè)膀胱癌的方法具有較高的準(zhǔn)確度，有很好的臨床應(yīng)用前景。但仍有一些嚴(yán)重的缺點(diǎn)不能被忽視。首先，對(duì)于ucfDNA的提取、分離、定量的方法并沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)化，各個(gè)實(shí)驗(yàn)室之間產(chǎn)生的結(jié)果有所差異。新型高通量測(cè)序價(jià)格昂貴，而且需要培養(yǎng)專業(yè)的人員進(jìn)行操作。此外，ucfDNA的研究對(duì)診斷早期的膀胱癌的敏感性較低，而往往低分期、低分級(jí)占有很大比例。當(dāng)然，大多數(shù)的研究受限于樣本量不足，并且缺少外部驗(yàn)證，需要用前瞻性、大樣本的實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證。

隨著臨床對(duì)于ucfDNA的研究越來(lái)越多，相應(yīng)的不足將會(huì)得到完善。ucfDNA在膀胱癌中具有很大的臨床潛力，不僅用作膀胱癌的診斷，而且對(duì)于判斷治療效果、監(jiān)測(cè)術(shù)后復(fù)發(fā)、預(yù)測(cè)無(wú)復(fù)發(fā)生存期具有重大意義，應(yīng)用多基因的診斷模型將大大提高診斷的敏感性，高敏感度和特異度的診斷模型的應(yīng)用將減少膀胱鏡的使用，減少患者的疼痛。

6 總結(jié)

從尿液上清液中分離出的ucfDNA具有天然的無(wú)創(chuàng)優(yōu)勢(shì)，在膀胱癌的診斷與治療過(guò)程中具有很大的臨床潛力。從ucfDNA的完整性、濃度、測(cè)序和表達(dá)結(jié)果方面進(jìn)行研究，ucfDNA可以區(qū)分癌癥患者和健康者，除此之外，還可以區(qū)分不同階段的膀胱癌患者，而且在判斷治療效果、監(jiān)測(cè)術(shù)后復(fù)發(fā)、預(yù)測(cè)無(wú)復(fù)發(fā)生存期中具有重要意義。因此，ucfDNA是一種非常有前途的工具，有很大的潛力轉(zhuǎn)化為臨床實(shí)踐。