趙蔚林 綜述，李 君 審校

(湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 湘潭 411102)

肝纖維化是當(dāng)肝臟出現(xiàn)慢性損傷時(shí)機(jī)體發(fā)生的一系列修復(fù)反應(yīng)，肝內(nèi)出現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的合成與降解失衡，并大量聚集，是多類型細(xì)胞信號(hào)通路及相關(guān)細(xì)胞信號(hào)分子一起協(xié)同的結(jié)果[1]。該進(jìn)程為肝臟慢性疾病進(jìn)展為肝硬化的相同病理學(xué)變化和必經(jīng)之路。肝纖維化中發(fā)揮重要作用者為肝星狀細(xì)胞(HSC)[2]，其作為肝纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞，HSC的活化代表肝纖維化開(kāi)端的形成，受一系列細(xì)胞信息分子和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)控，研究阻斷作用于這些信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程的方法已成為肝纖維化預(yù)防、治療的主要策略?，F(xiàn)簡(jiǎn)要回顧HSC活化及增殖研究過(guò)程中目前研究主要涉及的7種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，以探索在其作用下肝纖維化的發(fā)生及治療機(jī)制，以期為后期更深入的研究提供參考。

1 HSC功能

HSC系來(lái)自間質(zhì)的一種肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞類型，位于肝竇周Disse腔中[2]，肝臟固有細(xì)胞總數(shù)中HSC約占15%，非實(shí)質(zhì)細(xì)胞中約占30%。正常情況下HSC處于靜息狀態(tài)，呈梭形、多邊形，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有多個(gè)脂滴，脂滴內(nèi)含有豐富維生素A[3]。HSC擁有細(xì)長(zhǎng)的突起，并向外蔓延，環(huán)繞在血竇內(nèi)皮細(xì)胞表面，系人體富含視黃醛衍生物的最主要部位。當(dāng)肝臟處于正常運(yùn)行狀態(tài)HSC表現(xiàn)為靜止?fàn)顟B(tài)，不表達(dá)α平滑肌肌動(dòng)蛋白[4]，并且增殖活性、合成膠原能力均較低。

2 HSC的激活

肝臟處于正常運(yùn)行中HSC表現(xiàn)為靜止?fàn)顟B(tài)。當(dāng)外界機(jī)械刺激、炎癥等不利因素發(fā)生時(shí)HSC被激活，表現(xiàn)為靜止?fàn)顟B(tài)向激活狀態(tài)轉(zhuǎn)變。肝組織切片運(yùn)用蘇木精-伊紅染色不能顯示星狀細(xì)胞，但可運(yùn)用免疫組織化學(xué)將其定位分離后能對(duì)其進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)[5]。眾多研究證實(shí)，肝纖維化發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程的主要因素為HSC從靜止?fàn)顟B(tài)向激活狀態(tài)轉(zhuǎn)變[6]。HSC處于激活狀態(tài)時(shí)一方面表現(xiàn)為通過(guò)促進(jìn)ECM的分泌和增生參與了肝纖維化進(jìn)展和肝內(nèi)組織結(jié)構(gòu)的重構(gòu)[7]；另一方面，HSC促進(jìn)細(xì)胞收縮，從而致使肝竇內(nèi)壓上升[8]。以上兩方面作用是HSC促進(jìn)肝纖維化及門靜脈高壓癥發(fā)生的重要病理學(xué)致病機(jī)制。HSC的激活牽涉因素較多，步驟也紛繁復(fù)雜，但總體分為啟動(dòng)階段和持續(xù)階段[9]。啟動(dòng)階段主要依賴肝臟的旁分泌刺激[10]，而持續(xù)階段的進(jìn)程中最密切關(guān)聯(lián)者為旁分泌及自分泌刺激。

2.1啟動(dòng)階段 當(dāng)外界環(huán)境改變時(shí)，肝臟細(xì)胞表型受外界不利因素刺激而發(fā)生改變。當(dāng)外界不利因素?fù)p傷肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞時(shí)鄰近的肝細(xì)胞、竇內(nèi)皮細(xì)胞、庫(kù)普弗細(xì)胞及血小板等通過(guò)旁分泌作用可分泌多種細(xì)胞因子[6]，如腫瘤壞死因子α、胰島素生長(zhǎng)因子-1、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)等，對(duì)HSC發(fā)揮作用[11]，促進(jìn)其向肌成纖維細(xì)胞樣表型轉(zhuǎn)化、激活，并能促使ECM合成增加、肝細(xì)胞增殖等。處于激活狀態(tài)的HSC能自分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGFβ)、內(nèi)皮素(ET)、PDGF、白細(xì)胞介素-6(IL-6)等細(xì)胞因子[12]，從而致使激活狀態(tài)持續(xù)，即使積極除去不利因素肝纖維化依然能持續(xù)進(jìn)展。

2.2持續(xù)階段 HSC被激活后功能和表型均發(fā)生改變，在上述多種因子協(xié)同下共同維持HSC的激活持續(xù)狀態(tài)，并能產(chǎn)生纖維形成，從而導(dǎo)致ECM沉積的逐步增多。在此進(jìn)程中，HSC受旁分泌及自分泌刺激的共同作用[13]。HSC能發(fā)揮促進(jìn)纖維形成的作用，其最直接的方式為HSC被激活后顯著增加基質(zhì)形成。其不但能促進(jìn)ECM合成總量的增多[14]，還能引發(fā)ECM合成類型異常。對(duì)正常肝臟組織HSC主要表現(xiàn)為合成型膠原。但有外界環(huán)境不利刺激時(shí)將被激活，從而轉(zhuǎn)為以產(chǎn)生型膠原占主要成分。有研究表明，激活的HSC可能參與肝纖維化發(fā)生后其門靜脈阻力增加，其發(fā)揮收縮功能最重要的刺激因子為ET-1，其具有收縮功能[7]，可促使竇周、硬化的肝臟收縮[15]，從而發(fā)揮阻礙門靜脈血流作用?；罨腍SC還具有自分泌TGFβ能力，也具有收縮能力，并可誘導(dǎo)HSC分泌ECM[8]。激活狀態(tài)HSC還具有促進(jìn)肝組織中大量單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)[16]，并起到增強(qiáng)炎癥效應(yīng)，進(jìn)一步推進(jìn)肝纖維化進(jìn)展，最終導(dǎo)致肝硬化的形成[17]。

3 HSC激活過(guò)程中所涉及的信號(hào)通路

3.1TGFβ-Smad信號(hào)傳導(dǎo) 有研究表明，肝細(xì)胞自身產(chǎn)生極少ECM，肝纖維化發(fā)生時(shí)激活的HSC是產(chǎn)生ECM的重要因素[18]，因此，肝纖維化進(jìn)程中最關(guān)鍵環(huán)節(jié)為HSC激活、增殖、轉(zhuǎn)化等，在該進(jìn)程中TGFβ發(fā)揮著最重要的調(diào)節(jié)作用，并且Smad為TGFβ特異性的發(fā)生底物，故TGFβ-Smad信號(hào)通路對(duì)HSC具有極其重要的作用。TGFβ在正常情況下HSC極少被表達(dá)，當(dāng)肝組織受到不利因素刺激下HSC被激活，肝組織內(nèi)TGFβ水平急劇升高。TGFβ受體(TβR)分為Ⅰ、Ⅱ型[11]。TβRⅡ通過(guò)細(xì)胞外端和配體聯(lián)結(jié)，細(xì)胞內(nèi)絲氨酸(Ser)/蘇氨酸(Thr)激酶隨之被激活，TβRⅠ的GS結(jié)構(gòu)域表達(dá)呈磷酸化，活化的TβRⅠ促使信號(hào)從細(xì)胞外向細(xì)胞內(nèi)傳遞。細(xì)胞質(zhì)蛋白Smads為傳遞過(guò)程中關(guān)鍵的信號(hào)傳導(dǎo)分子[19]。TGFβ信號(hào)通過(guò)Smads傳遞至細(xì)胞核內(nèi)，為通過(guò)受體激酶?jìng)鬟f的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑。細(xì)胞內(nèi)分子自身的構(gòu)象改變通過(guò)磷酸化R-Smad實(shí)現(xiàn)，并與Smad4相聯(lián)結(jié)構(gòu)成多聚體，隨后進(jìn)入細(xì)胞核，并與核內(nèi)特定的DNA序列，如AGAC、CAGAC相聯(lián)結(jié)，通過(guò)相聯(lián)結(jié)起到對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控作用，但上述相結(jié)合的DNA的活性程度相當(dāng)弱，發(fā)揮重要作用者為細(xì)胞核內(nèi)的輔阻遏蛋白、輔激活蛋白與相對(duì)應(yīng)的調(diào)控靶基因結(jié)合，從而轉(zhuǎn)錄，達(dá)到對(duì)TGβ1發(fā)揮生物效應(yīng)。上述過(guò)程中其輔激活蛋白為c-Jun、環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CBP)/300kD 蛋白(p300)、淋巴細(xì)胞增強(qiáng)因子1(lef-1)等。輔阻遏蛋白為SINP1、Smad核轉(zhuǎn)錄共抑制因子(Sno-N)、Ski等。Smad6、Smad7為TGFβ-Smad信號(hào)通路中最重要的負(fù)性調(diào)節(jié)因子。Smad6、Smad7調(diào)節(jié)中Ser/Thr激酶受體關(guān)聯(lián)蛋白(STRAP)能促使Smad6、Smad7與TβR競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，從而具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用。二氨基聯(lián)苯胺(Dab)是最重要的正性調(diào)節(jié)因子，能與Smad2中MH-2域結(jié)合，促使Smad2、Smad4二者緊密結(jié)合，為TGFβ信號(hào)放大作用主要的接頭蛋白。Dab還能與應(yīng)激活化蛋白激酶(JNK)通路共同協(xié)調(diào)纖維結(jié)合蛋白(FN)的分泌水平，是TGFβ發(fā)揮抗增生效應(yīng)的重要影響因素。TGFβ-Smad信號(hào)通路的主要效應(yīng)：(1)抑制肝細(xì)胞增殖，肝臟受損后能促進(jìn)Smad2激活、Smad2/4聚合物生成，對(duì)分子Sno-N、Ski表達(dá)減少，與Smad結(jié)合生成復(fù)合物，以拮抗TGFβ抗增生作用，從而有利于肝細(xì)胞修復(fù)[20]。(2)細(xì)胞凋亡，加入TGFβ的肝細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感性明顯優(yōu)于HSC及Kupffer細(xì)胞等。胱氨半酸蛋白酶(Caspases)、IL-6、構(gòu)成性轉(zhuǎn)錄因子(Sp1)等因子通過(guò)TGFβ-Smad信號(hào)通路可能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[21]。(3)與其他通路的“交流”。在胞質(zhì)與胞核交流中與Ras信號(hào)通路有聯(lián)系。絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)依附Smad分子連接區(qū)，激活Ser磷酸化，阻止其在細(xì)胞核內(nèi)沉積；與Janus激酶/信號(hào)傳導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子(JAK/STAT)也有“交流”。

3.2JAK/STAT信號(hào)通路 JAK與JAK結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合后能被自身或受體交叉酪氨酸發(fā)生磷酸化而活化，活化后的JAK能促進(jìn)其受體內(nèi)酪氨酸殘基呈現(xiàn)磷酸化，并能聯(lián)結(jié)附近的氨基酸序列構(gòu)成“停泊位點(diǎn)”，與此同時(shí)，擁有SH2(Src同源結(jié)構(gòu)域的一種)結(jié)構(gòu)域的STAT蛋白聚積至該“停泊位點(diǎn)”。隨后JAK催化聯(lián)結(jié)在STAT蛋白的受體，促使完成磷酸化，隨后活化的STAT蛋白與受體分離[21]，核定位信號(hào)通過(guò)二聚體、異二聚體的結(jié)構(gòu)暴露從而達(dá)到進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)部并于DNA內(nèi)特定的調(diào)節(jié)序列聯(lián)結(jié)，發(fā)揮調(diào)控肝細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程。有研究發(fā)現(xiàn)，一種JAK激酶可協(xié)同多種細(xì)胞因子的信號(hào)傳遞，一種信號(hào)通路細(xì)胞因子也能激活多個(gè)JAK激酶，但激活的STAT分子與細(xì)胞因子具有一定的特異性[11]。一般認(rèn)為，STAT-1、STAT-4、STAT-6分別是細(xì)胞干擾素(IFN)-α/β/γ[22]、IL-2、IL-4受體的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白，而STAT-3、STAT-5則分別是多種不同細(xì)胞因子受體的細(xì)胞內(nèi)共同的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白[12]。有研究表明，JAK/STAT通路能協(xié)同多種信號(hào)傳導(dǎo)，其效應(yīng)的特異性決定于相對(duì)應(yīng)的受體[13]。STAT中SH2結(jié)構(gòu)域、STAT分子中特定氨基酸序列、細(xì)胞因子受體共同決定STAT對(duì)細(xì)胞因子的特異性選擇[14]。JAK/STAT信號(hào)通路通過(guò)STAT在細(xì)胞內(nèi)異常表達(dá)，促進(jìn)肝細(xì)胞之間黏附分子-1的表達(dá)[15]，導(dǎo)致肝內(nèi)多種炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，誘發(fā)大量PDGF分泌[23]，促進(jìn)HSC增殖及膠原組織的合成及降解下降，肝內(nèi)出現(xiàn)大量ECM聚積，從而促使肝纖維化的形成。

3.3PDGF信號(hào)傳導(dǎo) 2條多肽鏈共同構(gòu)成PDGF，A鏈(PDGF A)相對(duì)分子質(zhì)量18×103，B鏈(PDGF B)相對(duì)分子質(zhì)量16×103。擁有3個(gè)類型二聚體，分別為PDGFAA、PDGFBB及PDGFAB，3個(gè)類型之間分別由3對(duì)二硫鍵聯(lián)結(jié)。多個(gè)類型信號(hào)傳導(dǎo)因子將PDGF受體(PDGFR)作為其底物與位于激活狀態(tài)的PDGFR磷酸化位點(diǎn)相互結(jié)合[24]。該內(nèi)底物均含有1個(gè)相似結(jié)構(gòu)的SH-2，PDGFR與其結(jié)合，并誘發(fā)活化，可激發(fā)不同下游蛋白級(jí)聯(lián)磷酸化信號(hào)傳導(dǎo)通路。主要的下游信號(hào)通路為Ras/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、磷酸肌醇-3激酶(PI3K)、JAK/STAT、磷脂酶Cγ(PLCγ)等。有研究證實(shí)，PDGF還能改變肝細(xì)胞內(nèi)pH值、鈣離子水平變化程度，以達(dá)到傳遞信號(hào)的目的[16]。有研究表明，PDGF刺激HSC中ERK通路的激活，從而誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)c-fos水平增加[18]。己酮可可堿為磷酸二酯酶抑制劑，使用含有己酮可可堿的培養(yǎng)基培養(yǎng)HSC，能證實(shí)其具有降低c-fos水平，并對(duì)HSC增殖具有抑制作用[20]。

3.4Ras/ERK信號(hào)通路 Ras是相對(duì)分子質(zhì)量21×103的小G蛋白復(fù)合體，Ras與三磷酸鳥(niǎo)苷(GTP)結(jié)合呈活性狀態(tài)，與二磷酸鳥(niǎo)苷(GDP)結(jié)合表現(xiàn)失活狀態(tài)[20]。肝細(xì)胞內(nèi)Ras與細(xì)胞膜下生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白(Grb2)、MAPKK激酶等多種蛋白共同構(gòu)成復(fù)合體。Grb2由1個(gè)SH2結(jié)構(gòu)域、3個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域共同組成，SH3結(jié)構(gòu)域與鳥(niǎo)苷酸交換因子(SOS)相互結(jié)合，并且PDGFR、Grb2、SOS、Ras在肝細(xì)胞膜下與Grb2共同構(gòu)成復(fù)合體[24]，在SOS作用下Ras與GDP分離，并與GTP結(jié)合，從而致其處于激活狀態(tài)。Ras激活后能誘導(dǎo)ERK磷酸化，使Ser/Thr蛋白激酶-1、絲裂原活化蛋白激酶(MEK)、ERK一系列被磷酸化后活化。原癌基因Ser/Thr蛋白激酶-1屬于一種GTP酶的活化蛋白，能在Ras活化下激活Ser/Thr激酶，從而激活MEK，促使MAPK1/2磷酸化而轉(zhuǎn)為活化狀態(tài)，其能轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子-Ets-like protein-1(Elk-1)、SAP等，并轉(zhuǎn)錄c-fos基因；能誘導(dǎo)HSC從G1期進(jìn)入S期，促進(jìn)HSC增殖，從而導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生。

3.5PI3K信號(hào)通路 是由PDGF激活的另一條信號(hào)通路。該激酶家族分型較多，與PDGF信號(hào)傳導(dǎo)關(guān)聯(lián)的屬于PI3KA型，其由1個(gè)調(diào)節(jié)亞基P85和1個(gè)催化亞基P110組成。P110不僅能使PI磷酸化，還能誘導(dǎo)P85磷酸化。P85擁有3個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別為SH2、SH2和SH3。SH2能結(jié)合PDGFR中酪氨酸殘基等，再與P110連結(jié)[25]，激活PI3K信號(hào)通道。其處于激活狀態(tài)后除能誘發(fā)自身磷酸化外，最重要的效應(yīng)為產(chǎn)生PI作為第二信使，并促進(jìn)信號(hào)向下游傳導(dǎo)，發(fā)揮促使HSC增殖、遷移等功效。有研究表明，在體外培養(yǎng)的HSC中運(yùn)用特異性PI3K阻斷劑——Wortmannin使HSC停滯于G0/G1期，能顯著抑制HSC增殖。有研究揭示，在人HSC中PDGF的促有絲分裂及趨化作用必須有激活狀態(tài)的PI3K參與[21]。

3.6PI3K/蛋白激酶B(Akt)信號(hào)通路 胰島素生長(zhǎng)因子、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、PDGF等刺激因子在與HSC細(xì)胞膜相關(guān)受體結(jié)合后最開(kāi)始促使PI3K活化，隨之PI3K被磷酸化，PIP2轉(zhuǎn)變?yōu)镻IP3，并誘導(dǎo)PIP3繼續(xù)磷酸化Akt，Akt激活后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)控P53及細(xì)胞周期蛋白D1等相關(guān)聯(lián)基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，誘導(dǎo)HSC細(xì)胞分裂，并能減弱肝細(xì)胞凋亡。有研究將HSC、Huh7細(xì)胞混合培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，Huh7細(xì)胞促使PI3K/Akt信號(hào)通路激活，從而激活HSC活化[16]。而有研究發(fā)現(xiàn)，PI3K抑制劑——PI103具有阻斷其信號(hào)傳遞，并明顯抑制活化的HSC[23]。

3.7Rho/Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK)信號(hào)通路 Rho-GTP酶、ROCK、肌球蛋白磷酸酶是Rho/ROCK信號(hào)通路中最重要的組成成分[24]。Rho-GTP酶屬于Ras超家族，目前已知有Rho A～G、Rac等多種類型。ROCK為β羥基丙氨酸/β-羥基-α-氨基丁酸蛋白激酶，為Rho下游中重要的關(guān)鍵效應(yīng)分子[25]，能傳遞Rho信號(hào)，誘導(dǎo)HSC內(nèi)多種氨基酸位點(diǎn)磷酸化，并能促進(jìn)下游多反應(yīng)的磷酸化/脫磷酸化，能發(fā)揮多種類型的細(xì)胞效應(yīng)。有研究表明，加入Rho/ROCK信號(hào)通路阻斷劑，使其下游磷酸化，發(fā)現(xiàn)對(duì)激活狀態(tài)的HSC具有抑制作用[26]。

4 小 結(jié)

肝纖維化是一個(gè)由多種細(xì)胞、介質(zhì)和信號(hào)通路控制的復(fù)雜病理過(guò)程，HSC在肝纖維化的發(fā)展中具有核心作用。在慢性肝病中HSC經(jīng)歷顯著的表型激活并獲得纖維化特性，在各種觸發(fā)因素的影響下進(jìn)入細(xì)胞周期。HSC激活的“起始”階段與“永久”階段重疊并持續(xù)，其特征是明顯的炎癥和纖維化反應(yīng)。在這方面細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)障礙、表觀遺傳變化和細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)可能是治療的目標(biāo)，其目標(biāo)是使HSC失活。潛在的抗纖維化治療可能側(cè)重于通過(guò)細(xì)胞老化、凋亡和(或)免疫細(xì)胞清除誘導(dǎo)HSC恢復(fù)至非活性狀態(tài)，并作為潛在的抗纖維化治療方法。因此，對(duì)這些病理生理機(jī)制的了解，可為預(yù)防肝纖維化發(fā)展和進(jìn)展的藥物鋪平道路。